Name: 传代人类神经干细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 学习人类神经干细胞传代培养的标准化操作流程，使用人纤维连接蛋白包被培养瓶和细胞解离缓冲液。该方法可提高实验可重复性，适用于免疫化学和转染实验研究。

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作者们衷心感谢橙县儿童医院研究学院国家人类神经干细胞资源中心的 Philip H. Schwartz 博士，感谢他提供了人神经干细胞前体细胞（hNSPCs）以及有关其培养的初步指导。

注意：对于我们的hNSPCs常规培养，我们每隔一天更换50-100%的培养基，通常每周以1:2的比例传代一次。培养基由DMEM:F12基础培养基添加20% BIT-9500、1X 抗生素/抗真菌剂以及生长因子（EGF、FGF和PDGF，每种均为40 ng/mL）组成。
准备包被培养瓶并解离细胞
<ol>
<li>为准备用于传代细胞的新培养瓶，用含10 µg/ml人纤维连接蛋白的EMEM在37°C组织培养孵箱中对T25培养瓶进行包被，孵育4小时或过夜。在细胞传代前，移除纤维连接蛋白溶液，并用PBS冲洗培养瓶。</li>
<li>将待传代细胞的旧“条件培养基”转移至新的纤维连接蛋白包被的培养瓶中（使每瓶最终培养基体积的一半为“条件培养基”）。此类培养条件有助于维持细胞的未分化状态。</li>
<li>从待传代细胞中完全移除培养基后，用PBS轻轻冲洗细胞一次。注意避免细胞干燥。</li>
<li>直接将细胞解离缓冲液（CDB）加入细胞中（T25培养瓶加1.0–1.5 ml）。室温下孵育约5分钟。轻轻敲击培养瓶有助于加快细胞脱落。</li>
</ol>
离心、重悬和接种细胞
<ol>
<li>向含有已脱落细胞的培养瓶中加入含血清的培养基（DMEM:F12 加 10% 热灭活胎牛血清）（体积约为 CDB 的 3 倍）。将培养基和细胞转移至 15 ml 圆底离心管中。用少量新鲜含血清培养基冲洗培养瓶，以回收残留细胞。</li>
<li>以 1000 rpm（约 200×g）离心 5 分钟。</li>
<li>吸除含血清的培养基，将细胞重悬于新鲜培养基中，反复吹打以形成均一的细胞悬液。</li>
<li>将重悬后的细胞平均分成两份&nbsp;，分别接种至两个新培养瓶中，进行 1:2 传代。在培养瓶上标注新的传代次数。</li>
</ol>

<ol><li>Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+neural+precursor+cells+by+laminin+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins.</a> J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).</li>
<li>Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Stem+Cell+Manual%3A+A+Laboratory+Guide%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell culture.</a> Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).</li>
<li>Palmer, T. D., Schwartz, P. H., Taupin, P., Kaspar, B., Stein, S. A., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture.+Progenitor+cells+from+human+brain+after+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell culture. Progenitor cells from human brain after death.</a> Nature. 411, 42-43 (2001).</li>
<li>Schwartz, P. H., Bryant, P. J., Fuja, T. J., Su, H., O'Dowd, D. K., Klassen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+neural+progenitor+cells+from+post-mortem+human+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex.</a> J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).</li>
</ol>

我们发现该方案能够获得可靠的hNSPCs培养物。影响细胞生长的一个关键因素是，细胞必须保持较高的密度培养，不能传代至细胞过于稀疏的状态。在我们的实验中，稀疏的培养物生长极为缓慢，甚至完全停止分裂。因此，当培养物密度极高时，我们通常以1:2或1:3的比例进行传代。使用纤连蛋白（fibronectin）包被培养皿表面非常重要，因为它能促进细胞的良好贴附和迁移；同时，与层粘连蛋白（laminin）不同，它允许使用细胞解离缓冲液（Cell Dissociation Buffer, CDB）来解离细胞。细胞在层粘连蛋白上的贴附过于牢固，必须使用蛋白水解酶（如胰蛋白酶）才能实现细胞解离。相比胰蛋白酶，我们更倾向于使用非酶性的CDB，因为蛋白酶对细胞表面蛋白的切割可能随时间推移导致hNSPCs发生形态学改变。此外，使用条件培养基培养hNSPCs有助于维持其未分化状态。

