利用斑马鱼寡核苷酸微阵列平台进行全基因组表达分析

该实验流程从高质量RNA模板反转录合成的cDNA开始。首先用荧光染料SI three对cDNA进行标记。标记反应完成后，纯化并分离标记后的cDNA，并对标记反应的质量进行评估。

标记的cDNA随后杂交到微阵列上。杂交完成后，通过分析芯片以确定样品中基因表达的相对水平。大家好，我叫Sam Peterson，来自普渡大学健康科学学院Jennifer Freeman博士的实验室。

此前，我们已向您展示了如何从斑马鱼胚胎中提取RNA，并将该RNA反转录为cDNA。今天，我们将向您展示如何将该cDNA进行标记，并杂交至斑马鱼寡核苷酸微阵列平台，以研究全局基因表达谱。通常，我们使用该方法研究在毒素暴露条件下差异表达的基因。

那么，让我们开始吧。微阵列实验需要在最低光照环境下进行，以防止标记过程中所使用的荧光染料SI three发生光降解。要开始使用SI three对cDNA进行标记，需准备以下组分：BioPrime Array CGH基因组标记系统中的2.5×随机引物缓冲液、10×dCTP混合物以及无核酸酶水。此外，将1毫摩尔浓度的SI three标记的dCTP储备液解冻后，将各试剂短暂离心，并在0.6毫升厚壁管中混合。

取500纳克cDNA，加入40微升、2.5倍随机引物缓冲液以及无核酸酶水，使总体积达到86微升。充分混匀后短暂离心，然后在热循环仪中于100摄氏度孵育5分钟。孵育结束后，立即将反应体系转移至冰浴悬浮液中，持续10分钟。

接下来，将exo DNA聚合酶从冷冻箱中取出并置于冰上。然后向反应管中加入10微升10×dNTP混合液、2微升1毫摩尔的SI 3D CTP以及2微升XO cleanout DNA聚合酶，充分混匀后短暂离心。最后将反应体系在37摄氏度孵育16小时，使用热循环仪完成标记反应。

继续纯化并沉淀标记的cDNA。开始纯化标记的cDNA时，将一个MicroCon柱放入1.5毫升离心管中。

向柱中加入 300 微升 0.1 × SSC，然后加入标记反应液。在 4 摄氏度下以 16,100 × g 离心 10 分钟。注意流出液可能呈淡粉色。

弃去穿流液，并向柱中加入另外 300 微升的 0.1 × SSPE。然后在 4 摄氏度下以 16,100 ×g 离心 10 分钟。再次弃去穿流液，并向柱中加入额外的 300 微升 0.1 × SSC，进行最后一次洗涤，于 4 摄氏度下以 16,100 ×g 离心 12 分钟。

流穿液应保持澄清，且可见柱上有粉红色标记的cDNA。再次弃去此次最终洗涤的流穿液，以去除标记的cDNA。向柱中加入100微升无核酸酶水。将柱从微量离心管中取出，并倒置插入新的离心管中。

然后将倒置的柱子在4°C、2,300 G条件下离心两分钟。标记的cDNA溶解在管底的水中。按照制造商的说明，使用NanoDrop ND-1000分光光度计检测所得cDNA。

按照随附的书面实验方案所述，计算DNA浓度并评估染料掺入情况。如果cDNA标记充分，取六微克放入新管中，加入0.1倍体积pH 5.2的3摩尔醋酸钠和1倍体积异丙醇，于室温避光孵育30分钟，以沉淀标记的cDNA混合物。

请记住，至此所有步骤均在避光环境中进行。然后在室温下以 16,100 G 离心 20 分钟。离心后，小心弃去上清液，注意不要扰动呈粉红色的 DNA 沉淀。

最后加入 500 微升 70% 乙醇洗涤，轻轻翻转混匀，在 16,100 G 离心 5 分钟。室温下移除上清液，倒置离心管，使沉淀干燥 5 分钟。标记的 cDNA 即可用于杂交。

开始杂交前，打开NimbleGen杂交系统，使其平衡至42摄氏度。首先，将标记的cDNA沉淀溶解于5微升无核酸酶的水中。根据随附的书面实验方案，向溶解的沉淀中加入Roche NimbleGen杂交试剂盒中的杂交组分：杂交缓冲液、杂交液A以及比对寡核苷酸，总体积为18微升。

