Name: 全球基因表达分析，使用斑马鱼的寡核苷酸芯片平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-10T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
Description: 了解斑马鱼寡核苷酸芯片平台的全球基因表达分析方法，涵盖cDNA荧光标记、杂交及扫描步骤。该技术可定量分析全基因组转录水平，支持发育生物学、毒理学和疾病研究。

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第1部分：cDNA的荧光标记
微阵列实验中使用的Cy3染料对光降解敏感，操作过程应尽量在避光条件下进行。标记方案改编自BioPrime Array CGH基因组标记系统手册1。
<ol><li>标记反应所用试剂应保存在 -20°C。从 BioPrime Array CGH 基因组标记系统中取出 2.5X 随机引物缓冲液、10X dCTP 混合液和无核酸酶水，同时取出 Cy3-dCTP 染料，置于室温融化。融化后，所有试剂在使用前需短暂离心。</li>
<li>每个待分析的 cDNA 样品均需进行独立的标记反应。在 0.6 ml 厚壁管中加入 500 ng cDNA、40 μl 2.5X 随机引物缓冲液，并加入无核酸酶水至总体积为 86 μl。</li>
<li>充分混匀后短暂离心。将反应体系在热循环仪中于 100°C 孵育 5 分钟。</li>
<li>立即转移至冰浴中，冰上静置 10 分钟。</li>
<li>向每根管中加入 10 μl 10X dCTP 混合液、2 μl 1 mM Cy3-dCTP 和 2 μl Exo Klenow DNA 聚合酶。Exo Klenow DNA 聚合酶应保留在冷冻状态，仅在使用时取出，并始终置于冰上。</li>
<li>充分混匀反应体系后短暂离心。</li>
<li>将反应体系在热循环仪中于 37°C 孵育 16 小时。</li>
</ol>
第2部分：标记cDNA的沉淀
<ol>
<li>在继续本实验方案之前，打开NimbleGen杂交系统，并使系统平衡至42°C。</li>
<li>对于每个反应，将一个Microcon离心柱放入一个1.5 ml离心管中。向每个柱中加入300 μl 0.1X SSC，随后加入标记反应液（100 μl）。</li>
<li>将装有柱子的离心管在4°C下以16,100 × g离心10分钟。</li>
<li>弃去穿滤液（可能略带粉红色），并向柱中再加入300 μl 0.1X SSC。</li>
<li>再次在4°C下以16,100 × g离心10分钟。</li>
<li>弃去穿滤液，并向柱中额外加入300 μl 0.1X SSC。</li>
<li>在4°C下以16,100 × g离心12分钟。</li>
<li>弃去穿滤液。最后一次洗涤后穿滤液应为无色透明，此时应可在柱上观察到粉红色的标记cDNA。</li>
<li>向柱中加入100 μl无核酸酶水。将柱子从1.5 ml离心管中取出，倒置放入一个新的1.5 ml离心管中。</li>
<li>在4°C下以2,300 × g离心2分钟。标记的cDNA应被重新水化并溶解于收集在管底的水中。</li>
<li>按照制造商说明使用NanoDrop ND-1000分光光度计测定DNA浓度，并通过计算碱基与染料的比值评估染料掺入效率，其中核苷酸与Cy3的比值等于A260/A550比值乘以23.15。碱基与染料的比值应在50至80之间。</li>
<li>若cDNA标记充分，取6 μg标记cDNA分装至新的1.5 ml离心管中。</li>
<li>加入0.1倍体积的3 M NaOAc（pH 5.2）和1倍体积的异丙醇。将混合物于室温避光孵育30分钟。</li>
<li>随后在室温下以16,100 × g离心20分钟。</li>
<li>小心弃去上清液，避免扰动DNA沉淀（应呈粉红色）。</li>
<li>通过加入500 μl 70%乙醇进行乙醇洗涤，并轻轻倒置混匀。</li>
<li>在室温下以16,100 × g离心5分钟。</li>
<li>移去上清液，将离心管倒置于吸水纸上，使沉淀在空气中干燥5分钟。此步骤中沉淀可选择在-20°C保存，或直接继续进行杂交步骤。</li>
</ol>
第3部分：杂交
杂交步骤改编自罗氏NimbleGen芯片基因表达分析用户指南2。
<ol>
<li>将沉淀溶解于 5 μl 无核酸酶的水中。</li>
<li>待沉淀完全溶解后，加入表 1 中列出的杂交组分。杂交组分来自 Roche NimbleGen 杂交试剂盒。加入所有组分后，总体积应为 18 μl。充分混匀，并短暂离心，使液体沉降至管底。</li>
<li>下一步是将标记的 cDNA 在 95°C 的金属浴中孵育 5 分钟，以进行变性。</li>
<li>变性完成后，立即将管子转移至 NimbleGen 杂交系统，同时按以下步骤准备芯片。</li>
<li>微阵列芯片应始终小心操作，并按照制造商的说明进行储存。Roche NimbleGen 建议将表达芯片避光、置于干燥剂中，并在室温下保存。</li>
<li>将芯片装入 NimbleGen 芯片处理配件中提供的精密混合对准工具（PMAT）中。</li>
