Name: 酵母殖民地嵌入方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-22T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 学习酵母菌落包埋方法，用于微生物学与细胞生物学研究。该方案通过琼脂包埋、固定、染色和树脂渗透等步骤，实现光学与电子显微镜下的细胞类型分布分析，为真菌群落结构研究提供可靠工具。

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研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为1R15GM094770。

1. 菌落分离与固定
<ol>
<li>将300个菌落接种于琼脂培养基中，在指定时间内进行培养（单个分离菌落直径应为1-2 mm）。</li>
<li>使用窄 spatula 将菌落（正面朝上）及其下方的培养基一同刮下。</li>
<li>用1 mL移液器枪头吸取数滴42°C的2%琼脂，滴加至显微镜载玻片上，并立即在琼脂凝固前将菌落正面朝上放置其上。</li>
<li>在菌落表面再滴加数滴42°C的2%琼脂，静置使其凝固。</li>
<li>本实验后续所有步骤均需佩戴手套操作。</li>
<li>用剃须刀片修整样品块，将其放入含有2%多聚甲醛/2%戊二醛固定液的3.5 mL硼硅酸盐螺口小瓶中，于4°C固定7天。</li>
</ol>
2. 洗涤与锇处理
<ol>
<li>约1周后，在冰上化学通风橱内用0.15 M卡可基酸钠缓冲液（pH 7.2）清洗琼脂块，加入足量缓冲液完全覆盖菌落（约1.5 mL），孵育15分钟，重复两次；随后用相同体积的1×OS缓冲液（100 mM KH2PO4、10 mM MgCl2，pH 6.0）再清洗两次，每次5分钟。</li>
<li>在冰上化学通风橱中，向小瓶中加入等体积的1% OsO4 [2 mL OsO4（2%）+ 2 mL 2×OS缓冲液]，完全覆盖琼脂块，固定1小时，然后用相同体积的1×OS缓冲液清洗两次，每次10分钟。</li>
<li>将小瓶置于4°C的1×OS缓冲液中过夜。</li>
<li>本步骤中使用的所有固定剂及洗涤液均须作为危险废物处理。所有接触过OsO4的移液器均用植物油冲洗3次。</li>
</ol> 3. 清洗与脱水
<ol>
<li>次日早晨，使用巴斯德移液管，将琼脂块在冰上用与上述相同体积的冷水中洗涤两次，每次10分钟。</li>
<li>依次用相同体积的25%、50%、75%、95%乙醇各洗涤10分钟，随后用100%乙醇洗涤两次，每次10分钟。最后在4°C下用100%乙醇浸泡过夜。</li>
<li>本步骤中的所有洗涤液均应作为危险废物处理。</li>
</ol>
4. 斯珀尔树脂包埋剂制备
<ol>
<li>次日早晨（尽可能早）在通风橱内，将以下溶液（EM Sciences）称取至一次性塑料烧杯中，以配制Spurr试剂。后续使用该试剂的所有操作均需在通风橱内进行。 
（ERL 4221 溶液 5 克） 
（DER 736 溶液 4 克） 
（NSA 溶液 13 克）
</li>
<li>在通风橱内使用搅拌子缓慢混合上述溶液，持续 20 分钟。</li>
<li>加入 DMAE 溶液 0.15 克，按上述方法继续搅拌 20 分钟。</li>
<li>在通风橱内对上述混合液脱气 1–2 小时。</li>
</ol>
5. Spurr 包埋剂渗透
<ol>
<li>配制Spurr树脂后，立即用与上述相同体积的100%室温乙醇将琼脂块洗涤5次，每次10分钟。最后一次乙醇洗涤后，用巴斯德吸管吸去乙醇，使残留的乙醇刚好覆盖琼脂块。</li>
<li>加入约等体积的Spurr树脂试剂（约0.5 mL），在室温下将小瓶置于旋转轮上旋转15分钟，然后静置30分钟。30分钟后，用巴斯德吸管完全移除溶液，再加入Spurr树脂以覆盖琼脂块（约1.5 mL），在室温下旋转15分钟，静置30分钟。重复更换Spurr树脂、旋转和孵育步骤3次。</li>
