Name: 从原生多能诱导干细胞中生成胚胎体表面的人原始生殖细胞样细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: 了解从诱导多能干细胞生成人原始生殖细胞样细胞的方法，该13天方案用于研究生殖系毒理学和基因组完整性，有助于减少治疗药物的生殖毒性。

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我们感谢 Shiomi Yawata 和 Chie Owa 在初期研究中提供的技术协助。本研究由美国国家环境卫生科学研究所/国立卫生研究院（NIEHS/NIH）资助，资助编号为 R01 ES023316 和 R21ES024861（授予 TS），以及由飞行乘务员医学研究所（FAMRI）资助（授予 JHH）。

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<li>Miyoshi, N., Stel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erasure+of+DNA+methylation%2C+genomic+imprints%2C+and+epimutations+in+a+primordial+germ-cell+model+derived+from+mouse+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Erasure of DNA methylation, genomic imprints, and epimutations in a primordial germ-cell model derived from mouse pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9545-9550 (2016).</li>
<li>Shirane, K., Kurimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Landscape+and+Regulatory+Principles+of+DNA+Methylation+Reprogramming+for+Germ+Cell+Specification+by+Mouse+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Global Landscape and Regulatory Principles of DNA Methylation Reprogramming for Germ Cell Specification by Mouse Pluripotent Stem Cells.</a> Developmental Cell. 39 (1), 87-103 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

使用本方案高效生成hPGCLCs已在三株具有正常二倍体核型的人类iPSC独立克隆中得到验证10。这些iPSC克隆均来源于同一批人类新生儿真皮成纤维细胞培养物10。作者将根据研究人员的申请，在适当的材料转移协议和冷冻活体人类细胞运输安排下提供这些细胞。目前尚不清楚使用本方案或其它实验室报道的方案时，是否必须具备正常核型才能实现高效的hPGCLC生成。
最近的研究表明，使用京都大学斋藤组所描述的方案8，从人诱导多能干细胞（hiPSCs）11或胚胎干细胞（ESCs）14生成人原始生殖细胞样细胞（hPGCLCs）依赖于EOMESODERMIN的表达，EOMESODERMIN是一种T-box转录因子，对SOX17的诱导至关重要。SOX17似乎在人类多能干细胞的生殖系分化过程中发挥主调控转录因子的作用6。EOMESODERMIN由EOMES基因编码，在hPGCLC诱导条件下，利用CRISPR/Cas9技术敲除EOMES基因几乎完全阻断了SOX17的诱导11，其他基因的表达模式也与SOX17基因敲除细胞一致。在EOMES基因敲除细胞中，于hPGCLC诱导培养期间通过可诱导载体过表达EOMESODERMIN，可有效恢复hPGCLC的高效生成以及包括SOX17在内的生殖系相关基因的表达。相反，诱导性过表达SOX17同样能够恢复PGCLC的高效生成，但并不诱导EOMES的表达。因此，EOMESODERMIN是SOX17的关键上游诱导因子，这似乎是EOMESODERMIN在人多能干细胞诱导生成hPGCLC过程中的最重要功能。我们的方案可在hiPSCs中诱导SOX17表达10，但其是否依赖于EOMESODERMIN的诱导仍有待确定。
本方案将维持在 mTeSR1 培养基中培养的始发态多能性人诱导多能干细胞（iPSCs）在 4i 重编程培养基6中转化为 ERK 非依赖性的 naive 多能性状态，持续 96 小时；该 4i 培养基是一种改良的 naive 人干细胞培养基（NHSM）5。我们曾尝试使用相同的 hPSC 克隆，但在转入 4i 重编程培养基前，将其维持在其他市售的人 iPSC 培养基中，结果在生成 hPGCLCs 时，其产量不同程度地降低。尽管长期适应这些其他培养基是否能改善 hPGCLC 的生成仍有待后续研究确定，但该观察结果提示：在进入 4i 重编程之前，人 iPSCs 所处的始发态多能性状态的精确特性，会显著影响 4i 培养基中拟胚体（EB）的形成，以及在 hPGCLC 诱导培养基中 EB 向 hPGCLC 的分化效率。
按照我们的方案，由hiPSCs高效且高度可重复地生成hPGCLCs，部分原因在于使用了微孔板，该技术能够高效地批量产生大量大小均一的拟胚体（EB）（每批约8,000个EB，每个EB含3,000个hiPSCs）。与使用常规U型底细胞培养孔的方法相比，本方案单次实验批次所能生成的EB数量显著更多。大量大小均一且表面均匀分布hPGCLCs的EB，可能为高通量化学筛选提供独特机会，用于鉴定影响原始生殖细胞（PGC）特化过程或其生物学特性（如表观遗传重编程）的小分子激活剂或抑制剂。这类EB还可用于大量生殖系毒性物质的毒理学评估，包括环境污染物以及临床处方药物（如化疗药物）等。
使用本方案稳健且可重复地生成人原始生殖细胞样细胞（hPGCLCs）的关键因素包括：（i）使用在细胞外基质蛋白上以 mTeSR1 培养基维持的健康人诱导性多能干细胞（hiPSCs）；（ii）接种精确数量的细胞，并严格遵循培养基更换和传代的时间安排；（iii）选择性能良好的人重组 BMP4 试剂批次；以及（iv）在摇床培养过程中尽量减少胚胎体（EBs）的物理损伤。根据我们的经验，最佳批次的 BMP4 试剂在 100 ng/mL 浓度下效果最佳，而其他批次的 BMP4 试剂则需要 2 倍或更高的剂量。另一方面，使用最佳批次的 BMP4 时，提高 BMP4 浓度（例如，200 ng/mL）反而会降低 hPGCLCs 的产量。我们建议测试来自多个供应商的不同批次的人重组 BMP4 试剂在支持 hPGCLC 生成方面的性能，并储备足量表现最佳的批次。
本研究的人类原始生殖细胞样细胞（hPGCLC）实验方案有一个独特之处：hPGCLC定位于胚状体（EB）最外层表面10（图8），而其他实验方案生成的hPGCLC通常位于细胞聚集体的内部6,8。胚状体往往形成多个不同的层次结构，包括表面层、外层壳、内层壳和核心区域；由于营养物质、氧气以及培养基通过扩散提供的促存活生长因子供应有限，中心核心区域常出现坏死现象20。将hPGCLC定位于EB表面，可避免因扩散受限而影响细胞与中心区域之间的物质交换，从而有利于在药理学或毒理学研究中，对hPGCLC进行直接、时间可控且剂量可控的药物或毒性物质暴露处理。
小鼠PGCLC表现出强烈的全基因组DNA去甲基化，至少部分涉及印记控制区7,19,20，而hPGCLC中的全基因组gDNA去甲基化程度似乎弱于小鼠PGCLC或PGC6,7。转录组谱型表明，hPGCLC可能比小鼠PGCLC更类似于胚胎PGC的较早阶段10。已有报道指出，在hPGCLC诱导条件下延长EB培养时间可导致gDNA去甲基化程度增加7；然而，hPGCLC在EB中或作为分离细胞进行更长时间的培养是否能够达到更高级别的生殖系分化阶段，仍有待未来研究进一步确定。

