从原生多能诱导干细胞中生成胚胎体表面的人原始生殖细胞样细胞

这种方法可以帮助回答人类生殖毒理学领域的关键问题，例如人类原始生殖细胞基因组中的损伤是如何产生或修复的。这项技术的主要优点是，人类原始生殖细胞可以在两周内从具有疾病倾向遗传背景的利用多能性 iPS 细胞中产生。该技术的影响扩展到预防人类生殖细胞的基因组损伤，因为我们的细胞培养模型可以帮助我们减少治疗药物的生殖碱毒性。

首先，如文本协议所述，从人类原始生殖细胞样细胞或人类PGCLC的生成开始，编写细胞外基质蛋白涂层板和细胞悬浮液。在含有Y-27632 Rho激酶抑制剂的mTeSR1介质中准备一个素质多能人类 iPSCs 的单细胞悬浮液。小心地将细胞密度调整到每毫升10万个细胞。

在细胞外基质蛋白涂层的六孔板的每个井中接种两毫升填充人类 iPSC 的细胞悬浮液，确保细胞通过垂直和水平摇动板均匀分布。在37摄氏度的三气CO2培养箱中孵育板。在六井板的每个井中准确接种20万个细胞是非常重要的。

准确计数细胞至关重要。在完成暂时性转换到天真多能性后，细胞应看起来过度汇合，这是正常的。介质变化的准确时间对于实现高人类PGCLC和实验可重复性非常重要。

在这些条件下，4i hiPSC 培养的密度很高，预计在接种后 48 至 72 小时内细胞会合。接种后24小时，在没有Y27632的情况下，用每井2毫升的mTeSR1介质更换介质。开始将供热多能状态人类iPSCs转化为4i天真多能干细胞，在37摄氏度的水浴中加热50毫升4i完整介质15分钟。

在接种后48小时和72小时，从培养箱中取出板，并改变培养基，每孔2毫升4i完整介质的介质。在室温下将洗涤剂涂层的微井板在1000克下离心5分钟。使用倒置显微镜检查油井，确保没有气泡。

如文本协议所述冲洗水井，然后重复离心。在冲洗的孔中加入4i完整的介质。在室温下以1000克离心板5分钟，然后再次检查油井。

要将4i人类iPSC接种到微井板中，请根据协议中所述准备人类iPSC细胞悬浮液。通过 40 微米孔径细胞滤株过滤此细胞悬浮液，以去除细胞聚集体。用一毫升预热4i完整介质洗涤过滤器三次，从过滤器中收集所有细胞，并用培养计数器计数细胞。

然后，稀释这种单细胞悬浮4i天真人类iPSCs到27至3240万细胞在9毫升预加热4i完整的介质含有Y27632。从三气培养箱中取出先前准备的微井板，每井含有 1 毫升 4i 完整介质。将1毫升4i nave人类iPSC悬浮液接种到每一井中，达到每井300万至360万个细胞的浓度。

轻轻移液器均匀分布细胞。在室温下以 100 g 离心板 3 分钟。将板放在三气 CO2 培养箱中，确保不要干扰在微井中颗粒的细胞，并孵育 24 至 30 小时，因为隔夜孵育不足以形成紧绷的胚胎体或 EBs。

在37摄氏度的水浴中，5毫升人类PGCLC基质和20毫升人类PGCLC的洗净介质完成至少5分钟，小心地将40微米孔径的细胞过滤器倒置在50毫升聚丙烯锥形管上。要从微井中分离 MB，请轻轻移液板的每个井。要去除未纳入 EBs 的细胞，请通过细胞滤株过滤所有孔的内容。

用1毫升预热人类PGCLC基质轻轻清洗留在细胞滤株膜上的ERB，并重复洗涤五次。将一个新鲜的 50 毫升锥形管放在细胞过滤器上，使细胞过滤器现在位于新管的右侧。快速将细胞滤株与新管反转，该管将 EB 放在细胞滤株膜下方。

将18毫升预热人类PGCLC完整介质加入细胞滤株膜，收集锥形管中的ERB。然后，板3毫升每孔悬浮的EBs到低附六孔板的井。将板放在三气培养箱中的跷跷板移动摇杆上，并小心地将摇速设置为每分钟约 20 圈。

在实验的第7天到第13天，每天新鲜准备20毫升的人类PGCLC完成介质。从摇杆上拆下板，使 EB 沉入井底。在不干燥 EBs 的情况下去除旧介质，使每井中保留约 0.2 毫升的旧介质。

每天去除旧介质后，每井添加3毫升新鲜人类PGCLC完整介质。要将人类PGCLC识别为OTC4阳性细胞，将ERB收获至1.5毫升低结合微离心管。让 EB 在室温下沉入底部，然后丢弃介质。

用冰 1X PBS 冲洗 MB。取出PBS后，在1毫升的冰冷1%重量中孵育EBs，用PBS中量的亚兹德钠孵育5分钟。让 EB 在室温下沉入底部。

丢弃上清液后，用冰冷的 PBS 冲洗 MB。在冰上解冻200微升细胞外基质蛋白。将蛋白质加入含有EBs的管子。

将管在室温下保持约 10 分钟，直到凝胶凝固，并嵌入 EB。要修复 EBs，在 PBS 中加入 1 毫升 4%甲醛，并在室温下用轻轻摇动孵育 15 分钟。之后，丢弃甲醛，用冰冷的PBS冲洗一次EBs。

加入1毫升70%乙醇。在 4 摄氏度下储存 70%乙醇长达一周，或使用标准的 FFPE 协议进行处理。每一个井的细胞密度和细胞均匀分布至关重要。

2毫升Y27632的人类IPSC在6井板每井补充介质，24小时后达到20至30%的汇合。在 mTeSR1 培养基中再培养 24 小时后，在没有 Y27632 的情况下，细胞聚集并形成菌落，约占生长面积的 30%。在4i重新编程培养基中24小时培养后，细胞达到汇合。

在4i培养基中再培养24小时后，细胞变得更密集。在4i重新编程介质中的微孔中孵育24小时后，细胞在接种后24至30小时内形成其圆形轮廓可见的EBs。EBs保持在人类PGCLC介质中，在无硬性条件下，在24小时后保持球形，无聚合。

192小时后，MB更大，保持相同的形态。5天后，细胞出现为T十年，在EBs表面表达细胞，8天后增加细胞数量。人类PGCLC单细胞悬浮细胞被FACS丰富为CD38阳性细胞。

不表达 CD38 的细胞是阴性对照。为避免污染，FACS 门 CD38 阳性和 CD38 阴性细胞被大范围分离。在尝试此过程时，遵循精确细胞计数和介质变化的时间非常重要。

省略介质变化，甚至一天，或减少该介质的体积在任何步骤，可能会导致大量的细胞死亡。胚胎体摇摆培养的速度必须仔细优化。