<li>最后一次静置30分钟后，移除Spurr树脂，加入新鲜Spurr树脂覆盖琼脂块。让琼脂块在室温下静置4小时。</li>
<li>更换Spurr树脂后旋转过夜。</li>
<li>次日早晨更换Spurr树脂，并持续旋转至第二天。</li>
<li>第二天早晨，将Spurr树脂加入编号的硅胶模具（Fisher Scientific）中，液面刚好覆盖模具底部，然后将琼脂块放入模具中。在60°C孵育4小时。</li>
<li>4小时后，向模具中补加更多Spurr树脂至充满，然后在60°C过夜孵育。</li>
<li>若将琼脂块从模具中取出后仍稍显柔软，应将其放回模具，并额外孵育2天。</li>
</ol>
6. 切片
<ol>
<li>使用徕卡 Ultracut S 超薄切片机切割 0.5 μm 厚的切片用于光学显微镜观察，以及 0.1 μm 厚的切片用于透射电子显微镜。</li>
<li>对于光学显微镜观察，切片在切割后被置于一滴去离子水（dH2O）中，并在 52°C 的加热板上烘干。干燥后的切片用一滴 1.0% 甲苯胺蓝、1% 硼砂溶液染色 5–15 秒。染色后，立即用流水冲洗切片，干燥，滴加封片介质（KPL），盖上盖玻片并封固。</li>
</ol>
7. 代表性结果：
先前已有综述回顾了测量酵母及其他微生物中模式形成的广泛意义1。尤为值得注意的是，相较于无序的微生物群体，有序的微生物菌落具有更高的功能性。
所述方法是对一种用于包埋较大特殊菌落的方法的改进2，我们对这一方法的改进已发表过简要描述3。
图1显示了野生型S. cerevisiae酵母菌落中心切片的光学显微镜图像示例。子囊、假菌丝和卵圆形酵母细胞易于区分，菌落侵入下方琼脂的区域也清晰可见。
图2显示了一张实验室酵母菌株（W303背景）的电子显微镜照片示例。该图像来自菌落中孢子化细胞频率较高的区域。
<img src="/files/ftp_upload/2510/2510fig1.jpg" alt="显示组织细胞分布的组织学切片；经染色处理后观察。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 野生酵母菌落的光学显微镜图像。该酵母菌株（YPS133）最近从树木渗出物中分离得到4。菌落在切片前于YNA培养基中培养6天5。空心箭头指示典型的子囊，实心箭头指示典型的卵圆形营养细胞，实心箭头头指示细长细胞链（假菌丝）及子囊。
<img src="/files/ftp_upload/2510/2510fig2.jpg" alt="细菌细胞形态，电子显微镜图像，显示肽聚糖层和分裂阶段。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 实验室酵母菌株的电子显微镜观察。SH1020 菌株（W303 背景）在 YNA 培养基上培养 6 天后进行切片3。图像显示切片中子囊出现频率较高的区域。箭头指示孢子壁的双层结构。
<img src="/files/ftp_upload/2510/2510fig3.jpg" alt="孢子形成分析示意图；菌落区域、孢子形成百分比（4天和8天）、显微镜观察、柱状图" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 菌落中孢子形成细胞分布的定量分析：A) 将一个由15个沿长边相连的矩形组成的网格叠加在菌落切片图像的中央区域。在保持比例不变的情况下调整网格的大小，使其恰好覆盖菌落的顶部和底部。（B &amp; C）通过目视检查4天龄（B）和8天龄（C）菌落的图像，确定每个矩形中孢子形成细胞占该矩形内总细胞数的比例。例如，菌落顶部的矩形（标记为“1”）对应于图中左侧。结果显示了4个菌落的平均值；误差线表示标准误差。