原始生殖细胞（PGCs）是两性中所有生殖系细胞的共同前体。关于哺乳动物胚胎中 PGC 发育的大部分知识均来自对实验小鼠的研究1,2。在小鼠胚胎发育第 6.0–6.5 天时，约有 6 个或相近数量的 PGC 前体细胞位于上胚层中，并在邻近细胞分泌的骨形态发生蛋白 Bmp2 和 Bmp4 的作用下，诱导产生约 40 个 PGC 创始群体。迄今为止在人类胚胎中发现的最早的 PGC 位于妊娠第三周左右的卵黄囊内胚层壁上3。由于该位置与小鼠胚胎中迁移期 PGC 所处的位置相同，因此所观察到的人类 PGC 很可能正处于迁移路径上，而非创始群体。然而，目前尚缺乏对人类胚胎中更早期阶段的 PGC 或 PGC 前体细胞的追踪研究。
由于技术和伦理方面的障碍，获取人类胚胎原始生殖细胞（PGCs）十分困难。为克服这些难题，近年来已利用人类多能干细胞（PSCs）建立了类似原始生殖细胞的体外培养模型。多能性是指细胞分化为生殖系以及三个胚胎胚层的能力4。在包被有细胞外基质蛋白的培养皿中，使用mTeSR1培养基（一种即用型商业化培养基，专为维持人类PSCs处于 primed 多能性状态而设计）培养的人类PSCs具有primed态多能性4；而2013年Jacob Hanna实验室表明，通过将primed多能性细胞暴露于含有多种蛋白激酶抑制剂（包括ERK1/2、GSK3、JNK、ROCK、PKC和p38 MAPK）以及生长因子LIF、TGF、bFGF的naïve人类干细胞培养基（NHSM）中，可将其转化为naïve多能性状态5。基于处于naïve多能性状态的人类PSCs，2015年Hanna与Azim Surani领导的研究团队首次成功实现了从PSCs高效生成人类原始生殖细胞样细胞（hPGCLCs）6。此后，包括我们实验室在内的多个研究团队相继报道了采用略有差异的实验方案由PSCs诱导生成hPGCLCs的方法7,8,9,10。我们的研究提供了证据表明，使用不同实验方案（详见我们先前发表的研究中表S1的总结10）所获得的hPGCLCs在转录组水平上彼此高度相似10。现有证据支持hPGCLCs与早期人类胚胎PGCs具有相似性，尤其是在全基因组表观遗传擦除7和/或趋化迁移发生之前阶段10。
对小鼠胚胎原始生殖细胞（PGCs）、小鼠PGCLCs以及人类PGCLCs的研究（但对人类PGCs的获取极为有限）表明，小鼠与人类在PGC特化过程中的分子机制存在显著差异1,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17。例如，Prdm14在小鼠胚胎PGC特化过程中发挥关键作用，但在人类PGC特化中的作用似乎较为有限1,15。相反，EOMESODERMIN诱导SOX17的表达对人类PGC特化至关重要6,11,14，而这些转录因子在小鼠PGC特化过程中似乎并非必需15。这些利用hPGCLCs所取得的初步研究成果，强有力地支持了该体外培养细胞模型作为人类胚胎PGCs替代体系的重要价值。
近期发表的研究表明，包括我们实验室在内，通过对基因组DNA拷贝数进行深度测序分析，发现将多能干细胞（PSCs）长期维持在初始态多能性（naïve pluripotency）状态会显著增加染色体不稳定性和结构异常的风险。该现象在小鼠18和人类19的PSCs中均有观察到。Hanna/Surani团队最初报道的人类原始生殖细胞样细胞（hPGCLC）诱导方案，是针对已在4i初始态多能性培养基中维持至少2周的人类PSCs所开发的6。为了保持人类PSCs及hPGCLCs正常的二倍体核型，我们开发了一种改良方案，将人类PSCs在4i培养基中的暴露时间缩短至仅72小时10，本文即介绍该优化后的流程。人类诱导多能干细胞（hiPSCs）通常维持在 primed 多能性状态。在拟胚体（EB）形成前，细胞先在4i初始态重编程培养基（一种改良的NHSM培养基）中孵育48小时。随后将细胞解离并接种至微孔板中，在4i培养基中继续培养24小时以形成EB。EB随后转移至含高浓度重组人BMP4的hPGCLC诱导培养基中，在摇动条件下进行无贴壁培养，最长持续8天，以获得最大产量的hPGCLCs。经过8天的EB培养后，可通过FACS从解离的EB细胞中分离出CD38+的hPGCLCs，其得率最高可达约40%，并可获得适合FACS分选的单细胞悬液。与此前已发表的其他方法7,8,9（包括我们改进前的原始方案6）通常在自发形成的细胞聚集体中产生hPGCLCs且无特定定位不同，本方案所产生的hPGCLCs主要出现在拟胚体（EBs）的表面。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;启动态多能性hiPSC培养&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>按照生产商推荐体积（约200 &amp;mu;L）分装Matrigel。使用预冷离心管。于-80 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21041-025</td><td>4 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>将5X补充剂加入基础培养基中进行重悬。重悬后的培养基可在4 &amp;deg;C保存&lt;br/&gt;不超过4周，不影响细胞培养性能</td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Axon</td><td>1683</td><td>将5 mg Y27632（分子量320.26）溶于312.2 &amp;mu;L水中，配制50 mM Y27632储备液。经0.22 &amp;mu;m滤器除菌。分装20 &amp;mu;L/管×15管，-20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07930</td><td>4 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative cell technologies</td><td>AT104-500</td><td>细胞解离酶；分装40 mL/管×12管，-20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;4i hiPSC培养&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1286101</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut 血清替代物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td>分装40 mL/管×12管，-20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100x）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸溶液（100x）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>牛胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1882-100MG</td><td>向10 mL水中加入0.1 mL冰醋酸。经0.22 μm滤器除菌。将100 mg胰岛素冻干粉溶于10 mL预冷的酸化水中，配制10 mg/mL储备液。分装650 &amp;mu;L/管×15管，-80 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>人LIF</td><td>PeproTech</td><td>300-05</td><td>将250 &amp;mu;g人LIF溶于250 &amp;mu;L水中。加入750 &amp;mu;L含0.1%牛血清白蛋白的PBS(-)溶液，配制250 &amp;mu;g/mL人LIF储备液。该产品的比活性为&gt;10,000 单位/&amp;mu;g。分装40 μL/管×25管，-80 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>人FGF2</td><td>R&amp;D Systems</td><td>4114-TC</td><td>将1 mg人FGF2溶于5 mL PBS(-)中，配制200 &amp;mu;g/mL人FGF2储备液。分装100 &amp;mu;L/管×50管，-80 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>人TGF-&amp;beta;1</td><td>PeproTech</td><td>100-21</td><td>将50 &amp;mu;g溶于50 &amp;mu;L 10 mM柠檬酸（pH 3.0）中。加入150 &amp;mu;L含0.1%牛血清白蛋白的PBS(-)溶液，配制250 &amp;mu;g/mL人TGF-&amp;beta;1储备液。