Name: DNA微阵列:样品的质量控制，阵列杂交和扫描 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-15T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 学习DNA微阵列实验的完整流程，包括RNA样品质量控制、生物分析仪检测、杂交反应和双色荧光扫描技术。掌握自动化混合设备操作，获取可靠的基因表达差异数据。

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5 minutes

本工作获得了詹姆斯·S·麦克唐纳基金会21世纪奖计划向 E. D. 提供的资助，以及美国国立卫生研究院（NIH）主任新创新者奖的支持。G. A. B. 部分由加州再生医学研究所的博士后奖学金资助。

1. 使用 2100 生物分析仪对 RNA 样本进行质量控制分析
开始之前，
<ol>
	<li>将DNA标记物和样品在70 °C下变性10分钟，立即置于冰上冷却。</li>
	<li>用RNaseZAP清洁仪器电极1分钟，再用无RNase的水冲洗10秒。让电极自然风干。</li>
	<li>用移液器将550 μl凝胶基质加入试剂盒提供的离心过滤柱中，于室温下以1,500 RCF离心10分钟。将过滤后的凝胶分装成每份65 μl，于4°C保存，可保存长达1个月。</li>
	<li>准备芯片预处理工作站：
	<ol class="lalpha">
		<li>将1 ml注射器穿过夹子并插入鲁尔锁接头中。</li>
		<li>松开基座下方的螺丝，抬起基板并将其调整至C位置，然后重新拧紧螺丝。</li>
		<li>将注射器夹子调整至顶部位置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将染料浓缩液平衡至室温，涡旋振荡10秒。向65 μl过滤后的凝胶中加入1 μl染料，充分涡旋混匀，并于室温下以13,000 RCF离心10分钟。配制后应在一天内使用。 
	当准备开始运行样品时，</li>
	<li>将芯片放置在预处理工作站上。本实验方案使用RNA 6000 nano芯片。加载凝胶步骤如下：
	<ol class="lalpha">
		<li>将9 μl凝胶-染料混合液加入背景为黑色、标有白色“G”的孔中。确保移液枪头位于孔的最底部。</li>
		<li>将注射器活塞调整至1 ml位置，关闭预处理工作站，确保其已咔嗒锁定。</li>
		<li>缓慢而稳定地按压活塞，直至被夹子固定住。</li>
		<li>等待30秒，松开夹子。</li>
		<li>让活塞自动上升，待其停止移动后，等待数秒，再将活塞拉回至1 ml位置。打开预处理工作站。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向两个标有“G”的孔中各加入9 μl凝胶-染料混合液。</li>
	<li>向12个样品孔及标记物孔中各加入5 μl标记物。</li>
	<li>向标记物孔中加入1 μl已制备好的DNA标记物。</li>
	<li>向各个样品孔中加入1 μl样品。</li>
	<li>向所有未使用的样品孔中各加入1 μl标记物。</li>
	<li>将芯片在2,400 rpm下涡旋振荡1分钟。</li>
	<li>运行芯片：
	<ol class="lalpha">
		<li>启动2100 Expert软件。</li>
		<li>将芯片放入仪器并关闭盖子。若仪器处于在线状态，图标将显示盖子是否关闭以及插入的芯片类型。请确认已选择正确的端口。</li>
		<li>在加样后5分钟内开始检测，以防止样品蒸发。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 扩增与标记
为进行微阵列分析，需对RNA样本进行扩增和标记，通常采用基于T7 RNA聚合酶的反应3。首先通过逆转录生成双链cDNA，再将cDNA用于体外转录反应，生成称为cRNA的产物。该反应在标记的核糖核苷酸存在下进行，可产生微克量级的标记RNA，用于微阵列杂交。扩增与标记方法的选择取决于后续所使用的微阵列平台。在本节中，我们描述使用Agilent公司的Quick Amp标记试剂盒生成荧光标记RNA的过程。
<ol>
	<li>在1.5 ml离心管中加入50 ng至5 μg的RNA。体积不应超过8.3 μl。如有必要，可通过真空离心或乙醇沉淀浓缩RNA样品。</li>
	<li>加入1.2 μl T7引物。</li>
	<li>用无RNase的水补至终体积11.5 μl。</li>
	<li>在65°C孵育10分钟以变性RNA。建议使用带加热盖的热循环仪，防止管盖内壁产生冷凝水。</li>
	<li>在10分钟孵育期间，将5X第一链缓冲液在80°C预热5分钟。涡旋混匀后短暂离心。之后置于室温备用。</li>