<ol><li>Kimmel, A. R., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+symmetries%3A+regulation+of+Dictyostelium+development+through+chemoattractant+and+morphogen+signal-response%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Breaking symmetries: regulation of Dictyostelium development through chemoattractant and morphogen signal-response.</a> Curr Opin Genet Dev. 14, 540-540 (2004).</li>
<li>Palkova, Z., Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+within+a+community%3A+benefit+to+yeast+long-term+survival%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Life within a community: benefit to yeast long-term survival.</a> FEMS Microbiol Rev. 30, 806-806 (2006).</li>
<li>Shapiro, J., Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significances+of+bacterial+colony+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">The significances of bacterial colony patterns.</a> Bioessays. 17, 597-597 (1995).</li>
<li>Shapiro, J., Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinking+about+bacterial+populations+as+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Thinking about bacterial populations as multicellular organisms.</a> Annu Rev Microbiol. 52, 81-81 (1998).</li>
<li>Engelberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+stalk-like+structures+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Multicellular stalk-like structures in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Bacteriol. 180, 3992-3992 (1998).</li>
<li>Scherz, R., Shinder, V., Engelberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+analysis+of+Saccharomyces+cerevisiae+stalk-like+structures+reveals+spatial+organization+and+cell+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Anatomical analysis of Saccharomyces cerevisiae stalk-like structures reveals spatial organization and cell specialization.</a> J Bacteriol. 183, 5402-5402 (2001).</li>
<li>Piccirillo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rim101p%2FPacC+pathway+and+alkaline+pH+regulate+pattern+formation+in+yeast+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Rim101p/PacC pathway and alkaline pH regulate pattern formation in yeast colonies.</a> Genetics. 184, 707-707 (2010).</li>
<li>Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+and+Saccharomyces+paradoxus+coexist+in+a+natural+woodland+site+in+North+America+and+display+different+levels+of+reproductive+isolation+from+European+conspecifics%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics.</a> FEMS Yeast Res. 1, 299-299 (2002).</li>
<li>Piccirillo, S., Honigberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+patterning+and+invasive+growth+in+wild+and+domesticated+yeast+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sporulation patterning and invasive growth in wild and domesticated yeast colonies.</a> Res Microbiol. 161, 390-390 (2002).</li>
<li>Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+developing+multicellular+yeast+colony%3A+spatio-temporal+expression+of+Ato1p+ammonium+exporter%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter.</a> Environ Microbiol. , (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本方法可揭示菌落的内部结构。由于该方法在确定具有不同菌落形态的多种酿酒酵母（S. cerevisiae）菌株以及相关物种S. paradoxus5中细胞类型的分布模式方面均有效，因此该方法也可能适用于多种真菌及其他微生物。
该方法成功的关键步骤之一是确保在整个实验过程中，整个菌落（包括菌落顶部）都被琼脂完全包裹。菌落是否被琼脂完全包埋，可在光学显微镜切片后经甲苯胺蓝染色观察确定。在光学显微镜下观察染色切片时，琼脂培养基的染色略深于包埋介质。由于琼脂在脱水步骤中会发生收缩，为确保完整回收菌落，务必做到：1）在步骤1.2中加入4-5滴琼脂，以可靠地覆盖菌落；2）在步骤1.5中仅修整琼脂的侧面，不要修整顶部和底部，且仅修整至能够放入模具即可。
影响切片质量的另一个关键步骤是包埋介质块的硬度。通常在过夜孵育后，将包埋块从模具中取出进行检查。若用手握住并弯曲时包埋块仍具有柔韧性，则其硬度可能不足以进行切片。此时应将包埋块放回原温度的培养箱中继续孵育额外48小时，并按上述方法重新检测。...

<table><tbody><tr><td>四氧化锇</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>RT 19152</td><td></td></tr><tr><td>硅胶包埋模具</td><td>费舍尔科技公司</td><td>NC 9975029</td><td></td></tr><tr><td>脂环族环氧树脂</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>RT 15004</td><td>ERL 4221</td></tr><tr><td>环氧树脂</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>RT 13000</td><td>DER 736</td></tr><tr><td>壬烯基琥珀酸酐</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>RT 19050</td><td>NSA</td></tr><tr><td>2-二甲基氨基&amp;#8211;乙醇</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>RT 13300</td><td>DMAE</td></tr><tr><td>封片介质</td><td>KPL 公司</td><td>71-00-16</td><td></td></tr><tr><td>旋转轮</td><td>Ted Pella 公司</td><td>Pelco 1055</td><td></td></tr><tr><td>超薄切片机</td><td>徕卡显微系统公司</td><td>Ultracut S</td><td></td></tr></tbody></table>

