Name: 操纵细胞与细胞间相互作用的硅微芯片 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 23 min 21 s
Description: 学习利用硅微机械芯片动态调控肝细胞与基质细胞间的相互作用。该方法通过梳状装置精确控制细胞空间排布，为研究细胞间接触依赖及旁分泌信号传导提供创新平台，助力发育生物学与疾病机制探索。

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作者感谢 Salman Khetani、Jared Allen、Chris Flaim 和 Austin Derfus 在设计本装置过程中提供的有益讨论。本研究得到了美国国家科学基金会教师早期职业发展计划、美国国立卫生研究院/国家糖尿病与消化及肾脏疾病研究所以及大卫和露西尔·帕卡德基金会的资助。E.E.H. 获得了露丝·L·卡什坦国家研究服务奖的支持。

细胞培养物的制备：
<ol>
<li>从经等离子体处理的聚苯乙烯涂层硅部件开始。</li>
<li>用适当的细胞外基质蛋白包被部件，以支持目标细胞类型的贴附。对于肝细胞，在37°C下用50 µg/mL I型胶原溶液孵育45分钟；对于3T3成纤维细胞，则无需基质。</li>
<li>将部件与互补部件以接触构型锁定。</li>
<li>用70%乙醇浸泡至少10分钟以灭菌，随后用ddH2O冲洗两次，再用细胞培养基冲洗一次。</li>
<li>在适当的培养基中以500,000个细胞/mL的浓度接种细胞。每孔12孔培养板中加入1 mL细胞悬液。</li>
<li>孵育1小时，每隔15分钟轻轻振摇一次，使细胞均匀重悬。</li>
<li>若1小时后仍未形成融合单层，吸除细胞悬液，并使用新鲜细胞悬液重复接种。重复此步骤直至达到所需细胞密度。</li>
<li>移除互补部件，将部件转移至新的培养孔中，过夜孵育以使细胞充分贴附和铺展。</li>
<li>通过将适当部件以间隙或接触构型锁定，形成共培养体系。在培养过程中可于任意时间点切换构型。</li>
<li>更换培养基时，应尽量减少细胞暴露于干燥环境的时间，最好仅一至两秒。一手吸出旧培养基的同时，另一手立即加入新鲜培养基。</li>
</ol>
硅部件再利用的处理：
<ol>
<li>用漂白剂浸泡细胞并用水冲洗以去除残留物。</li>
<li>让部件完全干燥。用甲苯浸泡2小时以去除聚苯乙烯。</li>
<li>使用加热至120°C的piranha溶液（1:2 H2O2:H2SO4）进行清洗。</li>
<li>在ddH2O持续流动下冲洗15分钟。如果未立即沉积聚苯乙烯，请将部件保存在水中。</li>
<li>将聚苯乙烯溶于甲苯中，浓度为100 mg/ml。在聚丙烯锥形管中涡旋约1小时，直至完全溶解。每10个部件需要略多于1 ml的溶液。</li>
<li>在单个硅部件上以2,400 rpm转速旋涂聚苯乙烯溶液，持续30秒。</li>
<li>在120°C下烘烤至少5小时。</li>
<li>用氧气等离子体（200 mTorr，200 W）处理1分钟。</li>
</ol>

<ol><li>Hui, E. E., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromechanical+control+of+cell-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Micromechanical control of cell-cell interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 
	
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=17389399&ordinalpos=2&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=17389399&ordinalpos=2&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum</a> 5722-5726 (2007).</li>
<li>Bhatia, S. N., Balis, U. J., Yarmush, M. L., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cell-cell+interactions+in+preservation+of+cellular+phenotype%3A+cocultivation+of+hepatocytes+and+nonparenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Effect of cell-cell interactions in preservation of cellular phenotype: cocultivation of hepatocytes and nonparenchymal cells.</a> The FASEB Journal. 13, 
	
