全球基因表达分析，使用斑马鱼的寡核苷酸芯片平台

该程序从从高质量 RNA 模板合成的 CDNA 开始。CDNA 首先用荧光染料 SI 3 标记。标记反应完成后，对标记的 CDNA 进行纯化、分离并评估标记反应的质量。

然后将标记的 CDNA 杂交到微阵列上。杂交后，分析芯片以确定样品中基因表达的相对水平。您好，我是来自普渡大学健康科学学院 Jennifer Freeman 博士实验室的 Sam Peterson。

之前，我们已经向您展示了如何从斑马鱼胚胎中提取 RNA 并将该 RNA 转化为 CDNA。今天，我们将向您展示在斑马鱼寡核苷酸微阵列平台上标记和杂交 CDNA 以研究全局基因表达谱的程序。通常，我们使用该程序来研究响应于毒素暴露的差异基因表达。

那么让我们开始吧。微阵列实验需要一个最小的光照环境，以防止荧光染料 SI 3 的光降解，用于标记 SI 3 开始用 sci 3 标记 CD NA haw 生物引物阵列的以下组分 CGH 基因组标记系统：2.5 x 随机引物缓冲液、10 X-D-C-T-P 混合物和无核酸酶的水。此外，解冻解冻 SI 三标记的 DCTP 的 1 毫摩尔原液，在 0.6 毫升厚的带壁管中短暂离心或试剂。

500 ng CDNA 40 μL、2.5 x 随机引物缓冲液和无核酸酶水，总体积达到 86 μL。充分混合并短暂离心，然后在 100 摄氏度下在热循环仪中孵育反应 5 分钟。孵育结束时，立即将反应物转移到冰浴浆液中 10 分钟。

接下来，将 exo DNA 聚合酶从冰箱中取出并置于冰上。然后加入反应管中，加入 10 微升 10 X-D-C-T-P 混合物，两微升 1 毫摩尔 SI 3D CTP 和 2 微升 XO 清除 DNA 聚合酶，充分混合并短暂离心。最后，将反应物在 37 摄氏度下孵育 16 小时，并在标记完成后使用热循环仪。

继续清理并沉淀标记的 CDNA。开始清洁标记的 CDNA。将 MicroCon 柱放入 1.5 mL 试管中。

向色谱柱中加入 300 μL nough 0.1 XSSC，然后加入标记反应。将色谱柱在 16 G 下以 100 G 和 4 度 SIU 离心 10 分钟。请注意，流过可能是浅粉色的。

弃去流出液，向色谱柱中再添加 300 μL 的 0.1 XSSE。然后在 4 摄氏度下以 16、100 G 和 100 G 重复离心 10 分钟。同样，弃去流出液，向色谱柱中再加入 300 μL T 0.1 XSSC，在最后一次洗涤后，以 16， 100 G 和 4 °C 离心 12 分钟。

流出液应清晰，并且粉末色标记的 CDNA 在色谱柱上可见。同样，丢弃最后一次洗涤的流出物以避开标记的 CD NA。向柱中加入 100 μL 无核酸酶的水。将色谱柱从微量离心管中取出，倒置到新管中。

然后将倒置柱在 2， 300 G 下在 4 °C 下离心 2 分钟。标记的 CDNA 溶解在管底部的水中。根据制造商的说明，使用 NanoDrop ND 1000 分光光度计检查提到的 CDNA。

计算 DNA 浓度并评估染料掺入，如随附的书面方案中所述。如果 CDNA 标记充分，将 6 微克放入新管中，在 pH 值为 5.2 和 1 x 体积的 naut 0.1 x 体积的 3 摩尔乙酸钠中沉淀标记的 CD NA 混合物。异丙醇在室温下避光孵育 30 分钟。

请记住，到目前为止的所有步骤都是在最小的光线环境中进行的。然后在室温下以 16 G 和 100 G 离心样品 20 分钟。离心后，小心丢弃 SUP natant，不要干扰粉红色的 DNA 沉淀。

最后加入 500 μL、70% 乙醇洗涤，并通过 16、100 G 的温和倒置离心混合 5 分钟。在室温下，取出旋毛，倒置试管，让沉淀干燥 5 分钟。标记的 CDNA 已准备好进行杂交。

在开始杂交之前，打开 nimble gen 杂交系统并使其平衡至 42 摄氏度。首先将标记的 CD NA 沉淀溶解在 5 μL 不含核酸酶的水中，以溶解沉淀。按照随附的书面方案，将 Roche Nimble Gen 杂交试剂盒、杂交缓冲液、杂交 A 和对齐寡核苷酸中的杂交组分添加至 18 μL 的总体积。

