Name: 人类神经干细胞计数 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: 学习使用血球计数板和台盼蓝染色法对人类神经干细胞进行计数，区分活细胞与死细胞。该方法适用于免疫化学和转染实验的细胞培养准备工作，为神经科学和细胞生物学研究提供可靠的细胞定量分析技术。

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作者谨此感谢橙县儿童医院研究学院国家人类神经干细胞资源中心的 Philip H. Schwartz 博士提供 hNSPC 培养物。

人神经干细胞传代
注意：请参阅 JoVE 文章《<a href="https://www.jove.com/index/details.stp?ID=263">人神经干细胞的传代</a>》，了解如何解离和重悬细胞。https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263
准备用于计数的细胞悬液
<ol>
<li>取25 µl的0.4%台盼蓝溶液和20 µl细胞培养基，加入一个离心管中。</li>
<li>轻轻敲击含有已知体积培养基中细胞的离心管，使细胞重悬并形成均匀的细胞悬液。取5 µl细胞悬液加入上一步的离心管中。此步骤将细胞浓度稀释了10倍。</li>
<li>将盖玻片盖在血细胞计数板上，然后加入约11–12 µl细胞悬液。 <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_4/262_Figure-01.png" alt="血细胞计数板示意图；顶部和侧面视图，显示用于细胞计数的网格区域及0.1 mm的样本深度。" width="511" height="139" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="262_Figure-01"> </li>
</ol>
在血细胞计数板中计数细胞
<ol>
<li>在相差显微镜下观察血细胞计数板的整个网格。聚焦于网格中的一个象限（例如红色标记的象限）。 <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_5/262_Figure-02.png" alt="血细胞计数板网格示意图，包含用于细胞计数的放大视图，显示方格尺寸细节。" width="492" height="278" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="262_Figure-02"> </li>
<li>死亡或濒死细胞由于细胞膜受损，无法排除台盼蓝染料，因此呈现蓝色。活细胞不会呈现蓝色，在相差显微镜下周围可见一圈明亮的“光晕”（即“相差明亮”）。</li>
<li>计数一个象限内的活细胞数量（面积为1 mm2）。也可通过将活细胞数除以细胞总数来确定细胞活力。随机计数3–4个象限中的细胞，计算每个象限的平均细胞数。由于每个象限的体积已知为10-4 ml 或 0.1 µl，因此可据此确定细胞浓度 <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_6/262_Figure-03.png" alt="细胞计数设置；公式：象限体积、稀释因子；血细胞计数板示意图。" width="741" height="165" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="262_Figure-03"> </li>
<li>可使用以下简化公式计算每微升的细胞数（#cells/µl）： <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_7/262_Figure-04.png" alt="细胞浓度计算公式示意图，#cells/象限 ×10 ×10 = #cells/µl" width="368" height="69" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="262_Figure-04"> 试管中细胞总数 = 每微升细胞数 × 试管中液体体积（µl）</li>
</ol>

<ol><li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, 
 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> (2007).</li>
<li>Caprette, D. avidR. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+Hemacytometer%5BTitle%5D)+AND+%22BioEd+Online%22%5BJournal%5D)">Using a Hemacytometer.</a> BioEd Online. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer&dpg=3">http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer&dpg=3</a> (2008).</li>
<li>Caprette, D. avidR. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+Chamber+%28Hemacytometer%29%5BTitle%5D)+AND+%22BioEd+Online%22%5BJournal%5D)">Counting Chamber (Hemacytometer).</a> BioEd Online. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer%22&dpg=2
">http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer%22&dpg=2
</a> (2008).</li>
</ol>

本方案描述了一种简单且快速测定多种细胞实验所需细胞浓度的方法。使用步骤3d中所述的快捷方法，可快速、准确地测定特定体积内的细胞浓度和总细胞数。

<table><tbody><tr><td>相差显微镜血细胞计数板</td><td>工具</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-54</td><td>由 Fisher 以所示目录号分销</td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝染液</td><td>试剂</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>由 Invitrogen 以所示目录号分销</td></tr></tbody></table>