分装4 &amp;mu;L/管×50管，-80 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>4i基础培养基</td><td></td><td></td><td>混合以下试剂配制4i基础培养基：&lt;br/&gt; 500 mL KnockOut DMEM&lt;br/&gt; 100 mL KnockOut血清替代物&lt;br/&gt; 6 mL青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100x）&lt;br/&gt; 6 mL MEM非必需氨基酸溶液（100x）&lt;br/&gt; 650 &amp;micro;L 10 mg/mL牛胰岛素&lt;br/&gt; 40 &amp;micro;L 250 &amp;micro;g/mL人LIF&lt;br/&gt; 20 &amp;micro;L 200 &amp;micro;g/mL人FGF2&lt;br/&gt; 4 &amp;micro;L 250 &amp;micro;g/mL人TGF-&amp;beta;1&lt;br/&gt; 分装40 mL/管，-80 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td>将25 mg CHIR99021（分子量465.34）溶于1791 &amp;mu;L DMSO中，配制30 mM CHIR99021储备液。分装50 &amp;mu;L/管×35管，-20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Axon</td><td>1408</td><td>将5 mg PD0325901（分子量482.19）溶于1037 &amp;mu;L DMSO中，配制10 mM PD0325901储备液。分装50 &amp;mu;L/管×20管，-20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>BIRB796</td><td>Axon</td><td>1358</td><td>将10 mg BIRB796（分子量527.66）溶于948 &amp;mu;L DMSO中，配制20 mM BIRB796储备液。分装50 &amp;mu;L/管×18管，-20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>SP600125</td><td>Tocris</td><td>1496</td><td>将10 mg SP600125（分子量220.23）溶于908 &amp;mu;L DMSO中，配制50 mM SP600125储备液。分装50 &amp;mu;L/管×18管，-20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>AggreWell400</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>27845</td><td>微孔板</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td>将5 g Pluronic F-127溶于100 mL水中，配制5%（w/v）Pluronic F127储备液。经0.22 μm滤器除菌。分装50 mL/管×2管，室温保存</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;hPGCLC培养&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasgow&amp;rsquo;s MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11710035</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠（100 mM）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（100x）</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>hPGCLC基础培养基</td><td></td><td></td><td>混合以下试剂配制hPGCLC基础培养基：&lt;br/&gt; 500 mL Glasgow&amp;rsquo;s MEM&lt;br/&gt; 75 mL KnockOut血清替代物&lt;br/&gt; 6 mL MEM非必需氨基酸溶液（100x）&lt;br/&gt; 6 mL 100 mM丙酮酸钠&lt;br/&gt; 6 mL青霉素-链霉素（100x）&lt;br/&gt; 分装40 mL/管，-20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>将350 &amp;mu;L 2-巯基乙醇（14.3 M）稀释于9.65 mL PBS(-)中，配制500 mM 2-巯基乙醇储备液。4 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>L-抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td>将400 mg L-抗坏血酸溶于20 mL水中，配制20 mg/mL L-抗坏血酸储备液。经0.22 μm滤器除菌。分装500 &amp;mu;L/管×40管，-20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>重组人BMP4</td><td>R&amp;D Systems</td><td>314-BP</td><td>将1 mg重组人BMP4溶于10 mL 4 mM盐酸水溶液中，配制100 &amp;mu;g/mL重组人BMP4储备液。分装250 &amp;mu;L/管×40管，-80 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>人SCF</td><td>PeproTech</td><td>300-07</td><td>将250 &amp;mu;g人SCF溶于500 &amp;mu;L含0.1%牛血清白蛋白的PBS(-)溶液中，配制500 &amp;mu;g/mL人SCF储备液。分装35 &amp;mu;L/管×14管，-80 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>人EGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td>将1 mg人EGF溶于1 mL含0.1%牛血清白蛋白的PBS(-)溶液中，配制1 mg/mL人EGF储备液。分装100 &amp;mu;L/管×10管。将100 &amp;mu;L 1 mg/mL人EGF储备液与300 &amp;mu;L含0.1%牛血清白蛋白的PBS(-)溶液混合，配制250 &amp;mu;g/mL人EGF储备液。分装20 &amp;mu;L/管×20管。-80 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>孔径 = 40 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>50 mL聚丙烯圆锥形离心管</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>低吸附培养板</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Vari-Mix平台摇床</td><td>Thermofisher</td><td>M79735Q</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;免疫组织化学染色&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BLOXALL封闭液</td><td>VECTOR</td><td>SP-6000</td><td></td></tr><tr><td>正常马血清&lt;br/&gt; ImmPRESS抗山羊IgG试剂</td><td>VECTOR</td><td>MP-7405</td><td></td></tr><tr><td>OCT-3/4抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-8629</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB</td><td>VECTOR</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Thermofisher</td><td>SP15-100</td><td>封片剂</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;分离hPGCLC&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>类胚体解离试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-348</td><td></td></tr><tr><td>APC标记抗CD38抗体</td><td>abcam</td><td>ab134399</td><td></td></tr></tbody></table>

