Name: 操纵细胞与细胞间相互作用的硅微芯片 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 23 min 21 s
Description: 学习利用硅微机械芯片动态调控肝细胞与基质细胞间的相互作用。该方法通过梳状装置精确控制细胞空间排布，为研究细胞间接触依赖及旁分泌信号传导提供创新平台，助力发育生物学与疾病机制探索。

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作者感谢 Salman Khetani、Jared Allen、Chris Flaim 和 Austin Derfus 在设计本装置过程中提供的有益讨论。本研究得到了美国国家科学基金会教师早期职业发展计划、美国国立卫生研究院/国家糖尿病与消化及肾脏疾病研究所以及大卫和露西尔·帕卡德基金会的资助。E.E.H. 获得了露丝·L·卡什坦国家研究服务奖的支持。

细胞培养物的制备：
<ol>
<li>从经等离子体处理的聚苯乙烯涂层硅部件开始。</li>
<li>用适当的细胞外基质蛋白包被部件，以支持目标细胞类型的贴附。对于肝细胞，在37°C下用50 µg/mL I型胶原溶液孵育45分钟；对于3T3成纤维细胞，则无需基质。</li>
<li>将部件与互补部件以接触构型锁定。</li>
<li>用70%乙醇浸泡至少10分钟以灭菌，随后用ddH2O冲洗两次，再用细胞培养基冲洗一次。</li>
<li>在适当的培养基中以500,000个细胞/mL的浓度接种细胞。每孔12孔培养板中加入1 mL细胞悬液。</li>
<li>孵育1小时，每隔15分钟轻轻振摇一次，使细胞均匀重悬。</li>
<li>若1小时后仍未形成融合单层，吸除细胞悬液，并使用新鲜细胞悬液重复接种。重复此步骤直至达到所需细胞密度。</li>
<li>移除互补部件，将部件转移至新的培养孔中，过夜孵育以使细胞充分贴附和铺展。</li>
<li>通过将适当部件以间隙或接触构型锁定，形成共培养体系。在培养过程中可于任意时间点切换构型。</li>
<li>更换培养基时，应尽量减少细胞暴露于干燥环境的时间，最好仅一至两秒。一手吸出旧培养基的同时，另一手立即加入新鲜培养基。</li>
</ol>
硅部件再利用的处理：
<ol>
<li>用漂白剂浸泡细胞并用水冲洗以去除残留物。</li>
<li>让部件完全干燥。用甲苯浸泡2小时以去除聚苯乙烯。</li>
<li>使用加热至120°C的piranha溶液（1:2 H2O2:H2SO4）进行清洗。</li>
<li>在ddH2O持续流动下冲洗15分钟。如果未立即沉积聚苯乙烯，请将部件保存在水中。</li>
<li>将聚苯乙烯溶于甲苯中，浓度为100 mg/ml。在聚丙烯锥形管中涡旋约1小时，直至完全溶解。每10个部件需要略多于1 ml的溶液。</li>
<li>在单个硅部件上以2,400 rpm转速旋涂聚苯乙烯溶液，持续30秒。</li>
<li>在120°C下烘烤至少5小时。</li>
<li>用氧气等离子体（200 mTorr，200 W）处理1分钟。</li>
</ol>

<ol><li>Hui, E. E., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromechanical+control+of+cell-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Micromechanical control of cell-cell interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 
	
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=17389399&ordinalpos=2&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=17389399&ordinalpos=2&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum</a> 5722-5726 (2007).</li>
<li>Bhatia, S. N., Balis, U. J., Yarmush, M. L., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cell-cell+interactions+in+preservation+of+cellular+phenotype%3A+cocultivation+of+hepatocytes+and+nonparenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Effect of cell-cell interactions in preservation of cellular phenotype: cocultivation of hepatocytes and nonparenchymal cells.</a> The FASEB Journal. 13, 
	
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=10544172&ordinalpos=2&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=10544172&ordinalpos=2&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum</a> 1883-1900 (1999).</li>
<li>El-Ali, J., Sorger, P. K., Jensen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+on+Chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cells on Chips.</a> Nature. 442, 
	
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=16871208&ordinalpos=2&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=16871208&ordinalpos=2&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum</a> 403-411 (2006).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该系统的独特之处在于，能够在细胞水平上动态调控组织的空间结构。因此，该装置已实现多种新颖的生物学实验，涵盖细胞间信号传导动力学、接触介导信号与可溶性信号的比较、细胞命运决定、毒理学以及细胞间串扰等研究领域。由于培养基质为标准的组织培养塑料，且系统与常规培养方法和检测手段兼容，该装置应具有广泛的通用性。因此，我们认为该平台作为一种研究多种不同类型细胞与组织间细胞相互作用的工具，将引起广泛关注。

<table><tbody><tr><td>硅梳基底</td><td>工具</td><td>不适用</td><td>不适用</td><td>相关部件可提供用于合作研究项目。请联系 Elliot Hui（eehui @ alum . mit . edu）或 Sangeeta Bhatia（sbhatia @ mit . edu）。</td></tr></tbody></table>