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=10544172&ordinalpos=2&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=10544172&ordinalpos=2&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum</a> 1883-1900 (1999).</li>
<li>El-Ali, J., Sorger, P. K., Jensen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+on+Chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cells on Chips.</a> Nature. 442, 
	
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=16871208&ordinalpos=2&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=16871208&ordinalpos=2&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum</a> 403-411 (2006).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该系统的独特之处在于，能够在细胞水平上动态调控组织的空间结构。因此，该装置已实现多种新颖的生物学实验，涵盖细胞间信号传导动力学、接触介导信号与可溶性信号的比较、细胞命运决定、毒理学以及细胞间串扰等研究领域。由于培养基质为标准的组织培养塑料，且系统与常规培养方法和检测手段兼容，该装置应具有广泛的通用性。因此，我们认为该平台作为一种研究多种不同类型细胞与组织间细胞相互作用的工具，将引起广泛关注。

<table><tbody><tr><td>硅梳基底</td><td>工具</td><td>不适用</td><td>不适用</td><td>相关部件可提供用于合作研究项目。请联系 Elliot Hui（eehui @ alum . mit . edu）或 Sangeeta Bhatia（sbhatia @ mit . edu）。</td></tr></tbody></table>

用于调控细胞间相互作用的硅基微芯片

Silicon Microchips for Manipulating Cell-cell Interaction

人们认识到，细胞微环境在从发育到恶性转化的几乎所有哺乳动物组织中，对细胞命运和功能的决定都起着至关重要的作用。&nbsp; 特别是，细胞与邻近间质的相互作用已被证实参与多种生物学现象；然而，传统技术限制了对这些相互作用的空间特征和动态过程进行深入探究的能力。
在微机械可重构培养（RC）中，我们采用带有可动部件的微加工硅基底，通过机械重定位动态调控细胞间相互作用。此前，该方法已用于研究肝细胞与非实质细胞共培养中的细胞间通讯，证实了具有时间依赖性的相互作用以及可溶性信号分子作用范围的局限性1。
本文详细描述了RC系统的制备与使用方法。首先，我们演示如何使用镊子操作装置的各个部件，包括在间隙与接触两种构型之间进行切换（细胞群之间被一个狭窄的80 µm间隙分隔，或处于直接且紧密的接触状态）。接着，我们详细说明培养基底的制备过程，以及为获得融合单层细胞所需的多步骤接种流程。通过活细胞显微镜观察，我们进一步展示了在不同实验构型之间实时操控细胞的过程。最后，我们演示了装置表面再生以实现重复使用所需的步骤：甲苯和piranha溶液清洗、聚苯乙烯涂层处理以及氧气等离子体处理。

本文介绍了一种在微米尺度上动态调控贴壁细胞间相互作用的实验方法。文中展示了对肝细胞与基质细胞之间细胞间通讯的操控。该平台可用于研究多种生物过程中的细胞间相互作用，包括发育和发病机制。

