酵母殖民地嵌入方法
2011年3月22日
嵌入酵母菌菌落，允许光学和电子显微镜切片的一种方法。此协议允许孢子细胞的分布和假菌丝细胞内提供了一个新的工具，对理解组织类型的细胞内一种真菌社会的殖民地的决心。
该程序的总体目标是包埋酵母菌落。这是通过首先从琼脂平板上去除菌落和下面的琼脂，将其放在几滴熔融琼脂上，然后迅速用更多的熔融琼脂覆盖它来实现的。接下来，从菌落中修剪多余的 AER，使其足够小以适合模具。
然后固定、染色、脱水 AER 包埋的集落，最后用刺树脂浸润。然后将块放入模具中，并加入额外的刺树脂，孵育直至硬化，然后切片。最终，可以通过光学或电子显微镜获得显示酵母菌落内细胞类型分布的结果。
与扫描电子显微镜等现有方法相比，该技术的主要优点是它允许确定菌落的内部结构。这种方法可以帮助回答微生物发育领域的关键问题，例如细胞类型在菌落内的分布。这种方法提供了对克罗斯 CAC 菌落结构的见解，但它也可能适用于其他微生物。
这种方法的视觉演示至关重要，因为从书面方案中可能很难学习克隆的处理和包埋。这种方法的想法受到我们在 2002 年发表的一些遗传数据的启发，这些数据表明孢子在菌落中的分布并不均匀。我们采用了英格堡在 fin 实验室开发的一种切片菌落的方法。
那么让我们开始吧。首先在 30 度的螺旋板上孵育野生 S visi 酵母，直到存在大约 300 个菌落。使用窄抹刀，从板中去除直径为 1 到 2 毫米的菌落，一次一个。
然后使用 1 毫升移液器人吸头将几滴 2% 琼脂在 42 摄氏度下滴在显微镜载玻片上，并在 AER 凝固之前立即将菌落正面朝上放在琼脂上。在菌落上再滴几滴琼脂，让琼脂凝固，确保整个菌落，包括菌落的顶部，都被琼脂包裹。在所有后续协议步骤中使用剃须刀片。
修剪菌落周围的 AER 并放置包含菌落的 AER 块。在含有 2% 多聚甲醛和 2% 戊二醛固定剂的 3.5 毫升硅酸盐螺旋盖小瓶中，必须一次处理一个以防止干燥，但最多可以将 10 个菌落放置在同一个小瓶中。将蜂群在 4 摄氏度下放置 7 天。
一周后，去除固定剂并洗涤农业菌落两次，使用大约 1.5 毫升 0.15 摩尔钠。在 pH 值为 7.2 下封闭，每次洗涤后在冰上孵育 15 分钟，不要搅拌。再洗两次。
使用 1.5 mL 的 1 X OS 缓冲液，由 100 毫摩尔磷酸一钾、10 毫摩尔氯化镁在 pH 6.0 下组成，每次洗涤后在冰上孵育 5 分钟。接下来，使用相同的小瓶，进行此处和本协议书面部分中列出的锇处理和洗涤。然后，再次使用相同的小瓶，在第二天清晨进行此处和随附的书面方案中列出的逐步脱水。
按照此处和随附的书面方案中所示制备 spurs 试剂。立即用 1.5 毫升 100% 室温乙醇清洗农作物块 5 次，每次 10 分钟。最后一次乙醇洗涤后，仅去除足够的乙醇，以便农业块保持覆盖。
使用牧场移液器，将大约 0.5 mL 的 spurs 试剂放入样品瓶中，并在轮子上低速旋转 15 分钟。旋转后，在室温下，让样品瓶静置 30 分钟。接下来，完全删除解决方案。
然后加入 1.5 毫升 spurs 试剂以覆盖 agri 块。同样，在室温下将样品瓶放在轮子上旋转 15 分钟，然后静置 30 分钟。重复此洗涤。
再步骤 3 次。最后 30 分钟后，去除 spurs 试剂并加入新的 spurs 试剂以覆盖模块。让农业块在室温下静置 4 小时。
更换 spurs 试剂并旋转过夜。第二天早上，更换 spurs 试剂，让样品瓶旋转至第二天。第二天早上，将 spurs 试剂放入编号的硅胶模具中，以刚好覆盖模具底部。
接下来，将农作物块放入模具中，在 60 摄氏度下孵育 4 小时。四小时后，用更多的刺、试剂加满模具，并在 60 摄氏度下孵育过夜。从模具中取出块进行切片。
这里显示了穿过野生 S Visia 酵母菌落集落中心的切片的光学显微照片示例。这种酵母是从树木分泌物中分离的野生型菌株。切片前，将菌落在 YNA 培养基上孵育 6 天。
在这张图片中，asai、pseudo hyphy 和 ovoid 酵母很容易区分，侵入底层琼脂的菌落区域也很明显。空心箭头表示代表性的 asai 实心箭头表示代表性的卵形营养细胞 实心箭头表示细长细胞链和 si。该图像是来自实验室酵母菌株 SH 1 0 2 0 和 W 3 0 3 的薄片的电子显微照片示例。
切片前，将菌落在 YNA 培养基上孵育 6 天。该图像显示了包含高频孢子细胞的集落区域。箭头表示孢子壁的双层结构。
在 A 部分中，我们显示了一个为期 4 天的菌落的一部分，其中网格由 15 个矩形叠加在 B 部分的图像上，每个矩形中孢子相关细胞的频率是移植的，其中 15 个条对应于 A 部分中显示的 15 个矩形，数据是四个独立的 4 天菌落的平均值和标准误差在 C 部分中， 显示了四个独立的 8 天菌落的均值和标准误差。一旦掌握，这项技术可以在两周内完成，其中一整天和几天一到三个小时。在尝试此过程时，请务必记住立即添加解决方案，以免块变干。按照此过程进行作。
其他方法，如免疫电子显微镜，可能用于确定表达特定蛋白质发育后的细胞分布。这项技术使我们能够不仅观察孢子细胞的模式化，还观察十字状 CCI 菌落中假菌丝细胞的模式化。观看此视频后，您应该对如何包埋酵母菌落进行切片有很好的了解。
不要忘记，该实验步骤中使用的许多显微镜试剂可能非常危险。请记得使用通风橱，穿防护服并妥善处理试剂。好了，就是这样。
感谢观看。祝你的实验好运。
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概述
本文介绍了一种嵌入酵母菌落的方法，使其能够进行光学和电子显微镜切片。该协议促进了对菌落内孢子和假菌丝细胞的分析，有助于理解真菌群落中的细胞类型组织。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 细胞生物学
- 真菌生物学
背景
- 酵母菌落展现出多样的细胞类型。
- 了解细胞分布对于研究真菌群落至关重要。
- 传统方法可能无法提供细胞组织的详细见解。
- 这种方法为可视化提供了新的方法。
研究目的
- 开发嵌入酵母菌落的协议。
- 实现细胞类型分布的详细分析。
- 增进对真菌群落组织的理解。
使用的方法
- 从琼脂板上移除酵母菌落。
- 将菌落嵌入熔融琼脂中。
- 修剪多余的琼脂以适应模具。
- 固定、染色、脱水和树脂渗透。
主要结果
- 成功嵌入酵母菌落以进行显微镜观察。
- 观察到孢子和假菌丝细胞。
- 详细分析菌落内细胞类型的分布。
- 对真菌群落组织提供新的见解。
结论
- 嵌入方法对于显微镜分析是有效的。
- 它为研究酵母菌落结构提供了宝贵的工具。