从始发多能性诱导多能干细胞衍生的类胚体表面产生人类原始生殖细胞样细胞

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

原始生殖细胞（PGCs）是所有生殖系细胞的共同前体。在小鼠胚胎中，约40个PGCs由多能性上胚层细胞在包括骨形态发生蛋白4（Bmp4）在内的多种细胞因子有序作用下被诱导产生。在人类胚胎中，最早的PGCs于卵黄囊内胚层壁被发现，时间约为第3周末rd 妊娠周数，但关于人类原始生殖细胞（PGC）的特化过程及其早期发育机制仍知之甚少。为了克服研究人类胚胎PGC所面临的技术与伦理障碍，近年来已利用多能干细胞建立了替代性的体外细胞培养模型。本文介绍一种为期13天的高效方案，用于大量生成人类原始生殖细胞样细胞（hPGCLC）。处于启动态多能性状态的人诱导性多能干细胞（hiPSCs）在4i naïve重编程培养基中孵育48小时后，被解离为单细胞并接种至微孔中。hiPSCs在naïve多能性状态下长期维持会导致显著的染色体异常，应避免此种情况。接种于微孔中的hiPSCs在4i培养基中继续培养24小时以形成类胚体（EBs），随后将EBs转移至低黏附性塑料器皿中，在含高浓度重组人BMP4的hPGCLC诱导培养基中，于摇动条件下培养。EBs在持续摇动、非黏附的条件下进一步培养最多8天，以获得最大产量的hPGCLCs。通过免疫组织化学检测，hPGCLCs在几乎所有EBs的表面均表现为强表达OCT4的细胞，易于识别。当EBs经酶解解离并进行FACS富集时，hPGCLCs可被收集为CD38+细胞，收获率可达40–45%。

此处使用的微孔板为24孔格式，其中8个孔装有微孔板片，每个微孔板片可支持形成多达1,200个类胚体（EB）。由约2,400万个4i初始态多能性细胞起始，该微孔板通常可生成约8,000个EB，每个EB包含约3,000个细胞。在持续摇动的非黏附培养过程中，由于类胚体会自发解体，完整EB的数量逐渐减少，至实验方案第13天时约有3,000个EB存活。这些存活的EB中，大多数在其表面具有50–200个人原始生殖细胞样细胞（hPGCLC）（通过EB连续切片中OCT4+细胞的免疫组织化学检测估算；见图8），总计可获得约100,000个OCT4+ hPGCLC。将EB酶解为单细胞的过程效率相对较低，导致经FACS富集的CD38+ hPGCLC回收数量为9,000–47,000个细胞。在我们的实验中，六次独立但连续的实验批次平均获得14,038 ± 5,731个细胞（均值 ± 标准误）。由于CD38阴性的EB细胞仅微弱表达OCT4 mRNA（qPCR检测）或蛋白（免疫组织化学检测），甚至完全不表达，因此所有强表达OCT4蛋白的EB细胞实际上等同于CD38+ hPGCLC的全部群体。
本方案的关键参数包括细胞密度。当将 2.0 × 105 个人类iPSCs接种于包被有细胞外基质蛋白的6孔细胞培养板（每孔生长面积为9.60 cm2）中，并加入2 mL添加Y27632的培养基（2.2.9）时，接种后24小时细胞融合度可达约20–30%（图1）。随后在不含Y27632的mTeSR1培养基中继续培养24小时，细胞发生聚集并形成克隆，占据约30%的生长面积（图2）。接着将细胞转入4i重编程培养基（2.3.2）中培养。在4i培养基中培养24小时后，细胞达到融合状态（图3）。再继续在4i培养基中培养24小时，细胞变得紧密堆积（图4）。培养基更换的精确时间（每24小时±4小时）以及细胞密度对于EBs和hPGCLCs的成功形成至关重要。
在4i培养基中培养48小时后，将细胞解离并接种至微孔板中，该微孔板的孔径为400 µm（2.4）。尽管该商用微孔板已由制造商涂覆为低黏附表面，但仍建议使用洗涤剂重新涂覆（2.4.3），以降低细胞非特异性黏附的风险。使用800 µm微孔时，人原始生殖细胞样细胞（hPGCLC）的产量降低，表明胚胎体（EB）的大小对定向分化具有重要意义。在4i培养基中接种的细胞将在24–30小时内于微孔中形成EB，可通过标准倒置相差显微镜观察（图5）。EB的圆形轮廓在培养24小时及之后变得清晰可见。不建议在接种后较早时间（例如，16小时）收获EB，此时其圆形轮廓尚未清晰形成，此类EB极易受到机械损伤并容易解体。需要注意的是，大量未分化的hiPSCs不会被纳入EB中，此现象属正常。这些未被纳入的细胞将在EB于低黏附表面开始摇床培养前被洗去（2.5.2）。另需注意，在本实验方案中，EB是在4i维持多能性培养基中形成，而非在hPGCLC诱导培养基中。在接触hPGCLC诱导培养基之前，于4i培养基中预先形成结构致密的EB，对于hPGCLC在EB表面的分布至关重要。
在hPGCLC培养基中，于摇动且非黏附的培养条件下维持的拟胚体（EBs）将保持其球形形态，不会发生聚集或融合（图6 和 图7）。摇动强度过弱会导致EB聚集和融合，而过强则会破坏EB结构。人类原始生殖细胞样细胞（hPGCLCs）在hPGCLC培养基中培养仅5天后即可在EB表面出现，表现为表达OCT4的细胞，其数量持续增加至培养第8天（图8）。EB进一步孵育可能导致EB解体及hPGCLCs丢失。在hPGCLC培养基中培养5–8天后，可通过FACS将EB经酶消化解离后的细胞中CD38+细胞富集，从而获得hPGCLCs（图9）。
