Name: 经过一蛋白饱和诱变图书馆的功能评价规范利用高通量测序 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: 学习利用高通量测序对蛋白质饱和诱变文库进行功能评价的方法。本方案通过多重PCR和正交引物对，最大化测序读数效率，以TEM-1 β-内酰胺酶为模型，帮助研究者深入理解蛋白质的生化结构约束与进化机制，为蛋白质工程提供重要见解。

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R.R. 感谢美国国立卫生研究院（RO1EY018720-05）、罗伯特·A·韦尔奇基金会（I-1366）以及格林系统生物学中心的支持。

<ol><li>Hutchison, C. A. 3rd, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+at+a+specific+position+in+a+DNA+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence.</a> J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).</li>
<li>Mullis, K. B., Faloona, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+synthesis+of+DNA+in+vitro+via+a+polymerase-catalyzed+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction.</a> Methods Enzymol. 155, 335-350 (1987).</li>
<li>Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+in+one+day+with+%3E80%25+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Strategies%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis in one day with >80% efficiency.</a> Strategies. 9 (3), 3-4 (1996).</li>
<li>Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+of+in+vitro+preparation+and+specific+mutagenesis+of+DNA+fragments%3A+study+of+protein+and+DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions.</a> Nucleic Acids Res. 16 (15), 7351-7367 (1988).</li>
<li>Rennell, D., Bouvier, S. E., Hardy, L. W., Poteete, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+mutation+of+bacteriophage+T4+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic mutation of bacteriophage T4 lysozyme.</a> J Mol Biol. 222 (1), 67-88 (1991).</li>
<li>Markiewicz, P., Kleina, L. G., Cruz, C., Ehret, S., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+studies+of+the+lac+repressor.+XIV.+Analysis+of+4000+altered+Escherichia+coli+lac+repressors+reveals+essential+and+non-essential+residues%2C+as+well+as+%27spacers%27+which+do+not+require+a+specific+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic studies of the lac repressor. XIV. Analysis of 4000 altered Escherichia coli lac repressors reveals essential and non-essential residues, as well as 'spacers' which do not require a specific sequence.</a> J Mol Biol. 240 (5), 421-433 (1994).</li>
<li>Kleina, L. G., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+studies+of+the+lac+repressor.+XIII.+Extensive+amino+acid+replacements+generated+by+the+use+of+natural+and+synthetic+nonsense+suppressors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic studies of the lac repressor. XIII. Extensive amino acid replacements generated by the use of natural and synthetic nonsense suppressors.</a> J Mol Biol. 212 (2), 295-318 (1990).</li>
<li>Huang, W., Petrosino, J., Hirsch, M., Shenkin, P. S., Palzkill, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+sequence+determinants+of+beta-lactamase+structure+and+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Amino acid sequence determinants of beta-lactamase structure and activity.</a> J Mol Biol. 258 (4), 688-703 (1996).</li>
<li>Fowler, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+of+protein+sequence-function+relationships%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping of protein sequence-function relationships.</a> Nat Methods. 7 (9), 741-746 (2010).</li>
<li>Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+illumination+of+a+fitness+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Experimental illumination of a fitness landscape.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (19), 7896-7901 (2011).</li>
<li>McLaughlin, R. N., Poelwijk, F. J., Raman, A., Gosal, W. S., Ranganathan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatial+architecture+of+protein+function+and+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The spatial architecture of protein function and adaptation.</a> Nature. 491 (7422), 138-142 (2012).</li>
<li>Deng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+sequencing+of+systematic+combinatorial+libraries+reveals+beta-lactamase+sequence+constraints+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Deep sequencing of systematic combinatorial libraries reveals beta-lactamase sequence constraints at high resolution.</a> J Mol Biol. 424 (3-4), 150-167 (2012).</li>
<li>Stiffler, M. A., Hekstra, D. R., Ranganathan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolvability+as+a+Function+of+Purifying+Selection+in+TEM-1+beta-Lactamase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evolvability as a Function of Purifying Selection in TEM-1 beta-Lactamase.</a> Cell. 160 (5), 882-892 (2015).</li>
<li>Matagne, A., Lamotte-Brasseur, J., Frere, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+properties+of+class+A+beta-lactamases%3A+efficiency+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Catalytic properties of class A beta-lactamases: efficiency and diversity.</a> Biochem J. 330 (Pt2), 581-598 (1998).</li>
<li>Salverda, M. L., De Visser, J. A., Barlow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+evolution+of+TEM-1+beta-lactamase%3A+experimental+reconstruction+and+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Natural evolution of TEM-1 beta-lactamase: experimental reconstruction and clinical relevance.</a> FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1015-1036 (2010).</li>
<li>Weinreich, D. M., Delaney, N. F., Depristo, M. A., Hartl, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Darwinian+evolution+can+follow+only+very+few+mutational+paths+to+fitter+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins.</a> Science. 312 (5770), 111-114 (2006).</li>
<li>Stewart, S. M., Fisher, M., Young, J. E., Lutz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ampicillin+levels+in+sputum%2C+serum%2C+and+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Ampicillin levels in sputum, serum, and saliva.</a> Thorax. 25 (3), 304-311 (1970).</li>
<li>Giachetto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ampicillin+and+penicillin+concentration+in+serum+and+pleural+fluid+of+hospitalized+children+with+community-acquired+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Infect+Dis+J%22%5BJournal%5D)">Ampicillin and penicillin concentration in serum and pleural fluid of hospitalized children with community-acquired pneumonia.</a> Pediatr Infect Dis J. 23 (7), 625-629 (2004).</li>
<li>Ambler, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standard+numbering+scheme+for+the+class+A+beta-lactamases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A standard numbering scheme for the class A beta-lactamases.</a> Biochem J. 276 (Pt 1), 269-270 (1991).</li>
<li>Magoc, T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH%3A+fast+length+adjustment+of+short+reads+to+improve+genome+assemblies%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies).</a> Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).</li>
<li>Melamed, D., Young, D. L., Gamble, C. E., Miller, C. R., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+mutational+scanning+of+an+RRM+domain+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+poly%28A%29-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Deep mutational scanning of an RRM domain of the Saccharomyces cerevisiae poly(A)-binding protein.</a> RNA. 19 (11), 1537-1551 (2013).</li>
<li>Bank, C., Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+survey+of+an+intragenic+epistatic+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">A systematic survey of an intragenic epistatic landscape.</a> Mol Biol Evol. 32 (1), 229-238 (2015).</li>
<li>Dove, S. L., Joung, J. K., Hochschild, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+prokaryotic+transcription+through+arbitrary+protein-protein+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of prokaryotic transcription through arbitrary protein-protein contacts.</a> Nature. 386 (6625), 627-630 (1997).</li>
<li>Romero, P. A., Tran, T. M., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+enzyme+function+with+microfluidic-based+deep+mutational+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dissecting enzyme function with microfluidic-based deep mutational scanning.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (23), 7159-7164 (2015).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益