用于调控细胞间相互作用的硅基微芯片

Silicon Microchips for Manipulating Cell-cell Interaction

人们认识到，细胞微环境在从发育到恶性转化的几乎所有哺乳动物组织中，对细胞命运和功能的决定都起着至关重要的作用。&nbsp; 特别是，细胞与邻近间质的相互作用已被证实参与多种生物学现象；然而，传统技术限制了对这些相互作用的空间特征和动态过程进行深入探究的能力。
在微机械可重构培养（RC）中，我们采用带有可动部件的微加工硅基底，通过机械重定位动态调控细胞间相互作用。此前，该方法已用于研究肝细胞与非实质细胞共培养中的细胞间通讯，证实了具有时间依赖性的相互作用以及可溶性信号分子作用范围的局限性1。
本文详细描述了RC系统的制备与使用方法。首先，我们演示如何使用镊子操作装置的各个部件，包括在间隙与接触两种构型之间进行切换（细胞群之间被一个狭窄的80 µm间隙分隔，或处于直接且紧密的接触状态）。接着，我们详细说明培养基底的制备过程，以及为获得融合单层细胞所需的多步骤接种流程。通过活细胞显微镜观察，我们进一步展示了在不同实验构型之间实时操控细胞的过程。最后，我们演示了装置表面再生以实现重复使用所需的步骤：甲苯和piranha溶液清洗、聚苯乙烯涂层处理以及氧气等离子体处理。

本文介绍了一种在微米尺度上动态调控贴壁细胞间相互作用的实验方法。文中展示了对肝细胞与基质细胞之间细胞间通讯的操控。该平台可用于研究多种生物过程中的细胞间相互作用，包括发育和发病机制。

细胞微环境的作用在几乎所有哺乳动物组织中对细胞命运和功能的决定都至关重要……

您好，我是 Elliot Hu，目前在麻省理工学院 Tia 的实验室担任博士后研究员。今天我们将要在硅基微机械芯片上进行细胞培养。这些装置看起来像可以相互锁定的小梳子，能够让我们精确调控两种不同细胞群体之间的相互作用。今天我们将研究肝实质细胞与支持性间质细胞之间的相互作用。具体而言，将三种T3成纤维细胞培养在梳状结构的上表面，通过移动梳齿，即可带动细胞并改变其空间排列。每个装置分为两个部分，可扣合形成两种可能的构型。第一种情况使两种细胞群相互接触。第二种情况则使两种细胞群略微分离，从而使细胞无法相互接触。此时，细胞间的直接接触被阻止，但通过分泌因子进行的相互作用得以保留。首先，我们来讨论如何使用镊子操作这些部件。我喜欢同时使用较大的聚四氟乙烯镊子和较小的圆头金属镊子。使用较大的镊子时，可以像这样从较大部件的边缘夹取；而对于带有臂状结构的部件，必须小心不要折断这些臂，因为它们非常脆弱。因此，您应像这样从部件的背面夹取。使用金属镊子，可以伸入孔中直接夹取芯片。较大的部件可放入12孔板的孔壁中，而较小的部件则可放入24孔板中，或与较大的部件配对使用。在12孔板中，我通常使用金属镊子。当我在孔板中操作部件并将两个部件卡合在一起时，通常先将较大的部件放入孔中，并将其推到孔的一侧。然后取互补的修复部件放在孔的另一侧，再用两把镊子分别插入两个孔中，将它们推合在一起。现在，我可以将部件锁定在一起，无论是采用间隙配置还是接触配置。如果需要将部件拆开，我倾向于先将部件拉开至间隙配置，然后垂直向上提拉以取下部件。这些装置由硅制成，因此需要进行涂层处理，以促进细胞的正常黏附。您收到的装置很可能已经预先涂覆了聚苯乙烯并经过等离子处理，因此我们将以此作为起始点。首先，我们将使用胶原蛋白对肝细胞将要附着的表面进行包被。将肝细胞梳放入浓度为每毫升50微克的胶原蛋白溶液中，在37°C下孵育45分钟。另一方面，成纤维细胞梳不需要进行包被。孵育后，我们吸除胶原溶液，并用清水洗涤。首先，我们将一些孔中加入70%乙醇。我会在每个孔中放入一对部件，然后将它们锁紧。锁紧后，我们需要在显微镜下观察这些部件，以确保它们共面。偶尔部件会错位卡合。在显微镜下，您会观察到它们位于两个不同的焦平面上。此时，只需将部件分开，然后重新对齐并推合。确认对齐无误后，将部件在乙醇中放置一段时间以进行消毒。我经常比较匆忙，所以通常只浸泡10分钟。灭菌后，我们需要彻底冲洗。先用乙醇充分吸除，再用水洗涤，然后再次吸除并用水清洗，最后吸去水分，并换用培养基。现在将细胞接种到装置上。通常，我们将细胞重悬于浓度为 500,000 个细胞/毫升的培养基中，并使用 12 孔板，将每孔 1 毫升的细胞悬液加至每个梳状电极对上。因此，我们在两个孔中以每毫升 500,000 个细胞的密度接种了成纤维细胞。同样，我们取每孔500,000个肝细胞的悬

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生物学

操纵细胞与细胞间相互作用的硅微芯片

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