<img alt="显微镜下的细胞培养；肝组织细胞；组织学显微分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：接种后24小时在添加Y27632的培养基中培养的人iPSC细胞。 细胞密度约为20-30%融合度。在ROCK抑制剂Y27632存在下，细胞倾向于充分伸展，呈现长而棘状的突起。比例尺 = 100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜下的细胞培养、细胞生长、显微图像、研究、生物学分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：人iPSC细胞接种后48小时的培养情况。 细胞聚集形成克隆，占据约30%的生长区域。比例尺 = 100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞培养显微镜图像；单层细胞中细胞生长和形态的研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：人iPSC细胞在4i重编程培养基中培养24小时。 细胞达到汇合状态。比例尺 = 100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于癌症研究与分析的静态白血病细胞培养显微镜图像" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：人诱导多能干细胞（iPSC）在 4i 重编程培养基中培养 48 小时。 细胞融合度高，排列紧密。比例尺 = 100 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="线虫卵模式的显微镜图像；胚胎发育，细胞结构可视化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：在4i重编程培养基中孵育24小时后，人iPSC在微孔中形成的拟胚体（EB）。 接种后24–30小时，EB的圆形轮廓开始可见。在相差显微镜下确认轮廓后，EB即可转移至摇床培养条件。比例尺 = 500 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="细胞簇的显微图像；微观排列；细胞生物学；包含比例尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：人iPSC EB在hPGCLC培养基中孵育24小时。 EB基本保持其球形形态。比例尺 = 500 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜下的细胞培养簇；细胞生长研究；生物医学研究图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 7"> 
图 7：人类诱导性多能干细胞（iPSC）EB 在 hPGCLC 培养基中培养 192 小时。 与培养 24 小时相比，EB 体积增大，但仍基本保持球形，无明显聚集或融合现象。比例尺 = 500 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="组织学细胞显微照片，染色的组织切片显示用于生物学分析的细胞形态。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 8"> 
图8：在hPGCLC培养基中孵育192小时后，表达OCT4的人类PGCLC定位于hiPSC类胚体（EB）表面。 将EB包埋于细胞外基质蛋白中，并进行福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片的OCT4免疫组化染色（DAB底物）。比例尺 = 1 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示CD38表达的流式细胞术图谱；未染色与抗CD38染色样本，以及自发荧光数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图9"> 
图9：通过FACS将人源PGCLC从酶解离的EB细胞中以CD38+细胞形式富集。 在hPGCLC培养基中培养5-8天后，可通过酶消化法将EB解离，制备成单细胞悬液。hPGCLC可通过FACS以CD38+细胞形式进行富集（红点）。不表达CD38的EB细胞（蓝点）也应收集，作为阴性对照。CD38阳性与CD38阴性细胞的FACS设门应保持较宽的间距（绿点），以避免两类细胞之间的交叉污染。上图和下图分别显示了未加和添加抗CD38抗体染色后的FACS图谱。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