本文描述了一种利用高通量测序技术对全蛋白饱和突变文库进行功能评估的实验方案。该方法的一个重要特点是克隆过程中使用正交引物。简言之，通过诱变PCR对每个氨基酸位点进行随机化，并将多个位点组合成组，使每组的总序列长度适配高通量测序的读长限制。这些组别被克隆至含有成对正交引物结合位点的质粒载体中，混合后进行筛选，再利用正交引物进行去多重化处理，随后进行深度测序。由于突变被限制在测序读长范围内，该方法可最大化获取包含突变的有效测序读数，尤其适用于长度超过测序读长的基因。此外，该技术允许对整个突变文库进行同时或&#34;单批次&#34;筛选，从而减少工作量，并避免不同突变经受不同筛选强度的可能性。在实际操作中，该方案的关键步骤主要涉及实验组织管理：在克隆过程（方案步骤2.3）中，必须确保诱变PCR产物被正确分组并克隆至相应的正交引物位点载体中；在测序样本制备过程中（方案步骤4.1），必须正确使用正交引物，以及用于分离各个NNS子文库组并添加索引序列的引物。
本实验方案的三个主要步骤——文库构建、筛选和测序——可在多个方面进行修改。在文库构建过程中，可采用多种技术引入突变，例如通过易错PCR，...

