一种利用高通量测序对全蛋白饱和突变文库进行功能评估的实验方案

本实验方案的总体目标是描述利用高通量测序技术对蛋白质的全面单一位点饱和突变文库进行功能评估的方法。该方法有助于回答生物化学和分子进化领域的关键科学问题，例如：蛋白质所受的生物化学、结构及进化约束有哪些？

我们如何设计具有新功能的蛋白质？该技术的主要优势在于，通过多重化文库构建和测序，可在全蛋白饱和突变研究中最大化有用测序读段的数量。按照文本中的方案配制一块 PCR 预混液板后，使用多通道移液器将含有先前稀释的正义突变引物的 96 孔板中的 10 µL 液体转移至 PCR 板中对应的孔位。

使用板封膜覆盖每个 PCR 板，并在 200 ×g 下离心 2 分钟。然后将 PCR 板转移至热循环仪中，运行以下程序。在完成额外的 PCR 并将反应产物稀释 1 至 100 倍后，从混合并稀释的第一轮诱变 PCR 产物中取 1 µL，转移至含有 Master Mix 的新 PCR 板的对应孔中。

使用板封膜覆盖每个 PCR 板。在约 200 ×g 条件下离心 2 分钟。然后将板转移至热循环仪，并运行视频中先前列出的相同程序。

在根据文本方案确认PCR产物大小并测定浓度后，将每个NNS亚文库PCR产物各100纳克混合，组成五个NNS亚文库组。按照文本方案进行亚文库PCR反应并对克隆载体进行PCR反应中的消化后，针对每个经消化的NNS亚文库组及其对应的经限制性酶切的克隆载体，按照以下指南设置连接反应。然后在室温下孵育一小时。

将电转感受态 E.coli 细胞解冻后，取十微升细胞加入到每份纯化的连接反应体系中，混匀后转移至电穿孔杯中。在1.8千伏条件下对细胞进行电穿孔，随后加入一毫升SOB培养基，在37摄氏度下孵育一小时。然后，将每份复苏培养物取10微升重悬于990微升LB培养基中，并将其中100微升涂布于含有12微克/毫升四环素的LB琼脂平板上。

每份复苏培养物，准备一个250毫升的培养瓶，加入50毫升LB培养基和50微升四环素储存液。将剩余的约1毫升复苏培养物转移至培养瓶中。在37摄氏度、200转/分钟条件下过夜培养。

在计数平板上成功转化的菌落数量，并从过夜培养物中分离质粒DNA后，将每种质粒各100纳克混合在一起。按照文本方案转化DNA文库后，将文库的过夜培养物稀释至600 nm处的光密度（OD-600）为0.1，并向一个烧瓶中加入1毫升。

将预筛选培养物在37摄氏度、200转/分钟条件下孵育。通过测量OD-600定期监测生长情况，直至其达到0.1。将100毫升预筛选培养物转移至两个50毫升锥形管中，在4摄氏度下以4,000 ×g离心6分钟。

除去大部分上清液，并将沉淀物合并至一个15毫升的锥形管中。随后，重复离心操作，彻底去除上清液。向另外两个培养瓶中加入四环素，使其终浓度为12微克/毫升。

取预筛选培养物的一定体积，使最终OD-600达到0.001。向一个烧瓶中加入1毫升浓度为50毫克/毫升的氨苄青霉素，使其终浓度为50微克/毫升。此即为筛选培养物。

在37摄氏度、200 RPM条件下培养菌液时，监测不含氨苄青霉素的培养物的生长情况，直至其OD-600达到0.1。同时测定筛选培养物的OD-600。将0.1除以筛选培养物的OD-600，再乘以100，根据所得体积取菌液转移至50毫升锥形管中，在4,000 ×g、4摄氏度条件下离心6分钟。

除去大部分上清液后，将沉淀合并至一个离心管中，再次离心并彻底去除上清液。为进行高通量测序，配制PCR主混合液，并向10个PCR管中各转移23 µL。向第1至第5号管中分别加入1 µL浓度为0.5 ng/µL的纯化质粒DNA，该DNA来自预筛选培养物。

从筛选培养物中取样，分别加入第6至第10号离心管。将50微升浓度为50微摩尔的正向正交引物（OP1F至OP5F）与相应的反向正交引物（OP1R至OP5R）混合。按照相同顺序，各取1微升分别加入PCR管第1至第5号以及第6至第10号。

将PCR管转移至热循环仪中，并运行以下程序。然后，通过将每个管中的1微升转移至99微升水中，将PCR反应稀释100倍。充分混匀后，用移液器从管中移出99微升并弃去。

将50微升的正向引物和相应的反向引物混合。然后，取1微升加入第1至第5号PCR管中，再取1微升加入第6至第10号PCR管中。接着，在配制PCR主混合液后，向每个PCR管中加入23微升，并运行以下程序。

为了进行最终的PCR以添加索引序列，在将PCR反应液按前述方法稀释100倍后，取1微升，加入23微升PCR预混液。对于模板来源于NNS亚文库第1至第5组的管，分别加入0.5微升的正向引物501F至505F。对于模板来源于预筛选和筛选培养物的管，加入0.5微升的反向引物701R和702R。

运行与上述相同的PCR程序。然后，根据文本方案测量每个反应的浓度，将每种PCR产物各100纳克混合至同一个微量离心管中。加入6X凝胶上样染料后，将全部混合后的PCR样品上样至2%琼脂糖凝胶中。

在100伏电压下电泳50分钟。使用长波长紫外灯观察并切下含有约360个碱基对PCR产物的条带。根据文本方案对样品进行纯化、测序和分析。

此处展示了包含正交引物结合位点的五种修饰型 pBR322 质粒的质粒图谱。通过 PCR 检测正交引物的特异性结果表明，只有在反应中加入匹配的质粒时，才能获得正确的 PCR 产物；而在缺少相应质粒时，任何大小的产物均无法扩增出来。

实验处理后，从预筛选条件中获得了 6.2 × 10⁶ 条读段，从氨苄青霉素条件中获得了 6.3 × 10⁶ 条读段。预筛选条件下每个氨基酸突变的计数呈对数正态分布。该图展示了每个突变在 TEM-1 蛋白各个位点上的相对适合度效应 FIA。

其分布情况如图所示。在每毫升含50微克氨苄青霉素的选择条件下，大多数突变具有中性或接近中性的适合度效应，对应于此处的白色像素点以及此处的显著峰形。

在此抗生素浓度下，只有一小部分突变对适合度具有显著影响。正如预期的那样，这些突变包括高度保守的活性位点残基内的突变。相比之下，显著呈红色的像素很少。

一旦掌握，该技术大约可在一周内完成。若操作得当，且所有试剂均齐备。在进行该实验过程中，重要的是在克隆时保持条理清晰，以便将诱变PCR产物正确分组，并将其克隆至正确的载体中。

在测序准备过程中，需使用正确的引物。基于本实验流程，该方案的主要步骤可进行修改，以研究突变组合、不同的筛选环境以及其他蛋白质系统，从而回答有关突变的遗传与环境背景依赖性的更多问题。观看本视频后，您应能充分理解构建全蛋白饱和突变文库所需的工作流程，以及如何利用高通量测序技术同时评估每个突变的功能效应。

请注意，溴化乙锭和紫外光的使用可能存在危险，在进行本实验方案的相应步骤时，应始终采取戴手套、穿实验服和使用紫外防护罩等预防措施。