<li>将一个 X1 混合器装入 PMAT，并用镊子移除粘性条带。牢固关闭 PMAT。通过 PMAT 上的孔对混合器施加压力，然后缓慢打开，使芯片和混合器从 PMAT 上分离。</li>
<li>使用压辊在混合器外部均匀施压，确保混合器与芯片之间完全密封，并排除任何气泡。将芯片-混合器复合体放置到杂交系统中进行预热。</li>
<li>使用移液器缓慢将 15 μl 标记的样品加入填充口（位于混合器中心的孔）。对移液器施加缓慢而稳定的压力，使样品在混合器内均匀扩散，避免产生气泡。用粘性条带擦去填充口多余的样品，并密封填充口。</li>
<li>关闭卡扣，使用 NimbleGen 杂交系统上的程序 B 开始杂交溶液的混合。让微阵列在系统中杂交 16–20 小时。</li>
</ol>
第4部分：杂交后洗涤与微阵列扫描
洗涤和扫描步骤改编自罗氏NimbleGen芯片基因表达分析用户指南2。
<ol>
<li>当杂交接近完成时，按照表2所述配制洗涤缓冲液。将洗涤缓冲液IA在水浴中预热至42°C。</li>
<li>打开GenePix 4000B芯片扫描仪，使用前让仪器预热约15分钟。</li>
<li>将预热的洗涤缓冲液IA倒入培养皿中。</li>
<li>从NimbleGen杂交系统中取出芯片-混合器复合物，并将其滑入夹具（NimbleGen芯片处理配件中提供）。将整个组件浸入预热的洗涤缓冲液IA中，小心地通过剥离方式移除混合器。</li>
<li>从夹具中取出芯片，在洗涤缓冲液IA中轻轻振荡15秒。</li>
<li>迅速将芯片转移至装有室温洗涤缓冲液IB的载玻片架中，剧烈振荡2分钟。</li>
<li>将载玻片架转移至洗涤缓冲液II中，振荡1分钟。</li>
<li>将载玻片架转移至洗涤缓冲液III中，振荡15秒。</li>
<li>将芯片放入载玻片干燥离心机中，离心2分钟以彻底去除水分。随后立即进行扫描。</li>
<li>建议在扫描完成后立即进行扫描，因为染料对光和臭氧均敏感。</li>
<li>将芯片（条形码朝下）装入GenePix 4000B芯片扫描仪中。</li>
<li>打开GenePix Pro软件并开始芯片扫描。Roche NimbleGen基因表达芯片采用单色杂交策略，因此仅需一个波长进行扫描。使用532 nm激光扫描Cy3荧光信号。打开硬件设置对话框，将532 nm激光的PMT值设为500。</li>
<li>在硬件设置对话框中，将激光功率设为100%，像素尺寸设为5微米，扫描线平均次数设为1，聚焦位置设为0微米。</li>
<li>执行预扫描并设定扫描区域。</li>
<li>开始正式扫描。</li>
<li>扫描完成后检查图像直方图。理想情况下，1e-5的归一化计数值应接近65,000的饱和极限，意味着约有1-2%的特征点达到饱和。如果归一化计数值低于1e-5，则提高PMT增益并重新扫描；如果归一化计数值高于1e-5，则降低PMT增益并重新扫描。</li>
<li>扫描完成后保存图像。建议采用标准命名规则命名图像，以便于后续引用。现在可将图像导入所选的数据分析软件，进行数据归一化及信号强度值的计算。</li>
</ol>
代表性结果
在开始使用 0.1X SSC 进行洗涤时，即可初步评估 cDNA 的 Cy3 荧光标记反应效率。在随后的每一次洗涤过程中，穿流液的颜色应逐渐变淡，最后一次洗涤的穿流液应为无色透明。此外，在这些洗涤步骤中，应能在柱上观察到 Cy3 标记的 cDNA 产物。如果穿流液呈现鲜亮的粉红色，或柱上无粉红色产物，则表明标记反应可能未正确进行。可使用 NanoDrop ND-1000 分光光度计对标记反应进行定量评估，以测定标记 DNA 的浓度及碱基与染料的比率（图 1）。在本实验室中，标记反应通常可获得至少 10 μg 的标记 DNA。染料掺入量可通过简单的碱基/染料比率计算，其中核苷酸与 Cy3 的比率等于 A260/A550 比值乘以 23.15。比值在 50–80 范围内表明标记反应中染料掺入量充足。若标记反应所得 DNA 浓度过低或染料掺入效果不佳，则不建议进行样品在微阵列上的杂交，应重新进行标记反应。
可通过评估微阵列的图像直方图及其扫描图像（图2）来判断杂交质量。可接受的杂交结果应有1-2%的特征点达到饱和（即在65,000的饱和限值下产生1e-5的归一化计数），且PMT值设定在接近500的水平。若为了在65,000饱和限值下达到1e-5的归一化计数，而必须将PMT值从500大幅调整，则通常表明标记的cDNA在微阵列上的杂交效果较差。若继续对这类数据进行后续分析，将会影响数据质量。杂交质量还可通过观察扫描阵列的图像进行定性评估（图3）。罗氏NimbleGen杂交试剂盒包含一组由Cy3和Cy5标记的48碱基寡核苷酸对准探针混合物，可与芯片上的对准特征点发生杂交。通过定性评估这些对准寡核苷酸与其他阵列特征点的信号强度，可对荧光标记cDNA在芯片上的杂交效率进行质量检查。进一步分析后，可利用分析所得数据绘制散点图，以确定基因表达的相对水平，并识别样本间差异表达的基因（图4）。
<img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure1thumb.jpg" alt="吸收光谱图；光谱学；数据分析；光谱峰；光学测量。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1缩略图"> 图1. 用Cy3标记的cDNA的NanoDrop光谱。 可使用NanoDrop ND-1000分光光度计评估标记cDNA的产量和染料掺入情况。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1471/1471figure1.jpg">点击此处</a>查看图1的放大版本。