诱变技术长期以来被用于研究生物系统的特性及其进化过程，并用于产生具有增强或新功能的突变蛋白或生物体。早期的方法依赖于在生物体中产生随机突变的技术，而重组DNA技术的出现使研究人员能够以位点特异性的方式在DNA中引入特定的改变。 即定点突变1,2目前的技术通常利用诱变性寡核苷酸进行聚合酶链式反应（PCR），可相对容易地构建和评估少量突变例如特定基因中的点突变3,4然而，当目标接近于创建和评估所有可能的单一位点（或更高阶）突变时，难度要大得多。
尽管早期研究在评估基因中大量突变方面已取得诸多成果，但所用技术往往十分繁琐，例如需要借助无义突变抑制菌株独立地逐一评估每个突变5-7，或由于Sanger测序的测序深度较低而在定量能力上受到限制8。这些研究中使用的技术目前已基本被基于高通量测序技术的方法所取代9-12。这些在概念上较为简单的方法包括：构建包含大量突变的文库，对文库进行功能筛选或选择，随后对筛选前后的文库进行深度测序（即，测序读长远超&#62;106条）。通过这种方式，可同时且更定量地评估大量突变的表型或适合度效应，这些效应表现为各个突变体在群体中频率的变化。
我们此前介绍了一种用于评估蛋白质中所有可能的单氨基酸突变文库的简单方法（即，全蛋白饱和突变文库），适用于基因长度超过测序读长的情况11,13首先，通过定点诱变PCR对每个氨基酸位点进行随机化。在此过程中，基因被划分为若干组，每组包含连续的位点，且总长度符合测序平台的读长要求。随后，将每组的诱变PCR产物混合，并对各组分别进行筛选和高通量测序。通过保持序列中突变位置与测序读长之间的对应关系，该方法具有最大化测序深度的优势：尽管可以直接在不划分组的情况下对文库进行短窗口测序（例如采用标准的鸟枪法测序策略时，所获得的大部分读长将是野生型序列，从而导致大部分测序通量被浪费例如， 对于一个500个氨基酸的蛋白质，若以其全长蛋白饱和突变文库在100个氨基酸（300 bp）的测序窗口下进行测序，则至少80%的读长将为野生型序列。
本文介绍了一种利用高通量测序对全蛋白饱和突变文库进行功能评估的实验方案，该方案采用上述方法（如图1所示）。重要的是，我们在文库克隆过程中引入了正交引物，用于为每个序列组添加条形码，从而可将多个序列组混合构建为一个文库，同时进行筛选或选择，并随后通过深度测序实现去多重化分析。由于各个序列组无需独立进行筛选，该策略显著降低了工作量，并确保每个突变所经历的选择压力保持一致。本研究以TEM-1 β-内酰胺酶为模型系统14-16，该酶可使细菌对β-内酰胺类抗生素（例如，氨苄青霉素）产生高水平耐药性。文中描述了在E. coli中构建TEM-1全蛋白饱和突变文库，并在相当于临床剂量氨苄青霉素血清浓度（50 µg/ml）的选择压力下进行功能评估的详细实验流程17,18。

