从始发多能性诱导多能干细胞衍生的类胚体表面产生人类原始生殖细胞样细胞

该方法有助于回答人类生殖系毒理学领域的关键问题，例如人类原始生殖细胞基因组中的损伤是如何产生或修复的。该技术的主要优势在于，可在两周内从具有疾病易感遗传背景的始发态多能性iPS细胞生成人类原始生殖细胞。该技术的应用前景包括预防人类生殖系细胞的基因组损伤，因为我们的细胞培养模型有助于降低治疗药物对生殖系的毒性。

首先，为了生成人类原始生殖细胞样细胞（human primordial germ cell-like cells，即 human PGCLCs），请按照文本方案中的描述，准备包被有细胞外基质蛋白的培养板以及人类诱导性多能干细胞（human iPSCs）的细胞悬液。在含有 Y-27632 Rho 激酶抑制剂的 mTeSR1 培养基中制备处于启动型多能性状态的人类 iPSCs 单细胞悬液，并将细胞密度精确调整至每毫升 100,000 个细胞。

在细胞外基质蛋白包被的六孔板中，每孔接种2 mL经启动的人iPSC细胞悬液，通过垂直和水平摇动培养板确保细胞均匀分布。将培养板置于37°C的三气CO2培养箱中孵育。每孔六孔板必须准确接种200,000个细胞，这一点至关重要。

准确的细胞计数至关重要。在完成向 naive 多能性的瞬时转化后，细胞可能出现过密生长，这是正常现象。精确控制培养基更换的时间对于获得高比例的人类原始生殖细胞样细胞（PGCLCs）以及实验的可重复性非常重要。

在此条件下，4i hiPSC 培养的细胞密度较高，接种后 48 至 72 小时细胞预计达到汇合状态。接种 24 小时后，每孔更换 2 毫升不含 Y27632 的 mTeSR1 培养基。通过将 50 毫升 4i 完全培养基在 37 摄氏度水浴中预热 15 分钟，开始将处于启动型多能性状态的人诱导多能干细胞（hiPSCs）转化为 4i 初始态多能干细胞。

接种后 48 小时和 72 小时，从培养箱中取出培养板，每孔加入 2 毫升 4i 完全培养基更换培养液。将包被有去污剂的微孔板在室温下以 1,000 ×g 离心 5 分钟。使用倒置显微镜检查各孔，确保无气泡存在。

按照文本方案中所述清洗各孔，并重复离心步骤。向清洗后的孔中加入4i完全培养基。将培养板在室温下以1,000 ×g离心5分钟，再次检查各孔。

为了将4i人iPSC接种到微孔板中，按照方案所述制备人iPSC细胞悬液。使用孔径为40微米的细胞筛网过滤该细胞悬液，以去除细胞团块。用一毫升预热的4i完全培养基冲洗筛网三次，以收集筛网上的全部细胞，并使用细胞计数仪进行细胞计数。

随后，将该单细胞悬液中的4i naive人iPSCs用预热的含Y27632的4i完全培养基稀释至9毫升，细胞数量为2700万至3240万个。从三气培养箱中取出预先准备好的微孔板，每孔含有1毫升4i完全培养基。向每孔接种1毫升4i naive人iPSC细胞悬液，使每孔细胞浓度达到300万至360万个。

轻轻吹打以均匀分散细胞。将培养板在室温下以100 g离心3分钟。将培养板放入三气CO2培养箱中，注意避免扰动已沉淀在微孔中的细胞，孵育24至30小时，因为过夜孵育不足以形成紧密的胚胎体（embryonic bodies，EBs）。

将5毫升人PGCLC基础培养基和20毫升人PGCLC完全培养基在37摄氏度水浴中预热至少五分钟。将孔径为40微米的细胞滤网倒置放在一个50毫升聚丙烯离心管上。为使胚体（EBs）从微孔中脱离，轻轻吹打培养板的每一孔。为去除未整合进胚体的细胞，将所有孔中的内容物通过细胞滤网过滤。

用1毫升预热的人类PGCLC基础培养基轻轻冲洗滞留在细胞筛膜上的EBs，并重复洗涤五次。将一个新的50毫升锥形管放在细胞筛上，使细胞筛现在正向置于新管中。迅速将带有新管的细胞筛翻转，使EBs位于细胞筛膜下方。

向细胞筛膜中加入18毫升预热的人类PGCLC完全培养基，以在锥形管中收集EB。然后，将EB悬液以每孔3毫升的量接种至低吸附六孔板的各孔中。将该板置于三气培养箱内的往复式摇床上，并小心调节摇动速度至约每分钟20转。

在实验的第7至13天，每天新鲜配制20毫升人PGCLC完全培养基。将培养板从摇床中取出，使EBs沉降至孔底。吸除旧培养基时避免EBs干燥，每孔保留约0.2毫升旧培养基。

每天更换培养基时，弃去旧培养基后，每孔加入 3 毫升新鲜的人类 PGCLC 完全培养基。为鉴定 OCT4 阳性的人类 PGCLC，将拟胚体收集至 1.5 毫升低吸附微量离心管中。室温下静置使拟胚体沉降至管底，然后弃去上清液。

用预冷的1×PBS冲洗拟胚体。移除PBS后，在冰上将拟胚体与1毫升预冷的含1%（重量/体积）叠氮化钠的PBS溶液孵育5分钟。随后于室温下静置，使拟胚体沉降至管底。

弃去上清液后，用预冷的 PBS 冲洗 EBs。将 200 微升细胞外基质蛋白在冰上解冻。将蛋白加入含有 EBs 的离心管中。

将离心管置于室温下约10分钟，直至凝胶完全凝固，胚胎体（EBs）被包埋其中。固定EBs时，向管中加入1毫升4%多聚甲醛PBS溶液，室温下轻轻摇动孵育15分钟。随后弃去多聚甲醛溶液，用预冷的PBS洗涤EBs一次。

加入1毫升70%乙醇。可在4摄氏度下用70%乙醇保存长达一周，或直接按照标准FFPE流程进行处理。每个孔中细胞的密度及细胞分布的均匀性至关重要。

每孔加入含 Y27632 的培养基 2 毫升，在六孔板中培养的人诱导多能干细胞（iPSCs）经 24 小时后，融合度达到 20% 至 30%。在不含 Y27632 的 mTeSR1 培养基中继续培养 24 小时后，细胞发生聚集并形成克隆，占据约 30% 的生长面积。在 4i 重编程培养基中培养 24 小时后，细胞达到完全融合状态。

在4i培养基中继续培养24小时后，细胞变得更加密集。在4i重编程培养基的微孔中孵育24小时后，细胞形成了类胚体（EBs），其圆形轮廓在接种后24至30小时可见。在人源PGCLC培养基中、于摇动非黏附条件下培养24小时后，类胚体保持球形，未发生聚集。

192 小时后，EBs 体积增大，但保持相同的形态。5 天后，OCT4 表达细胞从 EBs 表面开始出现，到第 8 天时其数量进一步增加。通过流式细胞术（FACS），从人 PGCLC 单细胞悬液中富集得到 CD38 阳性细胞。

不表达 CD38 的细胞作为阴性对照。为避免污染，流式细胞术设门时 CD38 阳性细胞与 CD38 阴性细胞之间需留出较大间隔。进行该操作时，必须严格遵循精确的细胞计数及换液时间。

即使仅有一天未更换培养基，或在任何步骤中减少培养基体积，均可能导致大量细胞死亡。胚胎体摇床培养的振荡速度必须仔细优化。