酵母菌落包埋法

Yeast Colony Embedding Method

胚胎中不同类型细胞的空间分布是后生动物发育的关键机制之一。微生物群落（如菌落和生物膜）也表现出细胞类型的分布模式。例如，在酵母菌S. cerevisiae中，孢子化细胞和假菌丝细胞在菌落中并非均匀分布。目前对这些分布模式的功能意义及其潜在的分子机制仍知之甚少。
研究真菌菌落中细胞类型分布模式的一个挑战在于，与多细胞动物组织不同，菌落中的细胞彼此之间的连接相对较弱。特别是真菌菌落不含有大多数组织中存在的丰富细胞外基质。本文报道了一种用于包埋和切片酵母菌落的方法，该方法可揭示这些菌落内部的细胞类型分布模式。该方法可用于制备适用于光学显微镜观察的厚切片（0.5 μm）以及适用于透射电子显微镜观察的薄切片（0.1 μm）。通过光学显微镜可轻松区分子囊和假菌丝细胞与卵圆形的酵母细胞，而这些细胞的内部结构则可通过电子显微镜进行观察。
该方法基于用琼脂包围菌落，使其浸透Spurr's介质，然后进行切片。直径在1-2 mm范围内的菌落适用于本实验方案。除了可观察菌落内部结构外，该方法还可用于观察菌落侵入下层琼脂区域的结构。

一种用于包埋酵母菌落的方法，可进行切片以用于光学显微镜和电子显微镜观察。该方案可确定菌落内孢子化细胞和假菌丝细胞的分布情况，为理解真菌群落中不同类型细胞的空间组织提供了新的工具。