<table><tbody><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Research Products Intl. Corp.</td><td>T60060-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Research Products Intl. Corp.</td><td>Y20020-500.0</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>盐酸四环素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660-5G</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Corning</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB&amp;nbsp;</td><td>Mathworks</td><td>http://www.mathworks.com/products/matlab/</td><td></td></tr><tr><td>寡核苷酸引物</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>https://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos</td><td>25 nmol 规模，标准脱盐</td></tr><tr><td>pBR322_AvrII</td><td>可按要求提供</td><td></td><td>在 TEM-1 基因下游插入 AvrII 限制性酶切位点的 pBR322 质粒</td></tr><tr><td>pBR322_OP1 &amp;ndash; pBR322_OP5</td><td>可按要求提供</td><td></td><td>五种经修饰的 pBR322 质粒，每种均包含一对正交引物结合位点</td></tr><tr><td>Q5 高保真 DNA 聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491L</td><td>包含 5x PCR 缓冲液和 PCR 添加剂（GC 增强剂）</td></tr><tr><td>15 ml 锥形管</td><td>Corning</td><td>430025</td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器（Eppendorf ResearchPlus）</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 孔 PCR 板</td><td>Fisher Scientific</td><td>14230232</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板密封膜</td><td>Excel Scientific</td><td>F-96-100</td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96 孔热循环仪</td><td>Applied Biosystems</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>6x 凝胶上样染料</td><td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Research Products Intl. Corp.</td><td>20090-500.0</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0433</td><td></td></tr><tr><td>紫外透射仪（FOTO/Analyst ImageTech）</td><td>Fotodyne Inc.</td><td>http://www.fotodyne.com/content/ImageTech_gel_documentation</td><td></td></tr><tr><td>EB 缓冲液</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>96 孔黑色侧壁透明底检测板</td><td>Corning</td><td>3651</td><td></td></tr><tr><td>λ 噬菌体 DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>N3011S</td><td></td></tr><tr><td>PicoGreen dsDNA 试剂</td><td>Invitrogen</td><td>P7581</td><td>双链 DNA 定量试剂，用于实验步骤 2.2.4</td></tr><tr><td>Victor 3 V 微孔板读数仪</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA 纯化试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>D4003</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Corning</td><td>3621</td><td></td></tr><tr><td>长波长紫外灯</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBUVLS-80</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖凝胶 DNA 提取缓冲液</td><td>Zymo Research</td><td>D4001-1-100</td><td></td></tr><tr><td>AatII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0117S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0174L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>EVB100 电转感受态大肠杆菌</td><td>Avidity</td><td>EVB100</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔仪（E. coli Pulser）</td><td>Bio-Rad</td><td>1652102</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔比色皿</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2089</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计（Ultrospec 3100 pro）</td><td>Amersham Biosciences</td><td>80211237</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形管</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>质粒纯化试剂盒</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740588.25</td><td></td></tr><tr><td>8 排 PCR 管条</td><td>Axygen</td><td>321-10-551</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 检测试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>双链 DNA 定量试剂</td></tr><tr><td>Qubit 检测管</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 荧光计</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠盐</td><td>Akron Biotechnology</td><td>50824296</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 试剂盒 v2（500 个循环）</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 桌面测序仪</td><td>Illumina</td><td>http://www.illumina.com/systems/miseq.html</td><td>也可使用 Illumina HiSeq 平台进行测序</td></tr><tr><td>FLASh 软件</td><td>约翰·霍普金斯大学 - 开源</td><td>http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/</td><td>用于合并下一代测序数据中成对末端读段的软件</td></tr><tr><td>AatII_F</td><td></td><td></td><td>GATAATAATGGTTTCTTAGACG&lt;br/&gt;TCAGGTGGC</td></tr><tr><td>AvrII_R</td><td></td><td></td><td>CTTCACCTAGGTCCTTTTAAAT&lt;br/&gt;TAAAAATGAAG</td></tr><tr><td>AvrII_F</td><td></td><td></td><td>CTTCATTTTTAATTTAAAAGGA&lt;br/&gt;CCTAGGTGAAG</td></tr><tr><td>AatII_OP1_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCCGTATTTCAAC&lt;br/&gt;