	<li>10分钟孵育结束后，迅速将变性的RNA样品置于冰上冷却。</li>
	<li>配制cDNA预混液。每反应体系加入以下组分：
	<ol class="lalpha">
		<li>4 μl 5X第一链缓冲液</li>
		<li>2 μl 0.1 M DTT</li>
		<li>1 μl 10 mM dNTPs</li>
		<li>1 μl MMLV-RT酶</li>
		<li>0.5 μl RNase Out。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过轻轻翻转离心管4次混匀组分。切勿涡旋。短暂离心使液体沉至管底。</li>
	<li>每份样品加入8.5 μl预混液。通过移液器吹打混匀。</li>
	<li>在40°C孵育2小时，随后在65°C孵育10分钟。建议使用带加热盖的热循环仪。</li>
	<li>将离心管转移至冰上放置5分钟。</li>
	<li>配制转录预混液。每反应体系加入以下组分：
	<ol class="lalpha">
		<li>15.3 μl无核酸酶水</li>
		<li>20 μl 4X转录缓冲液</li>
		<li>6 μl 0.1 M DTT</li>
		<li>8 μl NTPs</li>
		<li>6.4 μl 50% PEG（PEG应预先在40°C预热，并涡旋以确保充分重悬）</li>
		<li>0.5 μl RNase Out</li>
		<li>0.6 μl无机焦磷酸酶</li>
		<li>0.8 μl T7 RNA聚合酶</li>
		<li>2.4 μl Cy3-或Cy5-CTP</li>
	</ol>
	</li>
	<li>短暂离心样品，使液体沉至管底。</li>
	<li>每份样品加入60 μl转录预混液。</li>
	<li>在40°C孵育2小时。</li>
	<li>加入20 μl无RNase水。</li>
	<li>纯化标记的cRNA，以去除未掺入的核苷酸。建议使用Qiagen的RNeasy mini柱。</li>
	<li>定量标记的cRNA。建议使用NanoDrop2000分光光度计的微阵列测量模式。请确保选择RNA-40作为样品类型。</li>
	<li>记录样品浓度、产量（浓度乘以体积计算）和比活性（以染料浓度除以cRNA浓度再乘以1000计算）。用于微阵列杂交时，产量需至少达到825 ng，比活性需至少达到8 pmol/μg。</li>
</ol>
3. 微阵列杂交
<ol>
	<li>打开杂交仪，并在杂交开始前至少2小时将温度设定为65°C。</li>
	<li>准备杂交样品：在1.5 ml离心管中混合以下组分：
	<ol class="lalpha">
		<li>825 ng Cy3-cRNA（通常为“处理”样品）</li>
		<li>825 ng Cy5-cRNA（通常为“对照”样品）</li>
		<li>11 μl 10X封闭剂</li>
		<li>加入无RN酶水至终体积为52.8 μl</li>
		<li>加入2.2 μl片段化缓冲液</li>
	</ol>
	</li>
	<li>低速涡旋振荡以混匀。</li>
	<li>在60°C下精确孵育30分钟。此为cRNA片段化步骤，用于生成适用于芯片杂交的标记片段。严格按照所述条件孵育至关重要。建议使用带加热盖的热循环仪。精确孵育对于生成正确平均长度的探针极为关键。过度或不足的片段化将导致假阴性或假阳性结果。</li>
	<li>加入55 μl 2X杂交缓冲液以终止片段化反应。通过移液混匀，特别注意避免引入气泡。</li>
	<li>以最大转速离心1分钟，使管内液体沉降至管底。若观察到气泡，应延长离心时间以去除气泡。</li>
	<li>将离心管置于冰上，并避光保存。应尽快将样品加载至芯片上。</li>
	<li>加载芯片前，首先准备杂交室。本方案描述了使用Agilent 4x44K芯片配合Roche-Nimblegen杂交系统及A4混匀室的操作流程。
	<ol class="lalpha">
		<li>将微阵列芯片放入装配/拆卸工具中，条形码一侧朝前。</li>
		<li>打开A4混匀室并暴露其粘合面。固定芯片及装配/拆卸工具以防止移动，从远端开始将A4混匀室贴附到芯片上。确保其与工具正确对齐，并沿整个芯片表面完全粘合。</li>
		<li>从混匀室末端轻轻拉出，取下芯片与混匀室的组装体。</li>
		<li>使用压片工具沿粘合垫圈全长加压，确保其牢固粘附于芯片表面。在深色背景下可观察到粘合面与芯片之间夹带的小气泡。请额外花时间使用压片工具彻底去除这些气泡。此时芯片已准备好进行样品加载。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用正向置换移液器加载100 μl杂交样品。将枪头紧密插入进样口孔中，然后缓慢平稳地排液，避免在芯片区域中截留空气。切勿尝试将样品吸回。当全部样品排完后，保持枪头停留在进样口孔上，不要松开按钮。当样品完全覆盖整个芯片且液体开始从通气孔溢出时，迅速移开移液器。只有在枪头离开芯片表面后方可松开按钮。</li>