<img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure2thumb.jpg" alt="瞬态吸收光谱图；数据集、光谱学结果、低噪声数据分析、衰减曲线。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1缩略图"> 图2. 基因芯片扫描的 GenePix 直方图。 可通过评估图像直方图来判断杂交质量。可接受的杂交结果中，应有1-2%的特征点在65,000的饱和限值处达到饱和，其归一化计数值为1e-5，且PMT值设定在接近500的位置。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1471/1471figure2.jpg">点击此处</a>查看图2的放大版本。
<img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure3.jpg" border="0" alt="显微镜图像；蛋白质定位的荧光；细胞生物学研究。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 图3. 扫描后的微阵列图像。 通过查看微阵列的扫描图像可评估杂交质量。应检查图像中是否存在灰尘或其他干扰因素，这些因素可能妨碍每个特征点的可视化，从而影响特征点荧光强度的准确计算。可通过将定位寡核苷酸的信号强度与阵列上其他特征点进行比较，以评估杂交效率。
<img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure4.jpg" border="0" alt="带有回归线和相关性的统计数据分析结果的散点图。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 图 4. 已分析的微阵列实验的散点图。 本实验的目的是鉴定在样本中差异表达的基因。微阵列数据可进一步分析并以散点图形式展示，以便直观识别差异表达的基因。
表1. 用于杂交步骤2的罗氏NimbleGen杂交试剂盒组分。
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>组分</td>
 <td>体积</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>样品（溶于水）</td>
 <td>5 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2X 杂交缓冲液</td>
 <td>9 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hyb A</td>
 <td>3.6 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>引物序列（Alignment Oligo）</td>
 <td>0.4 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>总体积</td>
 <td>18 μl</td>
 </tr>
</tbody> 
</table>
表2. 杂交后用于芯片洗涤的洗涤缓冲液。
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>组分</td>
 <td>洗涤缓冲液 IA*</td>
 <td>洗涤缓冲液 IB</td>
 <td>洗涤缓冲液 II</td>
 <td>洗涤缓冲液 III</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>水</td>
 <td>225 ml</td>
 <td>225 ml</td>
 <td>225 ml</td>
 <td>225 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10X 洗涤缓冲液 I、II 或 III</td>
 <td>25 ml</td>
 <td>25 ml</td>
 <td>25 ml</td>
 <td>25 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M DTT</td>
 <td>25 μl</td>
 <td>25 μl</td>
 <td>25 μl</td>
 <td>25 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>总体积</td>
 <td>250 ml</td>
 <td>250 ml</td>
 <td>250 ml</td>
 <td>250 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
*预热至 42°C

