传代人类神经干细胞
2007年8月22日
操作能力在体外培养人类神经干/前体细胞（hNSPCs）允许调查作为细胞移植用于治疗目的的实用价值与探索人类的神经系统发育。该协议提出希望增加人类干细胞研究的可重复性的培养和传代hNSPCs的方法。
大家好，我是 Steve。我在加州大学尔湾分校病理学系的 Flanagan 博士的实验室工作。今天，我将向您展示如何分裂人类神经前体细胞。
该技术包括用人纤连蛋白溶液编码新培养瓶，用细胞解离缓冲液提取细胞，然后用 10% 血清溶液中和细胞解离缓冲液，离心细胞悬液，将细胞悬浮在新鲜培养基中复苏，并将细胞悬液转移到新的培养瓶中。在我们的实验室中，我们每隔一天更换一半的培养基来培养人类神经前体细胞，并且我们大约每周通过分流 1 到 2 来传代它们一次。当我传代细胞时，如果我想用细胞进行免疫化学实验，或者我想用核效应子进行转染，我可能会对细胞进行计数。
在包装细胞时使用细胞解离缓冲液很重要，因为首先，它与胰蛋白酶不同是非酶促的，并且对细胞温和得多。大家好，我们现在在组织培养室，在向您展示人类前体细胞的汇合瓶是什么样子之前，首先我要准备组织培养物。首先，我要关闭紫外线灯，然后打开灯和气流。
接下来，我将用 70% 乙醇喷洒纸巾并擦拭抽油烟机，对抽油烟机进行消毒。用纸巾喷洒 70% 乙醇很重要，而不是直接喷洒在抽油烟机内部，因为用 70% 乙醇喷洒抽油烟机可能会损坏 HEPA 过滤器，这真的很昂贵。接下来，我将喷涂所有试剂和仪器。
最后，我要喷涂真空软管，我们都准备好了。让我们来看看这些单元格。所以这些细胞看起来大约有 80% 汇合。
这些是从人类胎儿中分离的人神经前体细胞，我们在 T 25 培养瓶中培养它们。我们大约每周将它们分开，一到两次。我现在已经准备好传代我的细胞了。
首先，我将带来一个新的 T 25 培养瓶，我用 BD biosciences 的人纤连蛋白包被了四个小时。所以我去除了纤连蛋白溶液。在将细胞移入培养瓶之前，我将用 BBS 冲洗这个培养瓶。
现在我要从 37 度的培养箱中取出细胞。他们在那儿。现在，我将从涂有人纤连蛋白的新培养瓶中取出 PBS 洗涤液。
我将向新培养瓶中加入 2 毫升旧的调节培养基。所以现在我需要用 PBS 冲洗我的细胞，然后才能将它从表面取出。首先，我要去除剩余的培养基，立即加入大约 2 mil 的 PBS，不要弄湿细胞。
我将等待大约两分钟，然后再去除 PBS 并放置销售解离缓冲液，以便将销售从高射炮的表面去除。现在我要去除 PBS，再一次，我要尝试立即添加细胞解离缓冲液，这样细胞就不会变干。因此，我将添加 1.5 mils 的细胞解离缓冲液。
与 PBS 不同的是，我将它直接添加到细胞中，并尝试覆盖尽可能多的表面。因此，我从一侧移动到另一侧，同时慢慢将这种缓冲液添加到细胞上。我现在要等待大约 5 分钟，让细胞开始从表面出来。
我将把培养瓶放在室温下放在通风橱中。正如你在这里看到的，单元格首先开始四舍五入，然后它们开始从表面出来，你实际上可以看到一些，一些单元格已经漂浮了。如果你在瓶子的侧面广泛敲击，这将有助于它们脱落。
所以已经过去了 5 分钟，正如你所看到的，溶液已经变得非常密集，里面有从表面脱落的细胞。现在，我将通过添加 4.5 mil 含血清的培养基来中和细胞解离缓冲液的作用。因此，我将在 D-M-E-M-F 12 培养基中使用 10% 热灭活的胎牛血清，并将其直接添加到培养瓶表面，以确保没有细胞残留附着。
我要轻轻地上下移液，以去除任何剩余的细胞。然后我将把细胞溶液转移到 15 mil 锥形管中。我将以 1000 RPM 的速度旋转一分钟。
所以电池已经完成了旋转，我们这里有一个漂亮的电池托盘。我将非常非常小心地去除血清培养基，不要试图干扰托盘。然后我将用 4 mil 的介质重新悬浮托盘。
因此，我将尝试重悬沉淀，以便没有细胞团块，这样溶液就会变得均匀，并且不包含团块。由于我正在进行 1 对 2 的分流，因此我将取 4 个研磨机中的 2 个，并将它们转移到已经包含 2 mil 条件培养基的新培养瓶中。最后，我将用细胞类型、传代次数和日期标记培养瓶。
这是我们半小时前传代的细胞。正如你所看到的，他们中的大多数已经附着在表面并开始发送进程。伙计们，就这些。
现在我准备好数数了。
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概述
该协议概述了一种在体外培养和传代人类神经干/前体细胞（hNSPCs）的方法。该技术旨在提高人类干细胞研究的可重复性，并促进神经发育和潜在治疗应用的探索。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 干细胞生物学
- 细胞培养技术
背景
- 人类神经干/前体细胞（hNSPCs）对于研究神经发育至关重要。
- hNSPCs的体外操作可以带来治疗进展。
- 干细胞研究中的可重复性对于科学进步至关重要。
- 细胞培养技术是神经科学研究的基础。
研究目的
- 提供一种可靠的hNSPCs培养方法。
- 促进hNSPCs在实验应用中的使用。
- 增强对人类神经发育的理解。
使用的方法
- 用人纤连蛋白涂层培养瓶。
- 使用细胞离解缓冲液提取细胞。
- 用血清溶液中和离解缓冲液。
- 离心并在新鲜培养基中重新悬浮细胞。
主要结果
- 使用所概述的方法成功传代hNSPCs。
- 改善了细胞培养实践的可重复性。
- 在免疫化学和转染实验中具有潜在应用。
- 建立了培养基更换和传代频率的常规。
结论
- 该协议提供了一种系统的hNSPCs培养方法。
- 可重复性的提高可以带来更好的实验结果。
- 进一步的研究可以探索hNSPCs的治疗潜力。
常见问题
Executive Industry Relevance
Standardized passaging of human neural stem/precursor cells (hNSPCs) supports reproducible in vitro models for target validation and mechanistic de-risking in neurodegenerative disease research. Reliable expansion of hNSPCs enables consistent assay inputs for phenotypic screening and lead identification programs. This protocol addresses variability in stem cell culture that can confound translational biomarker studies and preclinical model fidelity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of neural pathway modulation using genetically stable hNSPCs expressing nestin and SOX2.