原始生殖细胞（PGCs）是精子和卵子的共同前体细胞。人类胚胎中的原始生殖细胞通过细胞因子的相互作用，由多能性上胚层细胞发育而来。本文中，我们描述了一种为期13天的实验方案，可从处于启动态多能性的诱导性多能干细胞出发，在类胚体表面诱导产生在转录组水平上类似于原始生殖细胞的人类细胞。

原始生殖细胞（PGCs）是所有生殖系细胞的共同前体。在小鼠胚胎中，约40个PGCs组成的创始群体由多能性细胞诱导产生……

该方法有助于回答人类生殖系毒理学领域的关键问题，例如人类原始生殖细胞基因组中的损伤是如何产生或修复的。该技术的主要优势在于，可在两周内从具有疾病易感遗传背景的始发态多能性iPS细胞生成人类原始生殖细胞。该技术的应用前景包括预防人类生殖系细胞的基因组损伤，因为我们的细胞培养模型有助于降低治疗药物对生殖系的毒性。首先，为了生成人类原始生殖细胞样细胞（human primordial germ cell-like cells，即 human PGCLCs），请按照文本方案中的描述，准备包被有细胞外基质蛋白的培养板以及人类诱导性多能干细胞（human iPSCs）的细胞悬液。在含有 Y-27632 Rho 激酶抑制剂的 mTeSR1 培养基中制备处于启动型多能性状态的人类 iPSCs 单细胞悬液，并将细胞密度精确调整至每毫升 100,000 个细胞。在细胞外基质蛋白包被的六孔板中，每孔接种2 mL经启动的人iPSC细胞悬液，通过垂直和水平摇动培养板确保细胞均匀分布。将培养板置于37°C的三气CO2培养箱中孵育。每孔六孔板必须准确接种200,000个细胞，这一点至关重要。准确的细胞计数至关重要。在完成向 naive 多能性的瞬时转化后，细胞可能出现过密生长，这是正常现象。精确控制培养基更换的时间对于获得高比例的人类原始生殖细胞样细胞（PGCLCs）以及实验的可重复性非常重要。在此条件下，4i hiPSC 培养的细胞密度较高，接种后 48 至 72 小时细胞预计达到汇合状态。接种 24 小时后，每孔更换 2 毫升不含 Y27632 的 mTeSR1 培养基。通过将 50 毫升 4i 完全培养基在 37 摄氏度水浴中预热 15 分钟，开始将处于启动型多能性状态的人诱导多能干细胞（hiPSCs）转化为 4i 初始态多能干细胞。接种后 48 小时和 72 小时，从培养箱中取出培养板，每孔加入 2 毫升 4i 完全培养基更换培养液。将包被有去污剂的微孔板在室温下以 1,000 ×g 离心 5 分钟。使用倒置显微镜检查各孔，确保无气泡存在。按照文本方案中所述清洗各孔，并重复离心步骤。向清洗后的孔中加入4i完全培养基。将培养板在室温下以1,000 ×g离心5分钟，再次检查各孔。为了将4i人iPSC接种到微孔板中，按照方案所述制备人iPSC细胞悬液。使用孔径为40微米的细胞筛网过滤该细胞悬液，以去除细胞团块。用一毫升预热的4i完全培养基冲洗筛网三次，以收集筛网上的全部细胞，并使用细胞计数仪进行细胞计数。随后，将该单细胞悬液中的4i naive人iPSCs用预热的含Y27632的4i完全培养基稀释至9毫升，细胞数量为2700万至3240万个。从三气培养箱中取出预先准备好的微孔板，每孔含有1毫升4i完全培养基。向每孔接种1毫升4i naive人iPSC细胞悬液，使每孔细胞浓度达到300万至360万个。轻轻吹打以均匀分散细胞。将培养板在室温下以100 g离心3分钟。