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22BioPrime+Array+CGH+Genomic+Labeling+System+Manual%22">BioPrime Array CGH Genomic Labeling System Manual</a>. , Version C. (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Roche+NimbleGen+Arrays+User%27s+Guide+for+Gene+Expression+Analysis%22">Roche NimbleGen Arrays User's Guide for Gene Expression Analysis</a>. , Version 3 (2008).</li>
</ol>

许多微阵列实验方案（包括此处详述的方案）均采用荧光染料来检测和定量杂交信号。Cy3荧光染料对光和臭氧降解敏感，因此建议在尽可能弱的光照条件下进行操作。此外，微小的灰尘颗粒可能干扰杂交和扫描过程，应特别注意确保工作区域清洁无尘。
针对本实验步骤中所述的标记方案，存在多种替代方法。建议测试不同的标记方案，以确定适用于每种特定表达微阵列平台的最佳标记程序。此处演示的方案已针对由罗氏NimbleGen公司打印的这一特定表达芯片平台进行了优化。此外，我们发现罗氏NimbleGen芯片用户指南中详述的标记方案同样有效。若将本方案应用于其他表达芯片平台（尤其是其他厂商生产的平台）时，应谨慎行事，因为杂交特性在很大程度上取决于芯片平台的打印方法。
将该表达谱芯片实验方案与我们的RNA提取和cDNA合成方案相结合，在本实验室常规可获得可重复的高质量基因表达谱芯片数据。这对于所有表达谱芯片分析而言均至关重要，因为最终数据的质量最终取决于这些初始步骤的质量。在最终表达谱芯片分析之前的任何一步若未达到最佳效果，都将影响最终数据的质量。
...

<table><tbody><tr><td>阵列微型离心干燥仪</td><td>ISC Bioexpress</td><td>C-1303-T</td><td></td></tr><tr><td>BioPrime 阵列CGH基因组标记系统</td><td>Invitrogen</td><td>18095-011</td><td></td></tr><tr><td>氰基3-dCTP</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEL576</td><td></td></tr><tr><td>GenePix 4000B</td><td>Molecular Devices</td><td>GENEPIX 4000B</td><td></td></tr><tr><td>Microcon YM-30</td><td>EMD Millipore</td><td>42411</td><td></td></tr><tr><td>NimbleGen 阵列处理配件</td><td>Roche Group</td><td>5223539001</td><td></td></tr><tr><td>NimbleGen 杂交试剂盒</td><td>Roche Group</td><td>5223474001</td><td></td></tr><tr><td>NimbleGen 杂交系统 4</td><td>Roche Group</td><td>5223652001</td><td></td></tr><tr><td>NimbleGen 洗涤缓冲液试剂盒</td><td>Roche Group</td><td>5223504001</td><td></td></tr><tr><td>X1 混匀器</td><td>Roche Group</td><td>5223725001</td><td></td></tr></tbody></table>

利用斑马鱼寡核苷酸微阵列平台进行全基因组表达分析

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

基因微阵列技术能够在全基因组范围内对转录本水平进行定量测量和基因表达谱分析。该技术广泛应用于多种生物学领域的研究中，包括针对发育阶段、疾病状态以及毒性反应的全局基因表达分析。本文展示了一种利用全面的斑马鱼特异性寡核苷酸微阵列平台进行全局基因表达分析的技术流程。该斑马鱼表达微阵列平台包含385,000个探针，探针长度为60个碱基，可检测37,157个靶标，每个靶标最多包含12个探针。该平台整合了来自多个基因组数据库（包括Ensembl（http://www.ensembl.org）、VEGA（http://vega.sanger.ac.uk）、UCSC（http://genome.ucsc.edu）和ZFIN（http://www.zfin.org））中所有可获得的斑马鱼cDNA及基因组信息，因此能够对当前已知的斑马鱼转录组实现全面覆盖。该斑马鱼表达微阵列由Roche NimbleGen（Madison, WI）制备。本技术演示包括cDNA产物的荧光标记、标记产物与微阵列平台的杂交，以及采用单色分析策略进行芯片扫描以获取信号。

