使用 β-葡萄糖苷酶测定评估细菌的突变频率

取转基因细菌培养物。

细菌被诱导表达具有校对活性缺陷的DNA聚合酶突变变体，这增加了复制错误的机会。

这些错误会导致调节区域的自发突变，从而抑制β-葡萄糖苷酶基因并触发β-葡萄糖苷酶的表达。

定期收集样品并评估每个培养物中的细菌生成数。离心样品并丢弃上清液。

将沉淀重悬于缓冲液中。

加入透化溶液并混合以透化细菌膜。

将透化的细菌样品转移到多孔板中。

添加进入细菌并与 β-葡萄糖苷酶反应的底物，产生有色产品。

测量颜色强度以确定 β-葡萄糖苷酶活性。

分析细菌培养物中的 β-葡萄糖苷酶活性，以确定跨代突变频率。

将含有pBAD-ε和pGOOD1-εD12A11载体的单个 大肠杆菌 TOP10菌落转移到用抗生素处理的一毫升LB培养基中。

将培养物在 37 摄氏度下孵育过夜。第二天早上，在装有10毫升新鲜培养基的三个烧瓶中稀释预培养1至250。加入阿拉伯糖、IPTG或阿拉伯糖和IPTG各一毫摩尔的诱导剂，并将诱导培养物在37摄氏度下孵育8小时。

并行制备非诱导培养物。收集一毫升等分试样，并在装有10毫升新鲜培养基的新烧瓶中稀释1至500，补充或不补充诱导剂。然后将混合物在 37 摄氏度下孵育过夜。

第二天，重复从稀释预培养物开始的步骤，并收集一毫升等分试样。然后将等分试样放入冰箱中。

接下来，确定每种文化中发生的代数。将 100 微升适当的连续稀释液的接种物和培养物转移到 LB 板上。

将板在 37 摄氏度下孵育过夜。第二天早上，数一数 LB 板上的菌落。

计算接种物或log I中存在的细胞数以及生长结束时培养物或log C中存在的细胞数的对数，并确定代数。

然后将培养物以5,000gs离心20分钟，并将细胞重悬于一毫升50毫摩尔tris HCL，pH 7.6,50毫摩尔NaCl中。

要使细胞透化，请加入两到三滴氯仿并涡旋 20 秒。

最后，在96孔微孔板中测定每个等分试样的葡萄糖苷酶活性。

向每个孔中加入 100 微升透化细胞和 100 微升使用对硝基苯基-D-吡喃葡萄糖苷底物，同时避免在孔中产生气泡。

使用酶标仪和过滤器读取 420 纳米处的吸光度。