将培养板放入三气CO2培养箱中，注意避免扰动已沉淀在微孔中的细胞，孵育24至30小时，因为过夜孵育不足以形成紧密的胚胎体（embryonic bodies，EBs）。将5毫升人PGCLC基础培养基和20毫升人PGCLC完全培养基在37摄氏度水浴中预热至少五分钟。将孔径为40微米的细胞滤网倒置放在一个50毫升聚丙烯离心管上。为使胚体（EBs）从微孔中脱离，轻轻吹打培养板的每一孔。为去除未整合进胚体的细胞，将所有孔中的内容物通过细胞滤网过滤。用1毫升预热的人类PGCLC基础培养基轻轻冲洗滞留在细胞筛膜上的EBs，并重复洗涤五次。将一个新的50毫升锥形管放在细胞筛上，使细胞筛现在正向置于新管中。迅速将带有新管的细胞筛翻转，使EBs位于细胞筛膜下方。向细胞筛膜中加入18毫升预热的人类PGCLC完全培养基，以在锥形管中收集EB。然后，将EB悬液以每孔3毫升的量接种至低吸附六孔板的各孔中。将该板置于三气培养箱内的往复式摇床上，并小心调节摇动速度至约每分钟20转。在实验的第7至13天，每天新鲜配制20毫升人PGCLC完全培养基。将培养板从摇床中取出，使EBs沉降至孔底。吸除旧培养基时避免EBs干燥，每孔保留约0.2毫升旧培养基。每天更换培养基时，弃去旧培养基后，每孔加入 3 毫升新鲜的人类 PGCLC 完全培养基。为鉴定 OCT4 阳性的人类 PGCLC，将拟胚体收集至 1.5 毫升低吸附微量离心管中。室温下静置使拟胚体沉降至管底，然后弃去上清液。用预冷的1×PBS冲洗拟胚体。移除PBS后，在冰上将拟胚体与1毫升预冷的含1%（重量/体积）叠氮化钠的PBS溶液孵育5分钟。随后于室温下静置，使拟胚体沉降至管底。弃去上清液后，用预冷的 PBS 冲洗 EBs。将 200 微升细胞外基质蛋白在冰上解冻。将蛋白加入含有 EBs 的离心管中。将离心管置于室温下约10分钟，直至凝胶完全凝固，胚胎体（EBs）被包埋其中。固定EBs时，向管中加入1毫升4%多聚甲醛PBS溶液，室温下轻轻摇动孵育15分钟。随后弃去多聚甲醛溶液，用预冷的PBS洗涤EBs一次。加入1毫升70%乙醇。可在4摄氏度下用70%乙醇保存长达一周，或直接按照标准FFPE流程进行处理。每个孔中细胞的密度及细胞分布的均匀性至关重要。每孔加入含 Y27632 的培养基 2 毫升，在六孔板中培养的人诱导多能干细胞（iPSCs）经 24 小时后，融合度达到 20% 至 30%。在不含 Y27632 的 mTeSR1 培养基中继续培养 24 小时后，细胞发生聚集并形成克隆，占据约 30% 的生长面积。在 4i 重编程培养基中培养 24 小时后，细胞达到完全融合状态。在4i培养基中继续培养24小时后，细胞变得更加密集。在4i重编程培养基的微孔中孵育24小时后，细胞形成了类胚体（EBs），其圆形轮廓在接种后24至30小时可见。在人源PGCLC培养基中、于摇动非黏附条件下培养24小时后，类胚体保持球形，未发生聚集。 192 小时后，EBs 体积增大，但保持相同的形态。5 天后，OCT4 表达细胞从 EBs 表面开始出现，到第 8 天时其数量进一步增加。通过流式细胞术（FACS），从人 PGCLC 单细胞悬液中富集得到 CD38 阳性细胞。不表达 CD38 的细胞作为阴性对照。为避免污染，流式细胞术设门时 CD38 阳性细胞与 CD38 阴性细胞之间需留出较大间隔。进行该操作时，必须严格遵循精确的细胞计数及换液时间。即使仅有一天未更换培养基，或在任何步骤中减少培养基体积，均可能导致大量细胞死亡。胚胎体摇床培养的振荡速度必须仔细优化。