计数人类神经干细胞

Counting Human Neural Stem Cells

在许多常规组织培养操作中，例如用于免疫细胞化学染色或细胞转染的细胞铺板，都需要知道特定体积细胞悬液中活细胞的精确数量。本方案描述了一种简单快速的方法，通过血细胞计数板区分活细胞与死细胞，并对细胞浓度和总细胞数进行定量。该操作首先需要将细胞从生长表面脱离，并重新悬浮于培养基中。随后，将细胞悬液用台盼蓝溶液稀释（理想情况下稀释至每个四分之一计数区含有20–50个细胞），然后加入血细胞计数板中。最后，取多个随机选择的四分之一计数区中活细胞数的平均值，除以一个1 mm2四分之一区的体积（0.1 μl），再乘以稀释倍数，即可得到每微升（μl）中的细胞数量。将该细胞浓度乘以总体积（μl），即可获得细胞总数。本方案以人神经干细胞/前体细胞（hNSPCs）为例进行计数，但也适用于多种其他类型的细胞。

许多组织培养操作需要了解活细胞的精确数量。本实验方案描述了如何区分活细胞与死细胞，并使用血细胞计数板对细胞进行定量。尽管本方案以人神经干细胞/前体细胞（hNSPCs）的计数为例，但也可适用于其他类型的细胞。

了解特定体积细胞悬液中活细胞的精确数量是许多常规组织培养操作所必需的，例如……

现在我将向您展示如何计数人神经前体细胞。当您希望将细胞用于免疫化学实验或使用核因子显微装置进行转染时，都需要对细胞进行计数。我使用带有边缘网格的相差显微镜血细胞计数板，同时使用一种名为台盼蓝的染料。这种染料的优势在于能够区分活细胞与死细胞。死亡或即将死亡的细胞会摄取这种染料而呈现蓝色。当你在血细胞计数板中观察时，活细胞能够排除这种染料，因此不会呈现蓝色。通过这种方法，你可以判断细胞的存活率，以制备含有台盼蓝和培养基的溶液。我将向这个0.5毫升离心管中加入20微升的台盼蓝溶液。然后，我将加入25微升的培养基。这样，目前我共有45微升的台盼蓝与培养基混合溶液，因此当我加入5微升的细胞悬液时，即可实现1:10的稀释比例。现在，我将加入5 µL细胞悬液。首先，我会用手指轻弹离心管使细胞充分重悬。接下来，我需要确保该溶液充分混匀。因此，我将把床升降几次。最后，我会将约12微升的细胞悬液加入血细胞计数板中。它有两个加样口，你可以使用其中任意一个。因此，您只需将溶液从这个入口注入，液体就会通过毛细作用被吸入。现在我已准备好进行计数。这是在10倍物镜下观察血细胞计数板的视野，此处有一个包含16个方格的象限。如您所见，我们可在此观察到活细胞与死细胞。此处的活细胞例如这个、这个以及这个。此外，我们还观察到一些死细胞，例如这个。如果仔细观察，死细胞呈深蓝色，而活细胞周围则呈现出一种类似冰晶的亮圈。接下来我将计数所有活细胞。计数顺序将从左到右、从上到下进行。1、2、3、4、5、6、33、1、32、33、34、3、5、3、6。因此，该象限中共有六个细胞。当观察到位于象限边界线上的细胞时，例如此处这条线上的细胞，为了保持一致性，我仅计数位于左侧边界和上侧边界上的细胞。我会对血细胞计数板上所有四个象限的边界细胞进行持续计数。接下来，我们将计算每微升中含有多少个细胞。为此，我将取每个象限细胞数的平均值（即38），再乘以10，这个系数是由计数室的尺寸所决定的。同时，我们还要乘以10，这是本实验中的稀释倍数。最终，我们将得到每微升中的细胞数量。因此，在本例中，每微升含有3,800个细胞。由于我们将细胞沉淀重悬于500微升溶液中，因此可以计算出细胞的总数。至此，所有步骤已完成。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

人类神经干细胞计数

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人神经干细胞的传代

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