充分混匀后短暂离心，使管内液体全部聚集于管底。随后将标记好的cDNA置于95°C条件下变性5分钟。立即转移至NimbleGen杂交系统，待芯片准备就绪后使用。

请注意，微阵列需要小心操作和储存。Roche NimbleGen 芯片应避光保存，并置于室温下的干燥剂环境中。将芯片装入精密混匀仪对准工具中。

将X型混合器中的PMA T载样量加载到PMA T上，并用镊子移除粘性条带。将阵列和混合器装载后，牢固关闭PMA T。接下来，通过PMA T上的孔对混合器施加压力，从而将阵列和混合器从PMA T上分离。

最后，使用压片机在混样器外部施加压力，以确保芯片完全密封并去除任何气泡。接着将芯片-混样器复合物置于杂交系统中进行预热，并将cDNA样品加载到芯片上。使用位移活塞时应缓慢且持续地施加压力。

将15微升标记好的样本加入混匀器中心的加样孔中。擦去加样孔周围多余的样本，并用粘性封条密封孔口。然后合上卡扣。

现在开始在NimbleGen杂交系统上使用程序B混合杂交溶液。让微阵列杂交16至20小时。杂交接近完成时，对微阵列进行洗涤并准备扫描。开启GenePix 4,000B阵列扫描仪并预热约15分钟，以准备扫描。

接下来，按照随附的书面实验方案配制洗涤缓冲液一A、一B二和三。将洗涤缓冲液一A预热至42摄氏度，其余缓冲液则保持在室温。当洗涤缓冲液一A升温完成后，将其倒入培养皿中。

将载玻片架浸入洗涤缓冲液一B中。现在，从NimbleGen杂交系统中取出阵列混杂复合物，并将其滑入夹具中。通过将组件浸入预热的洗涤缓冲液一A中开始洗涤，然后小心地从载玻片上剥离，移除混杂器。接着将阵列从夹具中取出，在洗涤缓冲液一A中振荡15秒。迅速将阵列转移至浸没在洗涤缓冲液一B中的载玻片架中，并剧烈振荡载玻片架两分钟。

然后将载玻片架转移至洗涤缓冲液二中，振荡一分钟。最后，将载玻片架转移至洗涤缓冲液三中，振荡15秒。洗涤步骤结束后，将芯片转移至载玻片干燥离心机中，离心两分钟。

立即扫描芯片，因为D对光和臭氧敏感。通过将芯片条形码向下放入GenePicks 4,000B芯片扫描仪中启动扫描。在硬件设置对话框中，将532纳米激光的PMT值设为500，功率设为100%，像素大小设为5微米，平均扫描线数设为1，聚焦位置设为0微米。设置完成后，预览芯片。

选择一个区域进行扫描，然后执行扫描。扫描完成后，检查图像的直方图。理想情况下，归一化计数值为1E-5时应达到65,000的饱和上限，这意味着大约有1%至2%的特征点处于饱和状态。

如果归一化计数小于 1 × 10⁻⁵，则提高 PMT 增益并重新扫描玻片。如果归一化计数大于 1 × 10⁻⁵，则降低 PMT 增益，重新扫描玻片，保存图像，并使用数据分析软件进行数据归一化和强度值计算。标记反应通常可产生至少 10 µg 的标记 cDNA。

可通过简单的碱基染料比率计算染料掺入率，其中核苷酸与SI3的比率等于A260与A550的比率乘以23.15。良好的反应结果值应在50至80之间。可接受的杂交应有1%至2%的特征点达到饱和。

在 65,000 饱和度限制下，一个 E 减去 5 的标准化计数。当 PMT 值设定后，还可通过查看芯片扫描图像并评估排列整齐的寡核苷酸与其他阵列特征的信号强度，来定性评估约 500 的杂交质量。还应检查扫描图像，确认阵列区域内是否存在任何特殊斑点或灰尘污点。

在后续分析中，可以使用散点图来展示分析数据，以确定样本中基因表达的相对水平，并识别差异表达的基因。差异表达的基因会显著偏离最佳拟合线。在互补的实验流程中，我们已向您展示了如何从斑马鱼胚胎中提取RNA，并合成cDNA。本文中，我们向您展示了如何将cDNA标记并杂交到寡核苷酸微阵列平台上，以研究全基因组范围的基因表达谱。

进行此操作时，务必始终使用高质量的CD NA，并避免将site three染料暴露于直射光线下。以上就是全部内容。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。