- 未来的研究可以在这一方法基础上探索真菌相互作用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding spatial organization of cell types within microbial communities supports target validation in antimicrobial and antifungal discovery. This method enables mechanistic de-risking by revealing phenotypic heterogeneity that may influence drug response and resistance development. It provides predictive confidence for early-stage screening by linking colony architecture to functional subpopulations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing sporulated and pseudohyphal cell distribution within colonies.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct observation of cell type patterning linked to functional states.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by preserving spatial relationships of cell types.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through consistent sectioning and imaging of colony interior structures.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance through visualization of invading colony regions that model microbial penetration into host tissues.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling structural correlation with phenotypic outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
Positions the method within early discovery to lead identification by enabling structural phenotyping that informs compound screening decisions.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing and pathway clarification via direct imaging of asymmetric cell distribution.
- Screening: Describes assay readiness through production of thick and thin sections compatible with light and electron microscopy.
- Analytics: Highlights quantitative outputs such as frequency mapping of sporulated cells across colony regions for comparative analysis.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by linking invasive colony fronts to tissue penetration models.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for structural analysis across multiple fungal strains and conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in microbial community behavior.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of colony preparation for multi-user microscopy pipelines.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early phenotypic de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on structural biomarkers of virulence or persistence.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in histology, microscopy, and microbial handling.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including microtomes, light and electron microscopes, and resin infiltration systems.
- Cross-team standardization requirements for fixation, staining, and sectioning protocols across microbiology and imaging groups.
- Adaptation considerations across model systems such as biofilm-forming bacteria or other yeast species with varying colony morphology.
- Practical limitations supported by source material including colony size constraints (1-2 mm diameter) and multi-day processing time requiring sterile technique to prevent contamination.