	<li>轻轻吸去两个端口处的多余液体。注意不要将样品从杂交室内抽出。</li>
	<li>使用镊子将贴纸覆盖在两个端口孔上。</li>
	<li>将芯片放置于杂交仪中，检查气囊孔是否准确对准O型密封圈位置。这将确保杂交过程中充分混匀。</li>
	<li>关闭芯片盖和仪器盖板，将仪器设置为B模式混匀。</li>
	<li>在65°C下杂交17小时。</li>
	<li>通过加入Triton X-102至终浓度0.005%，配制洗涤缓冲液2。于37°C过夜保存。</li>
</ol>
4. 芯片洗涤
<ol>
	<li>向洗涤缓冲液1中加入Triton X-102，使其终浓度为0.005%。室温保存。</li>
	<li>杂交完成后，用洗涤缓冲液1填充玻璃皿“A”。该器皿应足够大，能够容纳组装/拆卸工具并留有操作空间。所有洗涤步骤均应在玻璃器皿中进行。避免使用塑料器皿，因其可能析出化合物，导致芯片背景信号升高。</li>
	<li>将一个载片架和一根搅拌子放入染色皿“B”中，加入洗涤缓冲液1，确保液面完全覆盖载片架。置于搅拌台上，室温下搅拌。</li>
	<li>在空的染色皿“C”中放入一根搅拌子，并将其置于搅拌台上。</li>
	<li>取出芯片，将其放入组装/拆卸工具中。将整个装置浸入器皿“A”中。</li>
	<li>用一只手分别握住组装/拆卸工具和载片的两侧，小心地剥离A4混合器。注意不要划伤芯片区域。</li>
	<li>迅速将载片放入染色皿“B”中的载片架内。此后应尽量减少暴露于空气中的时间，因为Cy5染料对臭氧敏感。每次洗涤的芯片数量不应超过8片。</li>
	<li>中速搅拌洗涤1分钟。</li>
	<li>用预热的洗涤缓冲液2填充染色皿“C”，转移载片并洗涤1分钟。</li>
	<li>非常缓慢地将载片架从染色皿“C”中取出，以尽量减少残留在载片上的液滴。</li>
	<li>通过离心2分钟干燥载片。若无合适的离心机，可将载片置于50 ml锥形管中离心，或用氩气吹干。</li>
	<li>将载片放入50 ml锥形管中，并通入氩气。应立即进行扫描以避免信号损失。我们推荐使用Molecular Devices公司的GenePix 4000B扫描仪。</li>
</ol>
5. 代表性结果：
高质量的总RNA样品在生物分析仪上进行质量检测时，应仅出现两个主要峰，分别对应两种主要的核糖体RNA。部分RNA降解会在第一个核糖体RNA峰之前呈现为弥散的拖尾。严重降解或低质量的RNA则在低保留时间处表现为宽峰或一系列小峰，同时两个核糖体RNA峰的强度会极低，甚至无法识别。有关2100生物分析仪结果的示例，请参见图1。
Expert 2100 软件将计算 RNA 完整性数值（RIN），作为 RNA 质量的定量指标。RIN 值高于 9 的高质量样品显然最适合用于微阵列分析。然而，我们曾使用 RIN 值低至 5.2 的样品，仍获得了质量合理的微阵列数据。
高质量的芯片应能在相对较低的PMT值下产生高信号。在本实验中，大多数转录本在实验样本与参照样本中的表达水平应相近；若出现大范围、显著的基因表达变化，则可能缺乏生物学意义。因此，芯片的大部分区域应呈现黄色，而非绿色或红色。高质量的信号还应具有动态范围，使得信号直方图能够完全重叠。示例见图2。
<img src="/files/ftp_upload/2546/2546fig1.jpg" alt="RNA完整性分析：四张电泳图，RIN值分别为9.0、5.4、2.7、2.2；质量评估。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 从人脑肿瘤组织中分离的四个RNA样本示例。RNA按照3.1.1节所述方案进行提取，并在3.1.3节所述的RNA 6000芯片上使用2100 Bioanalyzer评估样本质量。这些样本代表了四种不同RNA质量：A，高质量RNA（RIN＞9）；B，部分降解RNA（RIN 5–6，注意28S rRNA峰显著降低）；C，高度降解RNA（RIN＜3）；D，几乎完全降解RNA（RIN=2）。我们已成功将质量与B类相似或更优（RIN＞5.2）的样本用于后续微阵列分析。实心和空心箭头分别指示18S和28S rRNA条带的位置。
<img src="/files/ftp_upload/2546/2546fig2.jpg" alt="DNA 微阵列分析；图像阵列、样品密度、荧光数据；比较基因组学图谱。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 阵列图像和散点图示例。A，整张芯片预览图，显示 Agilent 4×44K 格式的四个阵列；B，其中一个阵列区域的高分辨率扫描图像，注意两种信号（红色或绿色）均无明显主导；C，B 图图像的散点图，可见信号完全重叠，且达到饱和强度的特征点不超过 1×10-6 个。