基因微阵列是在全基因组水平上进行基因表达谱分析的强大工具。该技术广泛应用于包括发育生物学和毒理学在内的多种生物学领域。在本视频中，我们详细介绍了一种利用全面的寡核苷酸微阵列平台对斑马鱼进行全基因组表达分析的实验方案。

基因微阵列技术可实现对全基因组范围内转录本水平的定量测量和基因表达谱分析。基因微阵列……

该实验流程从高质量RNA模板反转录合成的cDNA开始。首先用荧光染料SI three对cDNA进行标记。标记反应完成后，纯化并分离标记后的cDNA，并对标记反应的质量进行评估。标记的cDNA随后杂交到微阵列上。杂交完成后，通过分析芯片以确定样品中基因表达的相对水平。大家好，我叫Sam Peterson，来自普渡大学健康科学学院Jennifer Freeman博士的实验室。此前，我们已向您展示了如何从斑马鱼胚胎中提取RNA，并将该RNA反转录为cDNA。今天，我们将向您展示如何将该cDNA进行标记，并杂交至斑马鱼寡核苷酸微阵列平台，以研究全局基因表达谱。通常，我们使用该方法研究在毒素暴露条件下差异表达的基因。那么，让我们开始吧。微阵列实验需要在最低光照环境下进行，以防止标记过程中所使用的荧光染料SI three发生光降解。要开始使用SI three对cDNA进行标记，需准备以下组分：BioPrime Array CGH基因组标记系统中的2.5×随机引物缓冲液、10×dCTP混合物以及无核酸酶水。此外，将1毫摩尔浓度的SI three标记的dCTP储备液解冻后，将各试剂短暂离心，并在0.6毫升厚壁管中混合。取500纳克cDNA，加入40微升、2.5倍随机引物缓冲液以及无核酸酶水，使总体积达到86微升。充分混匀后短暂离心，然后在热循环仪中于100摄氏度孵育5分钟。孵育结束后，立即将反应体系转移至冰浴悬浮液中，持续10分钟。接下来，将exo DNA聚合酶从冷冻箱中取出并置于冰上。然后向反应管中加入10微升10×dNTP混合液、2微升1毫摩尔的SI 3D CTP以及2微升XO cleanout DNA聚合酶，充分混匀后短暂离心。最后将反应体系在37摄氏度孵育16小时，使用热循环仪完成标记反应。继续纯化并沉淀标记的cDNA。开始纯化标记的cDNA时，将一个MicroCon柱放入1.5毫升离心管中。向柱中加入 300 微升 0.1 × SSC，然后加入标记反应液。在 4 摄氏度下以 16,100 × g 离心 10 分钟。注意流出液可能呈淡粉色。弃去穿流液，并向柱中加入另外 300 微升的 0.1 × SSPE。然后在 4 摄氏度下以 16,100 ×g 离心 10 分钟。再次弃去穿流液，并向柱中加入额外的 300 微升 0.1 × SSC，进行最后一次洗涤，于 4 摄氏度下以 16,100 ×g 离心 12 分钟。流穿液应保持澄清，且可见柱上有粉红色标记的cDNA。再次弃去此次最终洗涤的流穿液，以去除标记的cDNA。向柱中加入100微升无核酸酶水。将柱从微量离心管中取出，并倒置插入新的离心管中。然后将倒置的柱子在4°C、2,300 G条件下离心两分钟。标记的cDNA溶解在管底的水中。按照制造商的说明，使用NanoDrop ND-1000分光光度计检测所得cDNA。按照随附的书面实验方案所述，计算DNA浓度并评估染料掺入情况。如果cDNA标记充分，取六微克放入新管中，加入0.1倍体积pH 5.2的3摩尔醋酸钠和1倍体积异丙醇，于室温避光孵育30分钟，以沉淀标记的cDNA混合物。请记住，至此所有步骤均在避光环境中进行。然后在室温下以 16,100 G 离心 20 分钟。离心后，小心弃去上清液，注意不要扰动呈粉红色的 DNA 沉淀。最后加入 500 微升 70% 乙醇洗涤，轻轻翻转混匀，在 16,100 G 离心 5 分钟。室温下移除上清液，倒置离心管，使沉淀干燥 5 分钟。标记的 cDNA 即可用于杂交。开始杂交前，打开NimbleGen杂交系统，使其平衡至42摄氏度。首先，将标记的cDNA沉淀溶解于5微升无核酸酶的水中。