TGTCCGGTCTAAGAAACCATT&lt;br/&gt;
ATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP2_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCCGCTCACGGA&lt;br/&gt;
GTGTACTAATTAAGAAACCATT&lt;br/&gt;
ATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP3_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCGTACGTCTGA&lt;br/&gt;
ACTTGGGACTTAAGAAACCA&lt;br/&gt;
TTATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP4_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCCCGTTCTCGAT&lt;br/&gt;
ACCAAGTGATAAGAAACCATT&lt;br/&gt;
ATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP5_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCGTCCGTCGGA&lt;br/&gt;
GTAACAATCTTAAGAAACCAT&lt;br/&gt;
TATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>OP1_F</td><td></td><td></td><td>GACCGGACAGTTGAAATACG</td></tr><tr><td>OP1_R</td><td></td><td></td><td>CGACGTACAGGACAATTTCC</td></tr><tr><td>OP2_F</td><td></td><td></td><td>ATTAGTACACTCCGTGAGCG</td></tr><tr><td>OP2_R</td><td></td><td></td><td>AGTATTAGGCGTCAAGGTCC</td></tr><tr><td>OP3_F</td><td></td><td></td><td>AGTCCCAAGTTCAGACGTAC</td></tr><tr><td>OP3_R</td><td></td><td></td><td>GAAAAGTCCCAATGAGTGCC</td></tr><tr><td>OP4_F</td><td></td><td></td><td>TCACTTGGTATCGAGAACGG</td></tr><tr><td>OP4_R</td><td></td><td></td><td>TATCACGGAAGGACTCAACG</td></tr><tr><td>OP5_F</td><td></td><td></td><td>AGATTGTTACTCCGACGGAC</td></tr><tr><td>OP5_R</td><td></td><td></td><td>TATAACAGGCTGCTGAGACC</td></tr><tr><td>Group1_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC&lt;br/&gt;
GCTCTTCCGATCTNNNNNGC&lt;br/&gt;
ATTTTGCCTACCGGTTTTTGC</td></tr><tr><td>Group1_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG&lt;br/&gt;
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC&lt;br/&gt;
TTGCCCGGCGTCAAC</td></tr><tr><td>Group2_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC&lt;br/&gt;
GCTCTTCCGATCTNNNNNGA&lt;br/&gt;
ACGTTTTCCAATGATGAGCAC</td></tr><tr><td>Group2_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG&lt;br/&gt;
TGCTCTTCCGATCTNNNNNGT&lt;br/&gt;
CCTCCGATCGTTGTCAGAAG</td></tr><tr><td>Group3_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC&lt;br/&gt;
GCTCTTCCGATCTNNNNNAG&lt;br/&gt;
TAAGAGAATTATGCAGTGCTGCC</td></tr><tr><td>Group3_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG&lt;br/&gt;
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC&lt;br/&gt;
GCCAGTTAATAGTTTGCGC</td></tr><tr><td>Group4_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC&lt;br/&gt;
GCTCTTCCGATCTNNNNNCC&lt;br/&gt;
AAACGACGAGCGTGACAC</td></tr><tr><td>Group4_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG&lt;br/&gt;
TGCTCTTCCGATCTNNNNNGC&lt;br/&gt;
AATGATACCGCGAGACCC</td></tr><tr><td>Group5_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC&lt;br/&gt;
GCTCTTCCGATCTNNNNNCG&lt;br/&gt;
GCTGGCTGGTTTATTGC</td></tr><tr><td>Group5_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG&lt;br/&gt;
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTAT&lt;br/&gt;
ATGAGTAAACTTGGTCTGACAG</td></tr><tr><td>501_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGA&lt;br/&gt;
GATCTACACTATAGCCTACAC&lt;br/&gt;
TCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>502_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGA&lt;br/&gt;
GATCTACACATAGAGGCACA&lt;br/&gt;
CTCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>503_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGA&lt;br/&gt;
GATCTACACCCTATCCTACAC&lt;br/&gt;
TCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>504_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGA&lt;br/&gt;
GATCTACACGGCTCTGAACA&lt;br/&gt;
CTCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>505_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGA&lt;br/&gt;
GATCTACACAGGCGAAGACA&lt;br/&gt;
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一种利用高通量测序对全蛋白饱和突变文库进行功能评估的实验方案