<ol><li>Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+Decade+Later%3A+What+has+Gene+Expression+Profiling+Told+us+About+Neuronal+Cell+Types%2C+Brain+Function+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">One Decade Later: What has Gene Expression Profiling Told us About Neuronal Cell Types, Brain Function and Disease.</a> Curr Genomics. 10, 318-318 (2009).</li>
<li>Barisone, G. A. Expression profiling in Neuroscience, edited by Ioannis Karamanos. , SPRINGER SCIENCE+BUSINESS MEDIA, LLC. New York. (2010).</li>
<li>Gelder, R. N. V. an <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 1663-1663 (1990).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

利用DNA微阵列进行表达谱分析，可提供一种直接的方法来鉴定两种生物样品之间差异表达的基因。成功的表达谱实验需要高质量的RNA样品、稳定的标记和杂交过程。根据我们的经验，安捷伦（Agilent）提供的商用微阵列和标记试剂盒能够在合理成本下获得高质量的数据。尽管安捷伦也提供其配套的杂交与扫描设备，但我们更倾向于使用罗氏-尼姆布根（Roche-Nimblegen）的杂交系统以及分子器件公司（Molecular Devices）的GenePix 4000B微阵列扫描仪。请注意，罗氏-尼姆布根的杂交仪此前被称为MAUI杂交系统。在罗氏公司近期完成企业并购后，A4型号的混匀器已停止生产。在撰写本文时，仍可通过其他供应商（如Kreatech Diagnostics（<a href="http://www.kreatech.com/">www.kreatech.com</a>））获取该设备（该网站还提供便捷的微阵列兼容性工具），但其长期供货情况尚不确定。其他杂交系统也可获得（例如来自安捷伦的产品）；然而，如果能够为所用微阵列找到兼容的混匀器，我们仍推荐使用罗氏-尼姆布根系统，因其具有优异的质量和可重复性。

