二维和三维拟胚体中视黄酸诱导小鼠胚胎干细胞神经分化的分析

本实验的总体目标是分别分析小鼠胚胎干细胞神经分化过程中基因和蛋白质标志物的表达与产生情况。该方法有助于确定DPA原始年龄抑制神经分化的机制，并推动建立更优的干细胞向神经元分化的方案，以用于治疗目的。该技术的主要优势在于，它能够方便地在基因和蛋白质水平追踪神经分化过程，包括通过光学显微镜进行观察。

本实验操作将由我实验室的研究助理杨俊宁博士（Dr. Junning Yang）进行演示。开始拟胚体形成时，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA在37摄氏度、5%二氧化碳条件下消化胚胎干细胞2至5分钟。向正在脱落的细胞中加入含15%胎牛血清（FBS）的新鲜伊氏改良杜尔贝科培养基（IMDM），并将细胞悬液转移至15毫升离心管中。

在室温下以160 × g离心五分钟。然后使用血细胞计数板对细胞进行计数，并用含0.5 µM视黄酸的IMDM培养基制备浓度为5 × 10⁵个细胞/毫升的细胞悬液。接着，使用八通道移液器和200 µL吸头，向每个100 mm培养皿中加入120 µL液滴。

倒置培养皿，并向倒置的皿盖中加入PBS，以防止悬滴干燥。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养三至四天。使用200微升移液器吸头收集培养三天的悬滴胚状体。

用移液器枪头接触一个类胚体，并将其转移至24孔板中经纤连蛋白包被的盖玻片上。每两到三天更换一次培养体系的培养基。更换培养基时，根据需要收集用过的培养基用于分泌蛋白分析。

为了检测培养基中分泌的蛋白质，将500微升拟胚体培养基转移至截留分子量为10千道尔顿的离心过滤器中，在4摄氏度下以20,000 × g离心。每15至20分钟检查一次离心过滤器内残留的培养基，以防止过度浓缩。当残留培养基体积减少至25微升时，停止离心。

将滤器倒置，在4°C、160 × g条件下离心，然后按照制造商的说明收集剩余的浓缩培养基。对于三维培养，用200微升移液器吸头收集以悬滴法培养4天的拟胚体，方法同前。将30个拟胚体转移至1.5毫升离心管中，然后通过稀释适量体积的胶原蛋白溶液和5倍浓度DMEM，并加入中和液，立即充分混匀，制备胶原凝胶溶液。

将胶原凝胶置于冰上。接着，用移液器吸取适量预冷的胶原溶液加入含有类胚体的离心管中，然后轻轻将类胚体悬液移入六孔板的孔中，避免产生气泡。立即将该板转移至37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育60分钟，以启动胶原聚合。

60 分钟后，用 IMDM 覆盖含有拟胚体的培养板。对于拟胚体的解离，再次使用 200 微升移液器吸头收集四天悬挂液滴法生成的拟胚体。此次将其转移至含有 IMDM 和 15% FBS 的非黏附性细菌培养皿中，并在 37°C、5% CO₂ 条件下继续培养四天。

每天检查拟胚体两次，确保其未贴附于培养皿底部。轻轻晃动培养皿以防止拟胚体贴壁。培养四天后，将拟胚体转移至离心管中，在室温下以185 × G离心5分钟。

离心后，弃去上清液。残留液体体积不应超过100微升。接着，用移液器向拟胚体管中加入1毫升含有20%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）配制的0.25% I型胶原酶溶液。

将混合物在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时。每20分钟用1毫升移液枪头轻轻吹打悬浮液。孵育结束后，用PBS轻柔洗涤细胞3次。

如果存在细胞团块，使用孔径为100微米的细胞筛去除。将细胞接种于明胶包被的盖玻片上，培养基为IMDM，于37°C及5%二氧化碳条件下孵育。用PBS洗涤二维培养细胞或解离后的三维拟胚体。

然后在室温下用4%多聚甲醛和PBS固定30分钟。用PBS洗涤固定后的细胞3次以去除漂浮的细胞碎片，随后加入含1% Triton X-100的PBS，在室温下处理20分钟以通透细胞。再次如前所述洗涤细胞，弃去最后一次洗涤液，用含5% BSA的PBS在室温下封闭30分钟。

孵育即将结束时，用含0.03%吐温X-100的1% BSA-PBS溶液配制一抗稀释液。30分钟孵育结束后，弃去封闭液，加入一抗溶液。室温孵育3小时，或在4摄氏度下孵育过夜。

洗涤后，在 PBS 中加入二抗，室温孵育一小时。最后，用抗荧光淬灭封片剂将盖玻片封固于载玻片上，用于光学显微镜观察。该图像显示了由胚胎干细胞（ESCs）产生的拟胚体中出芽的结构，该结构中存在两个拷贝的 Syx 基因，该基因编码一种鸟嘌呤交换因子，可激活 GTP 酶 RhoA。

该图像为3D培养六天后拍摄。由Syx基因敲除ESC形成的类胚体在相同培养时间后表现出出芽增加。此处2D类胚体边缘的相差图像显示，与Syx野生型相比，Syx基因敲除细胞的扩展速度更快。

这些免疫荧光图像显示，从六天大的 2D6 KnockOut 胚状体中扩增的细胞，其神经分化标志物 Nestin（红色显示）的表达量高于 Syx 野生型对应的细胞。此处免疫荧光图像表明，从十三天大的 3D6 KnockOut 胚状体中解离的细胞，其神经分化标志物 Nestin 和 beta III Tubulin 的表达量也高于 Syx 野生型对应的细胞。由于胚状体生长和分化所需时间较长，该过程较为耗时。

该过程不仅至少需要八天，而且在某些情况下，我们需持续观察分化过程长达24天。在进行此操作时，必须注意限制类胚体的直径大小，以确保类胚体各部分的分化速率保持一致。