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

定点突变长期以来被用作研究蛋白质结构、功能和进化的手段。近年来，大规模并行测序技术的进步使得能够同时评估大量突变的功能或适应性效应。本文介绍了一种利用高通量测序技术实验性地测定目标蛋白中所有可能的单氨基酸突变效应的方案，并以含有263个氨基酸的抗生素抗性酶TEM-1 β-内酰胺酶为例进行说明。在该方法中，通过定点诱变PCR构建全蛋白饱和突变文库，对每个位点分别随机化为所有可能的氨基酸。随后将文库转化至细菌中，并筛选其赋予β-内酰胺类抗生素抗性的能力。每个突变的适应性效应则通过深度测序在筛选前后文库中的变化来确定。重要的是，本方案引入了最大化测序读长深度的方法，并通过将相邻位点分组（分组长度适应高通量测序读长）以及使用正交引物对每组进行条形码标记，实现了整个突变文库的同步筛选。本文以临床上相关剂量的氨苄西林为条件，提供了应用该方案评估TEM-1中所有单氨基酸突变适应性效应的代表性结果。该方法应可轻松扩展至其他已有高通量筛选体系的蛋白质。

包含正交引物位点的五种修饰型pBR322质粒（pBR322_OP1 - pBR322_OP5）的质粒图谱如图2A所示。为验证正交引物的特异性，分别使用每对正交引物进行PCR扩增，同时加入全部五种pBR322_OP1-5质粒，或加入除与引物对应质粒外的其余质粒。结果仅在包含匹配质粒时获得正确大小的扩增产物，而在缺失该匹配质粒时未获得任何大小的产物（图2B）。
本研究按照本文所述方案进行了一次代表性实验（图1）。经过处理（方案第4.2节）后，从筛选前条件中获得6.2 × 106条读数，从50 µg/ml氨苄青霉素筛选条件下获得6.3 × 106条读数。筛选前条件下每种氨基酸突变的计数呈现出典型的对数正态分布（图3A）13。在筛选前培养物的测序结果中，98.9...