<table><tbody><tr><td>2100 生物分析仪</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2943CA</td><td>包含芯片预处理站、涡旋振荡器、软件和笔记本电脑</td></tr><tr><td>2100 生物分析仪电泳组件</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2947CA</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano 试剂盒</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td>包含大小标记物、标记试剂、凝胶基质、染料、电极清洁剂、离心过滤器和纳米芯片</td></tr><tr><td>RNase Zap</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM9780M</td><td></td></tr><tr><td>快速扩增标记试剂盒，双色</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-0444</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy 小量试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>基因表达杂交试剂盒</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-542</td><td>包含封闭剂、片段化缓冲液和杂交缓冲液</td></tr><tr><td>基因表达洗涤缓冲液试剂盒</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-5327</td><td>包含洗涤缓冲液 1 和 2 以及 Triton X-102</td></tr><tr><td>杂交仪</td><td>Roche Group</td><td>05223652001</td><td>4 片载玻片型号</td></tr><tr><td>杂交系统配件试剂盒</td><td>Roche Group</td><td>05327695001</td><td>包含用于混合测试的验证组件、替换用 O 型圈、拆卸工具、镊子和压辊</td></tr><tr><td>A4 混合式杂交室</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>全人基因组（4x44）寡核苷酸微阵列</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4112F</td><td></td></tr><tr><td>正向置换移液器</td><td>Gilson, Inc.</td><td>F148504</td><td></td></tr><tr><td>正向置换移液器用毛细活塞</td><td>Gilson, Inc.</td><td>F148415</td><td></td></tr><tr><td>微阵列干燥仪</td><td>Nimblegen</td><td>05223636001</td><td></td></tr><tr><td>微阵列荧光扫描仪，Axon GenePix 4000B</td><td>Molecular Devices</td><td>GENEPIX4000B</td><td></td></tr><tr><td>GenePix Pro 6.0 软件</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dna 微阵列：样品质量控制、芯片杂交与扫描

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

神经系统微阵列表达谱分析为鉴定不同发育阶段、不同生理或病理状态、对治疗的反应，以及通常任何正在实验性测试的条件下的基因活性提供了一种强有力的方法1。神经组织的表达谱分析需要高质量RNA的分离、RNA扩增以及与DNA微阵列的杂交。本文中，我们描述了从脑肿瘤组织进行可重复微阵列实验的方案2。首先，我们将使用安捷伦（Agilent）2100 Bioanalyzer的“芯片实验室”技术对分离的RNA样本进行质量控制分析。高质量的RNA样本是任何微阵列实验成功的关键，而2100 Bioanalyzer可快速、定量地评估样本质量。随后通过逆转录生成cDNA，并在体外转录过程中加入标记的核苷酸，从而对RNA样本进行扩增和标记，产生标记的cRNA。使用双色标记试剂盒，我们将实验样本用Cy3标记，参考样本用Cy5标记。两个样本将被混合后共同杂交至安捷伦4×44 K微阵列。双色微阵列的优势在于可直接比较两种RNA样本，从而提高测量的准确性，特别是对于表达水平的微小变化，因为两种RNA样本是竞争性地杂交到同一张微阵列上。微阵列将在两个对应的波长下进行扫描，每个特征点的Cy3与Cy5信号比值将作为相应mRNA相对丰度的直接测量指标。该分析可鉴定出在所测试实验条件下差异表达的基因。