<table><tbody><tr><td>BIT-9500（BSA、胰岛素、转铁蛋白）</td><td>试剂</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>09500</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>DMEM:F12 (1X)</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>EMEM (1X)</td><td>试剂</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>MT-10-010-CV</td><td>由 Fisher 以所示目录编号经销</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>FGF，人源碱性重组蛋白</td><td>试剂</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-AB</td><td>试剂</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-00AB</td><td></td></tr><tr><td>EGF，人源重组蛋白</td><td>试剂</td><td>BD Biosciences</td><td>CB40052</td><td>由 Fisher 以所示目录编号经销</td></tr><tr><td>细胞培养瓶，25 cm²</td><td>工具</td><td>Corning</td><td>10-126-28</td><td>由 Fisher 以所示目录编号经销</td></tr><tr><td>纤维连接蛋白，人源天然蛋白</td><td>试剂</td><td>BD Biosciences</td><td>CB40008A</td><td>由 Fisher 以所示目录编号经销</td></tr><tr><td>人神经干细胞/前体细胞</td><td>细胞</td><td>国家人神经干细胞资源中心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞解离缓冲液</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>13150-016</td><td></td></tr></tbody></table>

人神经干细胞的传代

Passaging Human Neural Stem Cells

体外操控人神经干细胞/前体细胞（hNSPCs）的能力为研究其作为细胞移植治疗手段的潜力提供了途径，同时也可用于探索人类神经发育及病理过程中的诸多基本机制。本方案介绍了一种培养和传代hNSPCs的简便方法，旨在标准化该技术，提高人类干细胞研究的可重复性。我们所使用的hNSPCs由国家人类神经干细胞资源中心（National Human Neural Stem Cell Resource）自死后婴儿脑皮层中分离获得，并在经纤维连接蛋白（fibronectin）包被的培养瓶中以贴壁培养方式生长（Palmer et al., 2001；Schwartz et al., 2003）。我们将hNSPCs培养于添加了EGF、FGF和PDGF的DMEM:F12无血清培养基中，约每七天以1:2比例进行传代。在这些培养条件下，培养物中的大多数细胞保持双极形态，并表达未分化神经干细胞的标志物（如nestin和sox2）。

在体外操控人神经干细胞/前体细胞（hNSPCs）的能力，使得研究人员能够探索其作为细胞移植用于治疗目的的潜力，并研究人类神经系统的发育过程。本方案介绍了一种培养和传代hNSPCs的方法，旨在提高人类干细胞研究的可重复性。

体外操控人神经干细胞/前体细胞（hNSPCs）的能力为研究其作为细胞移植治疗手段的应用价值提供了途径……

你好，我是Steve。我在加州大学欧文分校病理学系Flanagan博士的实验室工作。今天我将向你展示如何传代培养人神经前体细胞。该技术包括使用人纤维连接蛋白溶液包被新培养瓶，用细胞解离缓冲液将细胞从原培养瓶中剥离，再用含10%血清的溶液中和细胞解离缓冲液，离心收集细胞悬液，将细胞重悬于新鲜培养基中，最后将细胞悬液转移至新培养瓶。在我们实验室中，人神经前体细胞的培养采用每隔一天更换一半培养基的方法，通常每周传代一次，传代比例约为1:2。当我进行细胞传代时，如果计划进行免疫化学实验，或使用核效应因子进行转染，则会对细胞进行计数。在处理细胞时使用细胞解离缓冲液非常重要，因为与胰蛋白酶不同，它是一种非酶解离试剂，对细胞更加温和。大家好，我们现在位于组织培养室。在向大家展示汇合的人类前体细胞培养瓶的形态之前，我首先需要准备组织培养环境。第一步是关闭紫外灯，并打开照明灯和气流。 接下来，我将用70%乙醇对生物安全柜进行消毒：先将乙醇喷在纸巾上，再用该纸巾擦拭安全柜表面。需要注意的是，应将乙醇喷在纸巾上而非直接喷入安全柜内部，因为直接喷洒70%乙醇可能损坏价格昂贵的HEPA过滤器。接下来，我将对所有试剂和仪器进行喷洒消毒。最后，我将对真空管路进行喷洒消毒，这样就全部准备就绪了。让我们来看一下这些细胞。这些细胞的融合度大约为80%。这些是从人类胎儿组织中分离得到的人类神经前体细胞，我们在T 25培养瓶中进行培养。每大约一周至两周传代一次，比例为1:2。现在我准备对我的细胞进行传代。首先，我将取一个新 T 25 培养瓶，该培养瓶已用 BD biosciences 的人纤维连接蛋白包被四小时。因此，我已移除纤维连接蛋白溶液，并在将细胞转入培养瓶前，先用 BBS 清洗该培养瓶。现在我要从37摄氏度的培养箱中取出细胞。就是这些。接下来，我将移除已包被人纤维连接蛋白的新培养瓶中的PBS洗涤液。我将向新培养瓶中加入两毫升的旧的条件培养基。现在，我需要先用 PBS 清洗细胞，然后才能将其从培养表面脱离。首先，我会移除残留的培养基，立即加入约两毫升 PBS，注意不要让细胞干燥。我将等待大约两分钟，然后吸除 PBS 并加入细胞解离缓冲液，以使细胞从培养皿表面脱落。现在我要移除 PBS，同样，我会立即加入细胞解离缓冲液，以防止细胞干燥。因此，我将加入 1.5 mL 的细胞解离缓冲液。与PBS不同，我将直接将缓冲液加到细胞上，并尽量覆盖尽可能大的表面。因此，我在缓慢将缓冲液加到细胞上的同时，轻轻左右移动培养瓶。接下来，我将等待约五分钟，使细胞开始从表面脱落。我将把烧瓶留在通风橱内室温条件下。如您所见，细胞首先开始变圆，随后逐渐从表面脱落，实际上您已经可以看到一些细胞在悬浮。如果您轻轻敲击烧瓶侧面，将有助于细胞脱落。已经过去五分钟了，正如您所见，溶液中已含有大量从表面脱落的细胞，变得非常浓稠。现在