根据随附的书面实验方案，向溶解的沉淀中加入Roche NimbleGen杂交试剂盒中的杂交组分：杂交缓冲液、杂交液A以及比对寡核苷酸，总体积为18微升。充分混匀后短暂离心，使管内液体全部聚集于管底。随后将标记好的cDNA置于95°C条件下变性5分钟。立即转移至NimbleGen杂交系统，待芯片准备就绪后使用。请注意，微阵列需要小心操作和储存。Roche NimbleGen 芯片应避光保存，并置于室温下的干燥剂环境中。将芯片装入精密混匀仪对准工具中。将X型混合器中的PMA T载样量加载到PMA T上，并用镊子移除粘性条带。将阵列和混合器装载后，牢固关闭PMA T。接下来，通过PMA T上的孔对混合器施加压力，从而将阵列和混合器从PMA T上分离。最后，使用压片机在混样器外部施加压力，以确保芯片完全密封并去除任何气泡。接着将芯片-混样器复合物置于杂交系统中进行预热，并将cDNA样品加载到芯片上。使用位移活塞时应缓慢且持续地施加压力。将15微升标记好的样本加入混匀器中心的加样孔中。擦去加样孔周围多余的样本，并用粘性封条密封孔口。然后合上卡扣。现在开始在NimbleGen杂交系统上使用程序B混合杂交溶液。让微阵列杂交16至20小时。杂交接近完成时，对微阵列进行洗涤并准备扫描。开启GenePix 4,000B阵列扫描仪并预热约15分钟，以准备扫描。接下来，按照随附的书面实验方案配制洗涤缓冲液一A、一B二和三。将洗涤缓冲液一A预热至42摄氏度，其余缓冲液则保持在室温。当洗涤缓冲液一A升温完成后，将其倒入培养皿中。将载玻片架浸入洗涤缓冲液一B中。现在，从NimbleGen杂交系统中取出阵列混杂复合物，并将其滑入夹具中。通过将组件浸入预热的洗涤缓冲液一A中开始洗涤，然后小心地从载玻片上剥离，移除混杂器。接着将阵列从夹具中取出，在洗涤缓冲液一A中振荡15秒。迅速将阵列转移至浸没在洗涤缓冲液一B中的载玻片架中，并剧烈振荡载玻片架两分钟。然后将载玻片架转移至洗涤缓冲液二中，振荡一分钟。最后，将载玻片架转移至洗涤缓冲液三中，振荡15秒。洗涤步骤结束后，将芯片转移至载玻片干燥离心机中，离心两分钟。立即扫描芯片，因为D对光和臭氧敏感。通过将芯片条形码向下放入GenePicks 4,000B芯片扫描仪中启动扫描。在硬件设置对话框中，将532纳米激光的PMT值设为500，功率设为100%，像素大小设为5微米，平均扫描线数设为1，聚焦位置设为0微米。设置完成后，预览芯片。选择一个区域进行扫描，然后执行扫描。扫描完成后，检查图像的直方图。理想情况下，归一化计数值为1E-5时应达到65,000的饱和上限，这意味着大约有1%至2%的特征点处于饱和状态。如果归一化计数小于 1 × 10⁻⁵，则提高 PMT 增益并重新扫描玻片。如果归一化计数大于 1 × 10⁻⁵，则降低 PMT 增益，重新扫描玻片，保存图像，并使用数据分析软件进行数据归一化和强度值计算。标记反应通常可产生至少 10 µg 的标记 cDNA。可通过简单的碱基染料比率计算染料掺入率，其中核苷酸与SI3的比率等于A260与A550的比率乘以23.15。良好的反应结果值应在50至80之间。可接受的杂交应有1%至2%的特征点达到饱和。在 65,000 饱和度限制下，一个 E 减去 5 的标准化计数。当 PMT 值设定后，还可通过查看芯片扫描图像并评估排列整齐的寡核苷酸与其他阵列特征的信号强度，来定性评估约 500 的杂交质量。还应检查扫描图像，确认阵列区域内是否存在任何特殊斑点或灰尘污点。在后续分析中，可以使用散点图来展示分析数据，以确定样本中基因表达的相对水平，并识别差异表达的基因。差异表达的基因会显著偏离最佳拟合线。在互补的实验流程中，我们已向您展示了如何从斑马鱼胚胎中提取RNA，并合成cDNA。本文中，我们向您展示了如何将cDNA标记并杂交到寡核苷酸微阵列平台上，以研究全基因组范围的基因表达谱。进行此操作时，务必始终使用高质量的CD NA，并避免将site three染料暴露于直射光线下。以上就是全部内容。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