我们展示了利用DNA微阵列对神经系统进行表达谱分析的方法。本文描述了RNA质量控制、样品标记以及芯片杂交和扫描过程。

DNA 微阵列：样品质量控制、芯片杂交与扫描

神经系统微阵列表达谱分析为鉴定不同发育阶段的基因活性提供了一种强大的方法，……

本实验的总体目标是使用自动化混样装置进行微阵列实验。首先在RNA扩增和标记后，利用生物分析仪分析RNA样品的质量，然后将RNA样品杂交至微阵列上。最后，对杂交后的微阵列进行洗涤并扫描。最终通过双色荧光微阵列图像分析，获得显示RNA转录本差异表达的结果。由于该实验涉及专用设备，微阵列杂交步骤难以掌握，因此本方法的可视化演示至关重要。质量控制分析首先按照书面规程准备2,100生物分析仪和芯片预处理工作站。然后，使用RNA 6,000 nano试剂盒中提供的离心柱，将550微升凝胶基质通过移液加入旋转滤器中。在室温下以1,500 RCF离心10分钟。然后将过滤后的凝胶分装成每份65 µL，可在4 °C下保存长达一个月。将染料浓缩液涡旋震荡10秒，取1 µL加入一份65 µL的凝胶中。将混合物充分涡旋后，于室温下以13,000 ×g离心10分钟，所得滤胶即可用于上样。首先将芯片放置在上样工作站上。本演示中使用的是 RNA 6,000 nano 芯片。在黑色背景上标有白色 G 的加样孔中加入 9 µL 凝胶染料混合物。将移液管吸头置于孔板最底部。将注射器活塞定位在1毫升处，并关闭引液站。缓慢而稳定地按压活塞，直至其被卡扣固定。30 秒后，松开夹子，让推杆上升几秒钟。待推杆停止后，将推杆拉回至 1 毫升位置，打开预灌注站。加入 9 µL 的凝胶染料。在两个孔中分别混匀。取五微升标记物加入到加样孔以及12个样品孔中。接着，将一微升变性的DNA标准品加入加样孔，每个变性样品各取一微升加入相应的样品孔中。最后，向每个未使用的样本中加入一微升的标记物。上样完成后，以 2,400 转/分钟的速度涡旋震荡芯片一分钟。启动 2,100 expert 软件后，将芯片放入仪器指定位置并关闭盖子。确保选择正确的端口，并在加样后五分钟内运行检测，以防止蒸发。RNA扩增和标记的操作方法详见书面实验方案。标记完成后，纯化cRNA以去除未掺入的核苷酸；使用Cogens的简易小柱，可用NanoDrop 2000分光光度计对标记后的cRNA进行定量。在微阵列检测模式下，记录样品浓度、得率和比活性。进行微阵列杂交前，至少需要提前两小时达到最低825纳克的得率和每微克至少8皮摩尔的比活性。打开杂交仪，并将其温度设置为65摄氏度。本方案描述了使用安捷伦四乘40 4K芯片与罗氏NimbleGen杂交系统以及四个混合室的操作流程。在按照书面方案完成cRNA片段化后，准备杂交室。将微阵列芯片放入装配/拆卸工具中，条形码面向上。首先打开一个A4混合室，暴露固定芯片的粘合层，并使用装配/拆卸工具以防止任何移动。将A四通道混样器从远端开始放置在载玻片上。确保其与工具正确对齐，并沿阵列粘附混样器。从混样器末端滑动，取下载玻片与混样器组件。使用压边工具，沿粘合垫圈的整个边缘按压，以确保其与载玻片紧密粘合。粘合剂与载玻片之间被困住的小气泡在深色背景下可见。请额外花时间用压边工具将这些气泡去除。芯片现在已准备就绪，可以加样。使用正向置换移液器加入100 µL杂交样品。将吸头紧紧插入加样孔内，缓慢而平稳地 dispensing，以避免在芯片区域滞留气泡。当样本覆盖整个阵列且液体开始从通气孔快速流出时，立即移开移液器，但不要释放活塞。待吸头离开载玻片后，轻轻吸取两个孔处的多余液体，注意不要将样本从反应腔内吸出。然后使用镊子将贴纸覆盖在孔口上。将玻片放入杂交仪，检查气囊孔是否准确对准O型环。这将确保杂交过程中充分混匀。关闭玻片盖和仪器盖。将仪器设置为混合模式B，在65摄氏度下杂交芯片17小时。杂交完成后，用洗涤缓冲液一填充标记为A的玻璃皿，该玻璃皿应足够大，能够容纳组装/拆卸工具，并留有操作空间。所有洗涤步骤均应使用玻璃器皿，因为塑料器皿容易析出化合物，导致芯片背景信号升高。将一个载玻片架和一根搅拌子放入标记为B的染色缸中，加入洗涤缓冲液至浸没载玻片架，然后将染色缸置于室温下的搅拌器上。同时，将一根搅拌子放入另一个标记为C的空染色缸中，并将其放置在搅拌器上。从杂交仪中取出芯片，放入装配拆卸工具中。用一只手从两侧分别握住装配拆卸工具和载玻片，将整个组件浸入a皿中。小心剥离A四通道混合器，注意不要划伤芯片区域。迅速将玻片放入染色架和染色缸 B 中。由于 SCI five 染料对臭氧敏感，应尽量减少暴露在空气中的时间。在中等速度搅拌下用擦除液洗涤一分钟。用预热的洗涤缓冲液二填充染色缸 C。将载玻片转移并洗涤一分钟。洗涤后，非常缓慢地将染色架从染色缸 C 中取出，以尽量减少载玻片上残留的液滴。通过离心旋转两分钟使载玻片干燥。然后将载玻片放入一个50毫升的锥形管中，并立即使用Molecular Devices公司的GenePix 4,000B扫描仪进行氩气扫描，以避免信号损失。以下是自人脑组织中分离出的四个RNA样本示例。使用Agilent 2,100生物分析仪配合RNA 6,000芯片对肿瘤组织样本的质量进行评估。实心箭头和空心箭头分别指示18S和28S rRNA物种的位置。RNA完整性数（RIN）是RNA质量的定量度量指标，高质量的总RNA样品在生物分析仪上进行质量控制检测时，应仅产生两个主要峰，分别对应于两种主要的核糖体RNA物种。一些RNA降解会在第一个核糖体RNA峰之前表现为拖尾弥散，而严重降解的28S rRNA峰则显著降低。低质量的RNA会在低保留时间处呈现宽峰或一系列峰，而两个核糖体RNA峰的强度会非常低，甚至无法识别。高质量的芯片应能在相对较低的PMT值下产生高信号。在实验样本和参照样本中，大多数转录本的表达水平应相近。基因表达发生大范围显著变化的情况可能缺乏生物学意义。因此，芯片的大部分区域应呈现黄色，而非绿色或红色。高质量的信号应处于动态范围内，使得信号直方图完全重叠，这可在芯片图像的散点图中观察到。观看本视频后，您应能够充分掌握如何使用自动化杂交仪进行微阵列实验。