胚胎中不同类型细胞的空间分布模式是后生动物发育的关键机制。微生物群落，如菌落和生物膜……

本实验的总体目标是包埋酵母菌落。该过程首先从琼脂平板上取下菌落及其下方的琼脂，将其置于数滴熔融琼脂的液滴上，并迅速用更多熔融的琼脂覆盖。随后修去菌落周围多余的琼脂，使其足够小以放入模具中。随后将嵌入的AER菌落进行固定、染色、脱水，并最终用spurs树脂浸透。将样品块置于模具中，加入额外的spurs树脂，孵育至完全硬化，然后进行切片。最终可通过光学显微镜或电子显微镜观察酵母菌落内细胞类型的分布情况。与现有的扫描电子显微镜等方法相比，该技术的主要优势在于能够确定菌落的内部结构。该方法有助于回答微生物发育领域的一些关键问题，例如菌落内细胞类型的分布情况。该方法为了解藏黄链霉菌（croce CAC）菌落的结构提供了见解，但其也可能适用于其他微生物。该方法的可视化演示至关重要，因为仅通过书面方案可能难以掌握菌落的处理与包埋技术。本方法的构思源于我们于2002年发表的一些遗传学数据，这些数据表明孢子在菌落中的分布并不均匀。我们借鉴了Fin实验室中Engelberg建立的菌落切片方法，并对其进行了改进。现在开始操作。首先将野生型酿酒酵母在30摄氏度的琼脂平板上培养，直至平板上出现约300个菌落。使用窄 spatula 逐个从平板上挑取直径为1至2毫米的菌落。然后使用1毫升移液器吸头，将数滴42摄氏度的2%琼脂滴加到显微镜载玻片上，并立即在琼脂凝固前将菌落正面朝上放置于琼脂上。再向菌落上滴加数滴琼脂，静置使其凝固，确保整个菌落（包括菌落顶部）完全包裹在琼脂中。在后续所有实验步骤中使用剃刀刀片进行操作。修剪菌落周围的琼脂块，并将含有菌落的琼脂块放入一个含有2%多聚甲醛和2%戊二醛固定液的3.5毫升硼硅酸螺口小瓶中。菌落必须逐个处理，以防止干燥，但最多可将10个菌落置于同一小瓶中。将菌落在4°C下放置七天。一周后，去除固定剂，用约 1.5 毫升 0.15 摩尔的钠溶液在 pH 7.2 条件下将农杆菌菌落清洗两次，每次清洗后置于冰上孵育 15 分钟，不进行震荡。随后再重复清洗两次。使用1.5毫升一倍浓度的OS缓冲液（含100毫摩尔/升磷酸二氢钾、10毫摩尔/升氯化镁，pH 6.0），每次洗涤后于冰上孵育5分钟。接下来，使用同一离心管，进行此处及本实验方案文字部分列出的锇处理及洗涤步骤。然后，再次使用同一离心管，在第二天清晨尽早完成此处及配套书面方案中列出的梯度脱水步骤。按此处及随附的书面方案制备spurs试剂。立即用1.5毫升100%室温乙醇对agri块进行五次洗涤，每次10分钟。最后一次乙醇洗涤后，仅去除足够的乙醇，使agri块仍被覆盖。使用移液管，向小瓶中加入约 0.5 毫升的 Spurs 试剂，在轮转仪上低速旋转 15 分钟。室温下旋转结束后，静置小瓶 30 分钟。随后，完全移除溶液。然后加入 1.5 毫升 Spurs 试剂以覆盖琼脂块。再次将离心管置于旋转轮上，在室温下旋转 15 分钟，静置 30 分钟。重复此洗涤步骤。重复上述步骤三次。最后一次30分钟结束后，移除SPURS试剂，并加入新鲜的SPURS试剂以覆盖组织块。让凝胶块在室温下静置4小时。更换Spurs试剂并旋转过夜。次日早晨，再次更换Spurs试剂，并使离心管持续旋转至次日。次日早晨，将Spurs试剂加入编号的硅胶模具中，用量以刚好覆盖模具底部为宜。接下来将琼脂块放入模具中，在60摄氏度下孵育4小时。4小时后，向模具中补充更多的琼脂、试剂，并在60摄氏度下继续孵育过夜。孵育结束后，从模具中取出琼脂块用于切片。此处展示了一张通过野生型酿酒酵母菌落中心部分的光学显微照片。该酵母菌株为从树木渗出物中分离得到的野生型菌株。菌落在切片前于YNA培养基中培养六天。在此图像中，阿萨伊酵母、假丝状酵母和卵圆形酵母易于区分，菌落侵入下方琼脂的区域也清晰可见。开放箭头指示典型的阿萨伊酵母，实心箭头指示典型的卵圆形营养细胞，实心箭头指示拉长细胞链及SI。该图像为实验室酵母菌株SH 1 0 2 0和W 3 0 3背景下的薄切片透射电子显微照片示例。该菌落在切片前于YNA培养基中培养了六天。图像显示菌落中一个含有高频率孢子细胞的区域。箭头指示孢子壁的双层结构。在A部分中，我们展示了一个四天菌落的区域，其中B部分的图像上叠加了一个由15个矩形组成的网格。每个矩形中与孢子相关的细胞出现频率以柱状图形式表示，15个柱子对应A部分所示的15个矩形。数据来自四个独立培养四天的菌落，取均值及标准误。在C部分中，展示了四个独立培养八天菌落的均值及标准误。一旦掌握该技术，可在两周内完成，包括一个完整工作日及数个一至三小时的工作时段。在进行该操作时，需注意立即加入溶液，以防组织块干燥。完成该操作步骤后。其他方法，例如免疫电子显微镜技术，可能用于确定特定蛋白质表达细胞在其发育后的分布情况。该技术使我们不仅能够观察孢子化细胞的排列模式，还能观察克鲁兹假丝酵母（croce CCI）菌落中假菌丝细胞的排列模式。观看本视频后，您应能够充分理解如何包埋酵母菌落以进行切片。请务必注意，本实验方案中使用的许多显微镜试剂可能具有极高危险性。请务必使用通风橱，穿戴防护服，并妥善处理试剂。好了，就这些。感谢观看。祝您的实验顺利。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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