- Operational Value: Reduces culture-induced variability that obscures target engagement readouts in early screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides adherent, bipolar morphology hNSPCs suitable for high-content imaging of neurite outgrowth or synaptic marker expression.
- Operational Value: Standardized 1:2 split every 7 days supports scalable seeding densities for multi-well plate assays.
- Strategic Value: Fibronectin-coated flasks improve attachment efficiency, reducing well-to-well inconsistency in compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains undifferentiated marker expression, preserving multipotency for differentiation into disease-relevant neuronal subtypes.
- Operational Value: Conditioned media carryover during passaging supports paracrine factor studies relevant to neuroinflammatory pathways.
Pipeline & Workflow Integration
This passaging method fits within the discovery continuum from target validation through assay optimization to preclinical model generation, where hNSPC consistency impacts data reliability across stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via controlled expansion of hNSPCs for CRISPR screening or overexpression studies.
- Screening: Enables reproducible plating densities for quantifying compound effects on cell viability or differentiation markers.
- Analytics: Yields homogeneous suspensions amenable to flow cytometry or immunocytochemistry for quantitative readouts.
- Translational Research: Connects to preclinical work by providing a scalable source for generating neurons or glia for transplantation efficacy studies.
- Enterprise Reuse: Defined coating and passaging frequency allows technology transfer across sites for multi-project stem cell programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in stem cell-derived assays through minimized passage-induced drift.
- Operational Value: Standardized dissociation and neutralization steps enhance day-to-day reproducibility.
- Strategic Value: Enables capital-efficient scale-up by reducing failed batches due to inconsistent subculture.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted decisions in neurodegenerative portfolios by improving data fidelity in target validation cascades.
Implementation Considerations
- Requires aseptic technique training for safe handling of dissociation buffers and serum supplements.
- Depends on access to human fibronectin-coated cultureware and sterile conical tubes for centrifugation.
- Necessitates standardization of passaging timing relative to confluence (~80%) to avoid overgrowth-induced differentiation.
- Adaptation to suspension or spheroid cultures would require matrix adjustments beyond adherent fibronectin coating.
- Limited to research-scale operations; GMP-compliant passaging would require closed-system bioreactors and qualified reagents.