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科研

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Biology

生物学

DNA微阵列：样品的质量控制，阵列杂交和扫描

本视频演示了全基因组平铺阵列比较基因组杂交（CGH）的杂交实验技术，该技术仅需25-100 ng...

全基因组阵列比较基因组杂交技术演示

基因微阵列是在全基因组水平上进行基因表达谱分析的强大工具。该技术广泛应用于包括发育生物学和毒理学在内的多种生物学领域。在本视频中，我们详细介绍了一种利用全面的寡核苷酸微阵列平台对斑马鱼进行全基因组表达分析的实验方案。...

利用斑马鱼寡核苷酸微阵列平台进行全基因组表达分析

由于前体mRNA具有瞬时性，因此难以分离和研究 体内.  此处，我们介绍一种新型的 体外...

一种用于绘制人pre-mRNA上核糖核蛋白（RNPs）结合位点的快速高通量方法

DNA微阵列上用于流感的ampliPHOX比色检测

我们已开发出全面且无偏倚的全基因组筛选方法，以研究基因-药物和基因-环境之间的相互作用。本文介绍了对这些突变体文库进行筛选的方法。...

条形码酵母文库的竞争性基因组筛选

本文介绍了一种进行定制 microRNA 微阵列实验的简单流程。步骤包括 RNA 的提取、RNA 与参考 DNA...

进行定制化 microRNA 芯片实验

本文视频介绍了一种基于体外微阵列的 in vitro...

DNA亲和纯化芯片（DAP-chip）法用于确定细菌双组分调控系统的目标基因

基因组拷贝数变异的检测已由染色体微阵列分析（array...

检测基因组拷贝数变异的微阵列比较基因组杂交（Array CGH）技术

本方案为有兴趣开展基于全基因组芯片的比较基因组杂交（CGH）分析以研究植物中拷贝数变异的研究人员，提供了实验步骤以及有关试剂、仪器和分析工具的信息。...

一种基于芯片的比较基因组杂交平台用于高效检测快中子诱变的Medicago truncatula突变体中的拷贝数变异

本文介绍并讨论了原位制备核酸微阵列在合成与应用方面的最新进展。具体而言，我们展示了如何将DNA合成方案拓展至RNA，以及如何利用微阵列构建可检索的核酸文库。...

高密度DNA和RNA微阵列——光刻合成、杂交及大型核酸文库的制备

学习DNA微阵列实验的完整流程，包括RNA样品质量控制、生物分析仪检测、杂交反应和双色荧光扫描技术。掌握自动化混合设备操作，获取可靠的基因表达差异数据。

DNA 微阵列：样品质量控制、芯片杂交与扫描

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