充分混合并短暂旋转试管以收集底部的内容物。接下来，通过将试管在 95 摄氏度下放置 5 分钟，使标记的 CDNA 变性。立即将试管转移到 nimble gen 杂交系统中，直到阵列准备就绪。

请注意，微阵列需要小心处理和储存。Roche nimble Gen 芯片在室温下与干燥剂一起避光储存。将阵列加载到 precision mixer alignment 工具中。

PMA T 将 X one 混合器加载到 PMA T 上，然后用镊子去除胶条。加载阵列和混频器后，牢固地合上 PMA T。接下来，通过 PMA t 上的孔向混合器施加压力，将阵列和混合器从 PMA T 上分离。

最后，使用 brayer 在混合器外部施加压力，以确保阵列密封并去除任何气泡。接下来，将阵列混合器复合物放在杂交系统上进行加热，以将 CDNA 样品加载到阵列上。缓慢地使用位移瓶，并施加稳定的压力。

将 15 微升标记的样品加入混合器中央的填充口中。擦去端口孔中多余的样品，并用胶条密封。然后合上闩锁。

现在开始在 nimble gen 杂交系统上使用程序 B 混合杂交解决方案。让微阵列芯片杂交 16 至 20 小时杂交后，当杂交接近完成时，将清洗微阵列芯片并扫描。打开基因拾取 4， 000 B 阵列扫描仪，让它预热约 15 分钟，准备扫描。

接下来，按照随附的书面方案中概述，制备洗涤缓冲液 1 A、1 B 2 和 3。战前洗涤缓冲液 1 A 至 42 摄氏度，但将其他缓冲液置于室温下。当洗涤缓冲液 A 预热后，将其倒入培养皿中。

将载玻片架浸入洗涤缓冲液 1 中 B.现在从灵活的 gen 杂交系统中取出阵列混合器复合物，然后滑入夹具中。通过将组件浸入预热的洗涤缓冲液 1 A 中开始洗涤，然后从载玻片上剥离，小心地取下混合器。然后从夹具中取出阵列，在洗涤缓冲液 1 中搅拌 15 秒 A.将阵列快速转移到浸没在洗涤缓冲液 1 B 中的载玻片架中，并剧烈摇动载玻片架 2 分钟。

然后将玻片架转移到洗涤缓冲液 2 中并搅拌 1 分钟。最后，将玻片架转移到洗涤缓冲液 3 中并搅拌 15 秒。将阵列转移到玻片干燥离心机中，离心后旋转 2 分钟，完成清洗机。

由于 D 对光和臭氧敏感，因此立即扫描阵列，通过将阵列条形码加载到 gene picks 4， 000 B 阵列扫描仪中开始扫描。在硬件设置对话框集中，532 纳米激光器的 PMT 值设置为 500，将 100% 像素大小的功率设置为 5 微米，将线平均设置为 1，将聚焦位置设置为零微米。设置完成后，预览阵列。

选择要扫描的区域，然后进行扫描。扫描完成后，检查图像直方图。理想情况下，1 E 减去 5 个标准化计数应处于 65， 000 个饱和极限，这意味着大约 1% 到 2% 的特征处于饱和状态。

如果标准化计数小于 1 E 减去 5，则增加 PMT 增益并重新扫描载玻片。如果归一化计数大于 1 E 减去 5，请降低 PMT 增益并重新扫描载玻片，保存图像，并使用数据分析程序进行数据归一化和强度值计算。标记反应通常产生至少 10 μg 标记的 CDNA。

掺入可以使用简单的碱基染料比率计算，其中核苷酸与 SI 3 的比率等于 A 2 60 比 50 乘以 23 点 15。一个好的反应将产生 50 到 80 之间的值。可接受的杂交将有 1% 到 2% 的特征饱和产量。

1 E 减去 65， 000 饱和度限制处的 5 个标准化计数。设置 PMT 值后，还可以通过查看微阵列的扫描图像并评估对齐寡核苷酸与阵列上其他特征的强度来定性评估接近 500 的杂交质量。还应评估扫描图像中是否存在阵列区域内的任何特定点或灰尘点。

在后续分析中，散点图可用于对分析数据进行成像，以确定样品中基因表达的相对水平，并识别差异表达的基因。差异表达的基因将显着偏离最佳拟合线 在互补程序中。我们已经向您展示了如何从斑马鱼胚胎中提取 RNA 合成 c CD NA。在这里，我们向您展示了如何在寡核苷酸微射线平台上标记和杂交 CD NA，以研究整体基因表达谱。

执行此程序时，请始终记住使用高质量的 CD NA，并避免将现场三种染料暴露在直接照明下。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。