全球基因表达分析，使用斑马鱼的寡核苷酸芯片平台

高质量完整RNA的分离是许多实验室实验方案中的关键步骤。在此，我们展示了从完整的斑马鱼胚胎中提取RNA并合成cDNA，以用于后续多种实验操作，包括基因表达微阵列分析。...

从斑马鱼胚胎中提取RNA及用于基因表达分析的cDNA合成

我们展示了如何从发育调控基因中寻找潜在的增强子元件，并通过嵌合型斑马鱼转基因技术评估其功能。...

用于评估增强子序列的嵌合体斑马鱼转基因技术

在此，我们提出一种系统性方法，用于开发具有生理相关性、高灵敏度和高特异性的 体内...

体内 建模：利用Danio rerio模拟人类疾病基因组

斑马鱼是一种小型热带鱼，已成为研究脊椎动物发育和疾病过程中基因功能的常用模型。通过以下方法可确定目标基因的时间和空间表达模式： 原位...

高分辨率整体成像 原位 斑马鱼胚胎杂交技术用于研究基因表达与功能

聚合酶链式反应（PCR）结合高分辨率熔解分析（HRMA）被证明是一种快速高效鉴定斑马鱼基因型的方法。...

利用高分辨率熔解分析结合PCR进行斑马鱼快速高效基因分型

本研究的目的是展示如何在斑马鱼中利用嵌合体转基因策略，快速高效地在活体（in...

用于肿瘤发病机制中候选协同基因功能基因组学分析的嵌合体斑马鱼转基因技术

本方案描述了一种从斑马鱼胚胎中分离单个细胞、富集目标细胞、在基于微流控的单细胞多重系统中捕获斑马鱼细胞，以及检测单个细胞基因表达的方法。...

斑马鱼胚胎单细胞的分离与表征

本方案介绍了一种从斑马鱼胚胎、幼体或分选细胞中进行全转录组分析的方法。我们包括了RNA的分离、RNA测序数据的通路分析，以及基于qRT-PCR的基因表达变化验证。...

斑马鱼RNA测序基因表达数据的样本制备与分析

斑马鱼已被广泛用作生物医学研究中可靠的遗传学模式生物，尤其是在基因编辑技术出现之后。当预期出现幼体表型时，DNA 提取和基因型鉴定可能具有挑战性。本文介绍了一种高效的斑马鱼幼体基因分型方法，可在受精后 72...

高通量DNA提取与基于鳍剪法的3日龄斑马鱼幼鱼基因分型

基因编辑技术使研究人员能够相对容易地构建斑马鱼突变体，以研究基因功能。本文提供了一种在斑马鱼中并行进行胚胎基因分型和原位杂交信号定量分析的方法指南。这种无偏倚的方法可提高基于原位杂交的表型分析的准确性。...

斑马鱼原位杂交染色的基因分型与定量分析

本文介绍一种用于对齐和冷冻切片多个斑马鱼（Danio...

用于空间转录组学分析的斑马鱼幼虫切片的空间紧凑排列

了解斑马鱼寡核苷酸芯片平台的全球基因表达分析方法，涵盖cDNA荧光标记、杂交及扫描步骤。该技术可定量分析全基因组转录水平，支持发育生物学、毒理学和疾病研究。

利用斑马鱼寡核苷酸微阵列平台进行全基因组表达分析

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