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Research

科研

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Developmental Biology

发育生物学

从原生多能诱导干细胞中生成胚胎体表面的人原始生殖细胞样细胞

诱导多能干细胞（iPSC）系的建立会产生具有不同发育潜能的细胞系，即使这些细胞系能够通过多能性的标准检测。本文介绍一种完全由iPSCs衍生小鼠的实验方案，该方法可确认iPSC系具有完全的多能性1。...

由诱导性多能干细胞衍生小鼠的制备

本文展示了一种简单且高效的方案，使用单一慢病毒重编程载体，从3-4...

使用STEMCCA慢病毒载体从外周血生成人类诱导多能干细胞

本视频演示了将拟胚体（EBs）分化为神经外胚层聚集体，并进一步将其分离为神经元和胶质细胞的过程。该方法可高效生成神经元和胶质细胞。...

从人诱导性多能干细胞衍生的拟胚体生成神经元和胶质细胞

本视频展示了将人类多能干细胞（hPSCs）转化为球形脑类器官的过程。通过使用特定的抑制剂，引导hPSCs向神经细胞谱系分化，形成神经外胚层样细胞集落。随后引入特殊的生长因子，促进这些细胞集落的自我组织与增殖，最终形成球形脑类器官。...

由人类多能干细胞生成球形体

本方案描述了一种从成人外周血细胞高效生成无整合iPSC的详细方法。通过使用四种基于oriP/EBNA的附加体质粒表达重编程因子KLF4、MYC、BCL-XL以及OCT4和SOX2，可从1...

使用附加体质粒载体从人外周血单个核细胞生成无整合诱导多能干细胞

本方案描述了在完全化学成分明确的条件下，利用非整合型附加体质粒方法将原代羊水及羊膜间充质干细胞重编程为诱导性多能干细胞的过程。详细介绍了细胞的提取、培养、重编程以及通过严格方法对所获得的诱导性多能干细胞进行表征的实验步骤。...

在无异种成分条件下将原代羊水及羊膜细胞重编程为多能性状态

通过使用非整合型仙台病毒（SeV）载体介导的皮肤成纤维细胞重编程，成功实现了人诱导性多能干细胞（hiPS细胞）的高效获得。hiPS细胞的维持和克隆扩增采用无异源成分且化学成分明确的培养条件，使用重组人源层粘连蛋白521（LN-521）基质和Essential...

使用层粘连蛋白521基质无整合方法建立人诱导多能干细胞

我们提出了一种高效、大规模且快速的化学重编程方法，可将传统的已启动谱系的人类多能干细胞（hPSC）逆转为表观基因组稳定的、类似于着床前上胚层的 naive 多能状态。该方法可显著降低谱系启动相关基因的表达，并在多种传统 hPSC...

化学重编程常规人类多能干细胞至类似原始态并增强多向分化潜能

本报告的目的是描述利用不同大小的拟胚体从诱导多能干细胞（iPS细胞）分化获得视网膜色素上皮（RPE）的实验方案。...

通过不同大小的拟胚体从诱导性多能干细胞（iPS细胞）中分化视网膜色素上皮细胞（RPE）

本论文提供了从拔取的毛发中分离和培养人角质形成细胞，并通过附加体型载体进一步生成无整合的人诱导性多能干细胞（hiPSCs）的逐步操作流程。...

利用毛发来源的角质形成细胞生成无整合的人诱导性多能干细胞

了解从诱导多能干细胞生成人原始生殖细胞样细胞的方法，该13天方案用于研究生殖系毒理学和基因组完整性，有助于减少治疗药物的生殖毒性。

从始发多能性诱导多能干细胞衍生的类胚体表面产生人类原始生殖细胞样细胞

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