经过一蛋白饱和诱变图书馆的功能评价规范利用高通量测序

该方案的总体目标是利用高通量测序描述蛋白质的全面、单位点饱和诱变文库的功能评估。这种方法可以帮助回答生物化学和分子进化领域的关键问题。例如，蛋白质的生化结构和进化限制是什么？

我们如何设计具有新功能的蛋白质？该技术的主要优点是，它通过多重文库构建和测序，在全蛋白饱和诱变研究中最大限度地提高了许多有用的测序读长。根据文本方案制备一板 PCR 预混液后，使用多通道移液器将 10 微升从含有先前稀释的正义诱变引物的 96 孔板转移到 PCR 板中的同源孔中。

使用板密封件覆盖每个 PCR 板，并以 200 G 离心 2 分钟。然后，将 PCR 板转移到热循环仪上，并运行以下程序。在进行额外的 PCR 并稀释反应物 1 到 100 后，从混合和稀释的第一轮诱变 PCR 产物中转移 1 微升到含有预混液的新 PCR 板的同源孔中。

使用板密封盖住每个 PCR 板。将板以大约 200 Gs 离心 2 分钟。然后将板转移到热循环仪上，并运行视频前面列出的相同程序。

验证 PCR 产物大小并根据文本方案测量浓度后，将 100 ng 每个 NNS 子文库 PCR 产物混合到五个 NNS 子文库组中。在运行子文库 PCR 反应并在 PCR 反应中消化克隆载体后，根据文本方案，按照这些指南为每个消化的 NNS 子文库组及其同源限制性消化克隆载体设置连接反应。然后，在室温下孵育 1 小时。

电感受态大肠杆菌细胞解冻后，向每个纯化的连接反应中加入 10 μL 细胞，然后转移到电逐位比色皿中。以 1.8 KB 电压对细胞进行电液分配，然后加入 1 毫升 SOB 培养基，并在 37 摄氏度下孵育 1 小时。然后，将 10 微升的每种恢复培养物重悬于 990 微升 LB 中。并在每毫升含有 12 微克四环素的 LB 螺旋板上涂抹 100 微升。

对于每个回收培养物，准备一个 250 毫升的培养瓶，其中包含 50 毫升 LB 和 50 微升 tet-stock。将剩余的约 1 mL 回收培养物转移到培养瓶中。在 37 摄氏度和 200 rpm 下孵育过夜。

在计数平板上成功转化体的数量，并从过夜培养物中分离血浆 DNA 后，将 100 ng 的每种质粒混合在一起。根据文本方案转化 DNA 文库后，将文库过夜培养物稀释至等于 0.1 的 OD-600。并在一个烧瓶中加入 1 毫升。

在 37 摄氏度和 200 RPM 下孵育预选培养物。通过测量 OD-600 定期监测生长情况，直到它等于 0.1。将 100 毫升预筛选培养物转移到两个 50 毫升锥形管中，并在 4 摄氏度下以 4， 000 Gs 离心 6 分钟。

去除大部分上清液，将沉淀物混合到一个 15 mL 锥形管中。然后，重复离心后，除去所有上清液。向其他两个培养瓶中加入四环素，使终浓度为 12 μg/mL。

以及预选培养物的体积，使得最终的 OD-600 等于 0.001。向一个培养瓶中加入 1 毫升 50 毫克/毫升氨苄青霉素，终浓度为 50 微克/毫升。这就是选择文化。

在 37 摄氏度下以 200 RPM 孵育培养物时，监测不含氨苄青霉素的培养物的生长，直到达到等于 0.1 的 OD-600。还要测量选择培养物的 OD-600。将筛选培养物的 OD-600 除以 0.1 并乘以 100 后，将此体积转移到 50 毫升锥形管中，并在 4， 000 Gs 和 4 摄氏度下离心 6 分钟。

去除大部分上清液后，将沉淀物合并成一个管，然后再次旋转并去除所有上清液。要进行高通量测序，请制备 PCR 预混液并将 23 μL 转移至 10 个 PCR 管中。将预选培养物中每 μL 纯化的质粒 DNA 添加 1 μL 0.5 ng，加入试管 1 至 5 中。

从选型培养到第 6 管到第 10 管。将 50 微升 50 微摩尔正向正交引物 OP1F 至 OP5F 与相应的反向正交引物 OP1R 至 OP5R 混合在一起。按照相同的顺序，将 1 μL 转移到 PCR 管 1 到 5 和 6 到 10 中。

将 PCR 管转移到热循环仪上，然后运行以下程序。然后，将每管中的 1 微升转移到 99 微升水中，将 PCR 反应物稀释 100 倍。充分混合，然后从试管中吸取 99 微升，然后丢弃。

将 50 微升正向和相应的反向引物混合在一起。然后，将 1 微升转移到 PCR 管 1 到 5 和 6 到 10 中。然后，在制备 PCR 预混液后，向每个 PCR 管中加入 23 μL，并运行以下程序。

为了进行最终的 PCR 以添加索引序列，像以前一样将 PCR 反应物稀释 100 倍并保留 1 微升，加入 23 微升 PCR 预混液。对于模板来源于 NNS 子库组 1 至 5 的试管，分别添加 0.5 μL 正向引物 501F 至 505F。对于带有预选择和选择培养物产生的模板的试管，添加 0.5 微升反向引物 701R 和 702R。

运行与刚才指示相同的 PCR 程序。然后，在根据文本方案测量每个反应的浓度后，将 100 ng 的每种 PCR 产物混合到单个微量离心管中。添加 6X 凝胶上样染料后，将整个合并后的 PCR 样品上样到 2% 琼脂糖凝胶上。

并在 100 伏电压下运行凝胶 50 分钟。使用长波长紫外照明器，观察并切除含有大约 360 个碱基对的 PCR 产物的切片。根据文本方案对样品进行纯化、测序和分析。

此处显示了包含正交引物位点的五个修饰的 pBR322 质粒的质粒图谱。使用 PCR 测试正交引物的特异性表明，只有当反应中包含匹配的质粒时，才能获得正确的 PCR 产物。没有它，没有获得任何大小的产品。

实验处理后，从预选条件获得 6.2 乘以 10 至第 6 个读数，从氨苄青霉素条件获得 6.3 乘以 10 至第 6 个读数。预选条件中每个氨基酸突变的计数显示对数正态分布。该图描述了 TEM-one 每个位置每个突变的相对适应效应 FIA。

其分布如下所示。在 50 μg/mL 氨苄青霉素的选择下，大多数突变具有中性或接近中性的适应效应。对应于此处的白色像素，以及此处的大峰值。

在这种抗生素浓度下，一小部分突变对适应性有重大影响。正如预期的那样，这些包括高度保守的活性位点残基内的突变。相比之下，很少有像素显示为明显的红色。

一旦掌握，这项技术可以在大约一周内完成。如果执行得当，并且所有试剂都可用。在尝试此过程时，请务必记住在克隆过程中保持井井有条，以便将诱变 PCR 产物组合成正确的组，并克隆到正确的载体中。

在测序准备过程中，要使用正确的引物。从该程序扩展，可以修改协议的主要步骤以检查突变组合、不同的选择环境和其他蛋白质系统，以回答有关突变的遗传和环境背景依赖性的其他问题。观看此视频后，您应该对构建全蛋白饱和诱变文库所需的工作有很好的了解，并使用高通量测序同时评估每个突变的功能效应。

不要忘记，使用溴化乙锭和紫外线可能是危险的，因此在执行本方案的某些部分时，应始终采取预防措施，例如手套、实验室外套和紫外线防护罩。