人神经干细胞的传代

你好，我是Steve。我在加州大学欧文分校病理学系Flanagan博士的实验室工作。今天我将向你展示如何传代培养人神经前体细胞。

该技术包括使用人纤维连接蛋白溶液包被新培养瓶，用细胞解离缓冲液将细胞从原培养瓶中剥离，再用含10%血清的溶液中和细胞解离缓冲液，离心收集细胞悬液，将细胞重悬于新鲜培养基中，最后将细胞悬液转移至新培养瓶。在我们实验室中，人神经前体细胞的培养采用每隔一天更换一半培养基的方法，通常每周传代一次，传代比例约为1:2。当我进行细胞传代时，如果计划进行免疫化学实验，或使用核效应因子进行转染，则会对细胞进行计数。

在处理细胞时使用细胞解离缓冲液非常重要，因为与胰蛋白酶不同，它是一种非酶解离试剂，对细胞更加温和。大家好，我们现在位于组织培养室。在向大家展示汇合的人类前体细胞培养瓶的形态之前，我首先需要准备组织培养环境。第一步是关闭紫外灯，并打开照明灯和气流。

接下来，我将用70%乙醇对生物安全柜进行消毒：先将乙醇喷在纸巾上，再用该纸巾擦拭安全柜表面。需要注意的是，应将乙醇喷在纸巾上而非直接喷入安全柜内部，因为直接喷洒70%乙醇可能损坏价格昂贵的HEPA过滤器。接下来，我将对所有试剂和仪器进行喷洒消毒。

最后，我将对真空管路进行喷洒消毒，这样就全部准备就绪了。让我们来看一下这些细胞。这些细胞的融合度大约为80%。

这些是从人类胎儿组织中分离得到的人类神经前体细胞，我们在T 25培养瓶中进行培养。每大约一周至两周传代一次，比例为1:2。现在我准备对我的细胞进行传代。

首先，我将取一个新 T 25 培养瓶，该培养瓶已用 BD biosciences 的人纤维连接蛋白包被四小时。因此，我已移除纤维连接蛋白溶液，并在将细胞转入培养瓶前，先用 BBS 清洗该培养瓶。

现在我要从37摄氏度的培养箱中取出细胞。就是这些。接下来，我将移除已包被人纤维连接蛋白的新培养瓶中的PBS洗涤液。

我将向新培养瓶中加入两毫升的旧的条件培养基。现在，我需要先用 PBS 清洗细胞，然后才能将其从培养表面脱离。首先，我会移除残留的培养基，立即加入约两毫升 PBS，注意不要让细胞干燥。

我将等待大约两分钟，然后吸除 PBS 并加入细胞解离缓冲液，以使细胞从培养皿表面脱落。现在我要移除 PBS，同样，我会立即加入细胞解离缓冲液，以防止细胞干燥。因此，我将加入 1.5 mL 的细胞解离缓冲液。

与PBS不同，我将直接将缓冲液加到细胞上，并尽量覆盖尽可能大的表面。因此，我在缓慢将缓冲液加到细胞上的同时，轻轻左右移动培养瓶。接下来，我将等待约五分钟，使细胞开始从表面脱落。

我将把烧瓶留在通风橱内室温条件下。如您所见，细胞首先开始变圆，随后逐渐从表面脱落，实际上您已经可以看到一些细胞在悬浮。如果您轻轻敲击烧瓶侧面，将有助于细胞脱落。

已经过去五分钟了，正如您所见，溶液中已含有大量从表面脱落的细胞，变得非常浓稠。现在，我将通过加入4.5 mL含血清的培养基来中和细胞解离缓冲液的作用。我将使用含10%经热灭活的胎牛血清的D-M-E-M-F 12培养基，并将其直接加在培养瓶的表面，以确保没有细胞仍附着在瓶壁上。

接下来，我将轻轻吹打溶液，以悬浮所有残留的细胞。然后，将细胞悬液转移至一个15 mL的锥形离心管中，并在1000 rpm条件下离心1分钟。

细胞已经离心完毕，这里可以看到一个漂亮的细胞沉淀。我将非常小心地移除血清培养基，尽量不扰动沉淀。然后，我将用4 mL培养基重新悬浮该沉淀。

因此，我将尝试重悬沉淀，确保没有细胞团块残留，使溶液均匀且无任何团块。由于我进行的是1:2传代，我将取四毫升中的两毫升，转移至已含有两毫升培养基的新培养瓶中。最后，我会在培养瓶上标记细胞类型、传代次数和日期。

这是半小时前传代的细胞的观察结果。如您所见，大多数细胞已经贴附到培养表面，并开始伸出突起。就这些了，各位。

现在我准备开始计数了。