DNA微阵列:样品的质量控制，阵列杂交和扫描

该程序的总体目标是使用自动混合器设备进行微阵列实验。这是通过在 RNA 扩增和标记后首先使用生物分析仪分析 RNA 样品的质量来实现的。将 RNA 样品与微阵列杂交。

最后，洗涤和扫描杂交微阵列。最终，通过分析双色荧光微阵列图像获得显示 RNA 转录本差异表达的结果。这种方法的视觉演示至关重要，因为由于专用设备，微阵列杂交步骤很难学习。

质量控制分析从按照书面程序中的指示准备 2， 100 生物分析仪仪器和芯片启动站开始。然后，将 550 μL 移液到 RNA 6， 000 nano 试剂盒离心机提供的离心过滤器中，过滤凝胶基质。过滤器在室温下以 1， 500 RCF 保存 10 分钟。

然后将过滤后的凝胶分装成 65 微升等分试样，可在 4 摄氏度下储存长达一个月。涡旋染料浓缩液 10 秒，然后向 65 微升等分试样中加入 1 微升。将混合物涡旋后，在室温下以 13， 000 RCF 离心 10 分钟以运行样品。

首先将芯片放在启动站上。在这个演示中，使用了 RNA 6， 000 纳米芯片。将 9 微升凝胶染料混合物加载到标有黑色背景上白色 G 的孔中。

移液器尖端位于孔的最底部。将注射器柱塞置于 1 毫升处，并关闭灌注站。缓慢但稳定地向下按压柱塞，直到它被夹子固定住。

30 秒后，松开夹子，让柱塞上升几秒钟。柱塞停止后，将柱塞拉回 1 毫升位置并打开灌注站。加载 9 微升凝胶模具。

在两个孔中混合。标记 G.然后将 5 微升标记物放入分子量标准孔和 12 个样品孔中的每一个。接下来，将 1 微升变性分子量标准品加入分子量标准品孔中，将每个变性样品 1 微升加入样品孔中。

最后，向每个未使用的样品中加入 1 微升标记物。加载完毕后，以 2， 400 RPM 的速度涡旋芯片 1 分钟。启动 2， 100 Expert 软件后，定位芯片并合上盖子。

确保选择正确的端口，并在上样后 5 分钟内运行分析，以防止蒸发。进行 RNA 扩增和标记的方法可在书面实验步骤中找到。标记后，纯化 CRNA 以去除任何未掺入的核苷酸使用 cogens r an easy mini 柱，然后可以使用 NanoDrop 2000 光谱光度计定量标记的 CRNA。

在微阵列芯片测量模式下，记录样品浓度、产量和比活性。对于微阵列杂交，必须在微阵列杂交前至少两小时达到至少 825 ng 的产量和每微克至少 8 皮摩尔的比活性。打开杂交站并设置为 65 摄氏度。

该方案描述了使用安捷伦 4 x 40 4K 阵列与 Roche nimble gen 杂交系统和四个混合室，然后按照书面方案中的说明进行 CRNA 碎裂，准备杂交室。将微阵列载玻片放在组装拆解工具条形码侧。首先打开 A 4 混合器，露出固定阵列和组件拆卸工具的粘合剂，以防止任何移动。

将 A 4 混合器从远端开始放在载玻片上。确保它与工具正确对齐，并沿阵列粘附混合器。从混合器末端滑动拉动以卸下滑动混合器组件。

使用编织工具，沿粘合垫圈按压，以确保其紧紧粘附在载玻片上。在深色背景下，可以看到被困在胶粘剂和载玻片之间的小气泡。花额外的时间用 braying 工具去除这些气泡。

数组现在已准备好加载。使用外置活塞式移液器加载 100 μL 杂交样品。将吸头紧紧推入舷窗内，缓慢平稳地分配，以免空气滞留在阵列区域。

当样品覆盖整个阵列并且液体开始从排气口流出时，快速取出移液器，仅松开柱塞。一旦尖端离开载玻片，轻轻擦拭两个端口的多余液体，注意不要将样品从腔室中抽出。然后用镊子用贴纸盖住舷窗。

将载玻片放在杂交站上，检查气囊孔是否正确定位在 O 形环上。这将确保在杂交过程中正确混合。合上滑盖和工作站盖。

将工作站设置为混合模式 B，并在 65 摄氏度下杂交阵列 17 小时。用洗涤缓冲液 1 完成标记为 A 的填充玻璃皿后，培养皿应足够大，以容纳组装拆卸工具并允许进行一些作。所有洗涤都应在玻璃器皿中进行，因为塑料往往会浸出化合物，从而导致阵列中的高背景。

将载玻片架和搅拌棒放入染色皿中。标记为 B，在培养皿中加入覆盖架子的洗涤缓冲液 1，然后将培养皿在室温下放在搅拌板上。此外，将搅拌棒加入标有 C 的空染色皿中，并放在搅拌板上。

从杂交站中取出阵列并将其放入组装拆卸工具中。将整个组件浸入盘中，同时用一只手握住组件拆卸工具和相对两侧的滑块。小心地撕下 A 4 混合器，注意不要划伤阵列区域。

快速将玻片放在架子和染色皿上 B.由于 SCI 五染料对臭氧敏感，因此应尽量减少与空气的接触。以中速搅拌清洗抹布 1 分钟。用预热洗涤缓冲液 2 填充染色皿 C。

转移玻片并洗涤 1 分钟。非常缓慢地洗涤后，从染色皿 C 中取出载玻片架，以尽量减少载玻片上留下的液滴。旋转 2 分钟，使玻片干燥。

然后将载玻片放入 50 毫升锥形管中，并立即使用分子设备的 gene picks 4， 000 B 扫描仪填充氩气扫描，以避免显示信号丢失。以下是从人脑中分离的四个 RNA 样品的示例。在 RNA 6， 000 芯片上使用 2， 100 生物分析仪评估肿瘤组织样本质量。

实心箭头和空心箭头分别表示 18 个 s 和 28 个 S-R-R-N-A 物种的位置。RNA 完整性值或 RIN 是 RNA 质量、质量、总计的定量衡量标准。当在生物分析仪中运行时，RNA 样品应仅产生两个主要峰，以进行对应于两种主要核糖体 RNA 种类的质量控制。

一些 RNA 降解将在第一个核糖体 RNA 峰之前显示为弥散条带，而 28 个 S-R-R-N-A 严重降解的峰明显较低。低质量 RNA 在低保留时间下会出现一个宽峰或一系列峰。而两个核糖体 RNA 峰的强度非常低或根本无法识别。

高质量的阵列应该在相对较低的 PMT 值下产生高信号。预计大多数转录本在实验样本和参考样本中以相似的水平存在。基因表达的大规模广泛变化可能没有任何生物学意义。

因此，数组的大部分应显示为黄色，而不是绿色或红色。高质量的信号也应该处于动态范围内，以便信号直方图完全重叠，如阵列图像的散点图所示。观看此视频后，您应该对如何使用自动杂交装置进行微阵列实验有很好的了解。