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生物学

传代人类神经干细胞

将目的基因导入细胞是阐明其在体内功能的一种强大方法。本方案描述了一种利用Amaxa公司生产的Nucleofector电穿孔装置转染人神经干细胞/前体细胞（hNSPCs）培养物的高效方法。...

使用 Amaxa Nucleofector 转染人类神经干细胞

许多组织培养操作需要了解活细胞的精确数量。本实验方案描述了如何区分活细胞与死细胞，并使用血细胞计数板对细胞进行定量。尽管本方案以人神经干细胞/前体细胞（hNSPCs）的计数为例，但也可适用于其他类型的细胞。...

计数人类神经干细胞

神经干细胞取自成年非冬眠期一年生北极地松鼠（AGS）的海马体。这些神经干细胞可通过多次传代进行扩增，并可分化并维持为神经元与胶质细胞比例接近50:50的培养体系。...

成年北极地松鼠海马神经干细胞的生长与分化

本文介绍了一种从废弃的人类胎儿皮质组织中分离和培养神经干细胞的简单且可靠的方法。来源于已知人类神经系统疾病的人源组织培养物可用于病理性的细胞与分子过程的表征，并可作为评估药理学疗效的平台。...

从废弃的人类胎儿皮质组织中生成神经干细胞

本视频展示了利用酶处理及在富含生长因子的培养基中培养，将神经球来源的人类神经干细胞分化为神经前体细胞和星形胶质细胞前体细胞的方法，最终可使其成熟为特化的前体细胞。...

将人类神经干细胞分化为神经前体细胞和星形胶质前体细胞

从成年大脑中分离获取的神经干细胞正越来越多地应用于神经系统发育的基础研究，以及再生医学中潜在临床应用的探索。因此，严格控制这些细胞的分离和培养条件，对于获得可靠的实验结果至关重要。...

从成年啮齿类动物脑内常规和非常规区域培养神经干细胞

本方案描述了一种新型的机械切碎方法，该方法可在无需解离为单细胞悬液的情况下实现球形神经干细胞及祖细胞聚集体的扩增。 维持细胞间的接触可实现超过40代的快速且稳定的生长。...

一种适用于cGMP的扩增方法，用于由多能干细胞或胎儿脑组织衍生的人类神经干细胞与前体细胞聚集体

已建立一种方法，可直接从外周血细胞中富集的造血祖细胞诱导生成人类神经干细胞。...

直接诱导人外周血造血祖细胞生成神经干细胞

为了表征miRNA在分化的人类神经干细胞（hNSCs）中的变化，本文描述了在三维系统中进行hNSC分化的方法、通过miRNA...

三维培养条件下人神经干细胞系的分化、microRNA及潜在靶基因分析

成年哺乳动物脊髓中含有可分离并在体外扩增培养的神经干细胞/祖细胞（NSPCs）。本实验方案描述了从大鼠及人类器官移植供体的成年脊髓室管膜下区获取、分离、培养以及传代NSPCs的方法。...

从成年大鼠和人类脊髓室管膜下区分离神经干细胞/前体细胞

本研究提供了一种详细的技术方法，用于建立一种简单且稳健的皮质类器官培养体系，该体系基于标准的无饲养层人多能干细胞（hPSC）培养系统。该方案快速、高效且可重复，可用于生成模拟脑衰老特征的类器官。 体外.

稳健且高度可重复的皮质脑类器官生成方法用于模拟脑神经元衰老 体外

学习人类神经干细胞传代培养的标准化操作流程，使用人纤维连接蛋白包被培养瓶和细胞解离缓冲液。该方法可提高实验可重复性，适用于免疫化学和转染实验研究。

人神经干细胞的传代

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