从水样中分离抗生素耐药细菌进行分子分析

从含有水传播细菌的水样开始，然后对其进行过滤以去除碎屑。

将稀释的滤液转移到低营养琼脂平板上，每个琼脂平板都补充有特定的抗生素。铺开滤液并孵育。

携带特定抗生素耐药基因的细菌在相应的抗生素平板上生长并形成菌落。

计算菌落以确定菌落形成单位 （CFU），代表抗生素耐药细菌的数量。

从每个板中选择一个菌落并将其悬浮在无菌蒸馏水中。

加热悬浮液以裂解细胞并释放细胞内内容物，包括含有抗生素耐药基因的细菌 DNA。

离心试管以分离碎片并收集含有 DNA 的上清液。

将扩增试剂添加到提取的 DNA 中。

将试管放入热循环仪中并运行程序以扩增细菌 DNA 的特定区域。

扩增的 DNA 已准备好进行序列分析以鉴定抗生素耐药基因。

通过无菌平纹细布过滤水样以去除任何颗粒物，对水样进行无菌处理。然后，连续稀释过滤后的水样以进行进一步分析。要确定抗生素耐药细菌计数，请将抗生素单独添加到装有20毫升无菌熔融R2A琼脂的管中，该琼脂在大约40摄氏度下修饰。

旋转均匀混合，在琼脂凝固之前倒入无菌培养皿上。将 100 微升细菌悬浮液涂抹在各自含有 R2A 琼脂改性平板的抗生素上。将板在35至37摄氏度下孵育48小时，然后测定细菌计数。

为了从分离株中制备用于PCR的DNA模板，使用无菌牙签，取生长在培养皿上的分离株的单个分离纯菌落。将菌落悬浮在微型离心管中的 100 微升无菌双蒸馏水中，并在沸水浴或干浴中以 100 摄氏度煮沸 10 分钟。将悬浮液以 10,000 g 离心两分钟以沉淀碎片，并将上清液转移到新鲜的无菌微量离心管中用作粗 DNA 模板。

要通过PCR扩增16S rRNA基因的V3区域，请在PCR管中制备40微升反应混合物。将试管放入热块中，并在 PCR 热循环仪中运行适当的程序。