我们介绍一种利用高通量测序对蛋白质的全面单点饱和突变文库进行功能评估的实验方案。该方法的关键在于使用正交引物对实现文库构建和测序的多重扩增。文中提供了以临床相关剂量的氨苄西林筛选TEM-1 β-内酰胺酶的代表性实验结果。

定点突变长期以来一直被用作研究蛋白质结构、功能和进化的手段。近年来，随着大规模并行测序技术的进展……

本实验方案的总体目标是描述利用高通量测序技术对蛋白质的全面单一位点饱和突变文库进行功能评估的方法。该方法有助于回答生物化学和分子进化领域的关键科学问题，例如：蛋白质所受的生物化学、结构及进化约束有哪些？我们如何设计具有新功能的蛋白质？该技术的主要优势在于，通过多重化文库构建和测序，可在全蛋白饱和突变研究中最大化有用测序读段的数量。按照文本中的方案配制一块 PCR 预混液板后，使用多通道移液器将含有先前稀释的正义突变引物的 96 孔板中的 10 µL 液体转移至 PCR 板中对应的孔位。使用板封膜覆盖每个 PCR 板，并在 200 ×g 下离心 2 分钟。然后将 PCR 板转移至热循环仪中，运行以下程序。在完成额外的 PCR 并将反应产物稀释 1 至 100 倍后，从混合并稀释的第一轮诱变 PCR 产物中取 1 µL，转移至含有 Master Mix 的新 PCR 板的对应孔中。使用板封膜覆盖每个 PCR 板。在约 200 ×g 条件下离心 2 分钟。然后将板转移至热循环仪，并运行视频中先前列出的相同程序。在根据文本方案确认PCR产物大小并测定浓度后，将每个NNS亚文库PCR产物各100纳克混合，组成五个NNS亚文库组。按照文本方案进行亚文库PCR反应并对克隆载体进行PCR反应中的消化后，针对每个经消化的NNS亚文库组及其对应的经限制性酶切的克隆载体，按照以下指南设置连接反应。然后在室温下孵育一小时。将电转感受态 E.coli 细胞解冻后，取十微升细胞加入到每份纯化的连接反应体系中，混匀后转移至电穿孔杯中。在1.8千伏条件下对细胞进行电穿孔，随后加入一毫升SOB培养基，在37摄氏度下孵育一小时。然后，将每份复苏培养物取10微升重悬于990微升LB培养基中，并将其中100微升涂布于含有12微克/毫升四环素的LB琼脂平板上。每份复苏培养物，准备一个250毫升的培养瓶，加入50毫升LB培养基和50微升四环素储存液。将剩余的约1毫升复苏培养物转移至培养瓶中。在37摄氏度、200转/分钟条件下过夜培养。在计数平板上成功转化的菌落数量，并从过夜培养物中分离质粒DNA后，将每种质粒各100纳克混合在一起。按照文本方案转化DNA文库后，将文库的过夜培养物稀释至600 nm处的光密度（OD-600）为0.1，并向一个烧瓶中加入1毫升。将预筛选培养物在37摄氏度、200转/分钟条件下孵育。通过测量OD-600定期监测生长情况，直至其达到0.1。将100毫升预筛选培养物转移至两个50毫升锥形管中，在4摄氏度下以4,000 ×g离心6分钟。除去大部分上清液，并将沉淀物合并至一个15毫升的锥形管中。随后，重复离心操作，彻底去除上清液。向另外两个培养瓶中加入四环素，使其终浓度为12微克/毫升。取预筛选培养物的一定体积，使最终OD-600达到0.001。向一个烧瓶中加入1毫升浓度为50毫克/毫升的氨苄青霉素，使其终浓度为50微克/毫升。此即为筛选培养物。在37摄氏度、200 RPM条件下培养菌液时，监测不含氨苄青霉素的培养物的生长情况，直至其OD-600达到0.1。同时测定筛选培养物的OD-600。将0.1除以筛选培养物的OD-600，再乘以100，根据所得体积取菌液转移至50毫升锥形管中，在4,000 ×g、4摄氏度条件下离心6分钟。除去大部分上清液后，将沉淀合并至一个离心管中，再次离心并彻底去除上清液。为进行高通量测序，配制PCR主混合液，并向10个PCR管中各转移23 µL。向第1至第5号管中分别加入1 µL浓度为0.5 ng/µL的纯化质粒DNA，该DNA来自预筛选培养物。从筛选培养物中取样，分别加入第6至第10号离心管。将50微升浓度为50微摩尔的正向正交引物（OP1F至OP5F）与相应的反向正交引物（OP1R至OP5R）混合。按照相同顺序，各取1微升分别加入PCR管第1至第5号以及第6至第10号。将PCR管转移至热循环仪中，并运行以下程序。然后，通过将每个管中的1微升转移至99微升水中，将PCR反应稀释100倍。充分混匀后，用移液器从管中移出99微升并弃去。将50微升的正向引物和相应的反向引物混合。然后，取1微升加入第1至第5号PCR管中，再取1微升加入第6至第10号PCR管中。接着，在配制PCR主混合液后，向每个PCR管中加入23微升，并运行以下程序。为了进行最终的PCR以添加索引序列，在将PCR反应液按前述方法稀释100倍后，取1微升，加入23微升PCR预混液。对于模板来源于NNS亚文库第1至第5组的管，分别加入0.5微升的正向引物501F至505F。对于模板来源于预筛选和筛选培养物的管，加入0.5微升的反向引物701R和702R。运行与上述相同的PCR程序。然后，根据文本方案测量每个反应的浓度，将每种PCR产物各100纳克混合至同一个微量离心管中。加入6X凝胶上样染料后，将全部混合后的PCR样品上样至2%琼脂糖凝胶中。在100伏电压下电泳50分钟。使用长波长紫外灯观察并切下含有约360个碱基对PCR产物的条带。根据文本方案对样品进行纯化、测序和分析。此处展示了包含正交引物结合位点的五种修饰型 pBR322 质粒的质粒图谱。通过 PCR 检测正交引物的特异性结果表明，只有在反应中加入匹配的质粒时，才能获得正确的 PCR 产物；而在缺少相应质粒时，任何大小的产物均无法扩增出来。实验处理后，从预筛选条件中获得了 6.2 × 10⁶ 条读段，从氨苄青霉素条件中获得了 6.3 × 10⁶ 条读段。预筛选条件下每个氨基酸突变的计数呈对数正态分布。该图展示了每个突变在 TEM-1 蛋白各个位点上的相对适合度效应 FIA。其分布情况如图所示。在每毫升含50微克氨苄青霉素的选择条件下，大多数突变具有中性或接近中性的适合度效应，对应于此处的白色像素点以及此处的显著峰形。在此抗生素浓度下，只有一小部分突变对适合度具有显著影响。正如预期的那样，这些突变包括高度保守的活性位点残基内的突变。相比之下，显著呈红色的像素很少。一旦掌握，该技术大约可在一周内完成。若操作得当，且所有试剂均齐备。在进行该实验过程中，重要的是在克隆时保持条理清晰，以便将诱变PCR产物正确分组，并将其克隆至正确的载体中。在测序准备过程中，需使用正确的引物。基于本实验流程，该方案的主要步骤可进行修改，以研究突变组合、不同的筛选环境以及其他蛋白质系统，从而回答有关突变的遗传与环境背景依赖性的更多问题。观看本视频后，您应能充分理解构建全蛋白饱和突变文库所需的工作流程，以及如何利用高通量测序技术同时评估每个突变的功能效应。请注意，溴化乙锭和紫外光的使用可能存在危险，在进行本实验方案的相应步骤时，应始终采取戴手套、穿实验服和使用紫外防护罩等预防措施。

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生物学

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通过靶向测序方法进行比较性病变分析

学习利用高通量测序对蛋白质饱和诱变文库进行功能评价的方法。本方案通过多重PCR和正交引物对，最大化测序读数效率，以TEM-1 β-内酰胺酶为模型，帮助研究者深入理解蛋白质的生化结构约束与进化机制，为蛋白质工程提供重要见解。

一种利用高通量测序对全蛋白饱和突变文库进行功能评估的实验方案

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