细胞微环境的作用在几乎所有哺乳动物组织中对细胞命运和功能的决定都至关重要……

您好，我是 Elliot Hu，目前在麻省理工学院 Tia 的实验室担任博士后研究员。今天我们将要在硅基微机械芯片上进行细胞培养。这些装置看起来像可以相互锁定的小梳子，能够让我们精确调控两种不同细胞群体之间的相互作用。今天我们将研究肝实质细胞与支持性间质细胞之间的相互作用。具体而言，将三种T3成纤维细胞培养在梳状结构的上表面，通过移动梳齿，即可带动细胞并改变其空间排列。每个装置分为两个部分，可扣合形成两种可能的构型。第一种情况使两种细胞群相互接触。第二种情况则使两种细胞群略微分离，从而使细胞无法相互接触。此时，细胞间的直接接触被阻止，但通过分泌因子进行的相互作用得以保留。首先，我们来讨论如何使用镊子操作这些部件。我喜欢同时使用较大的聚四氟乙烯镊子和较小的圆头金属镊子。使用较大的镊子时，可以像这样从较大部件的边缘夹取；而对于带有臂状结构的部件，必须小心不要折断这些臂，因为它们非常脆弱。因此，您应像这样从部件的背面夹取。使用金属镊子，可以伸入孔中直接夹取芯片。较大的部件可放入12孔板的孔壁中，而较小的部件则可放入24孔板中，或与较大的部件配对使用。在12孔板中，我通常使用金属镊子。当我在孔板中操作部件并将两个部件卡合在一起时，通常先将较大的部件放入孔中，并将其推到孔的一侧。然后取互补的修复部件放在孔的另一侧，再用两把镊子分别插入两个孔中，将它们推合在一起。现在，我可以将部件锁定在一起，无论是采用间隙配置还是接触配置。如果需要将部件拆开，我倾向于先将部件拉开至间隙配置，然后垂直向上提拉以取下部件。这些装置由硅制成，因此需要进行涂层处理，以促进细胞的正常黏附。您收到的装置很可能已经预先涂覆了聚苯乙烯并经过等离子处理，因此我们将以此作为起始点。首先，我们将使用胶原蛋白对肝细胞将要附着的表面进行包被。将肝细胞梳放入浓度为每毫升50微克的胶原蛋白溶液中，在37°C下孵育45分钟。另一方面，成纤维细胞梳不需要进行包被。孵育后，我们吸除胶原溶液，并用清水洗涤。首先，我们将一些孔中加入70%乙醇。我会在每个孔中放入一对部件，然后将它们锁紧。锁紧后，我们需要在显微镜下观察这些部件，以确保它们共面。偶尔部件会错位卡合。在显微镜下，您会观察到它们位于两个不同的焦平面上。此时，只需将部件分开，然后重新对齐并推合。确认对齐无误后，将部件在乙醇中放置一段时间以进行消毒。我经常比较匆忙，所以通常只浸泡10分钟。灭菌后，我们需要彻底冲洗。先用乙醇充分吸除，再用水洗涤，然后再次吸除并用水清洗，最后吸去水分，并换用培养基。现在将细胞接种到装置上。通常，我们将细胞重悬于浓度为 500,000 个细胞/毫升的培养基中，并使用 12 孔板，将每孔 1 毫升的细胞悬液加至每个梳状电极对上。因此，我们在两个孔中以每毫升 500,000 个细胞的密度接种了成纤维细胞。同样，我们取每孔500,000个肝细胞的悬液，接种到另外两孔中。现在，在孵育之前，我们将充分振荡细胞，以确保其均匀分布。我通常先垂直振荡三次，再水平振荡三次，然后重复该操作共三次。振荡后，将样品放入培养箱中，让细胞静置15分钟，之后再次进行振荡。每15分钟振荡一次，持续一小时后，吸除细胞悬液，并接种至新的细胞悬液中。重复此过程，直至获得融合的细胞层。通常情况下，成纤维细胞需要贴壁一到两次，而肝细胞则可能需要两到四次贴壁。为了获得融合的单层细胞，需以较高的密度进行接种，并通过摇动确保细胞均匀分布。初次接种后，会形成一层稀疏的细胞。注意，细胞仅附着在涂有聚苯乙烯和胶原蛋白的指状结构上。再次接种新鲜细胞并继续孵育一小时，期间每15分钟摇动一次，细胞层逐渐变得更加致密。第三次接种后，我们获得了理想的细胞密度，此时可以在细胞接种到梳状结构上后停止操作。接下来，我们需要将细胞调控至目标实验构型。随后，将装置与其互补部件分离，并继续孵育24小时。24 小时后，细胞已铺展并在梳状结构表面形成融合的单层。现在我们需要建立共培养体系。将肝细胞梳和成纤维细胞梳转移至同一孔中，并锁定为所需的初始构型。如有需要，可在一定时间后更改构型。例如，我们可在18小时后转换为间隙构型，将部件放入相同位置，紧密推合直至达到间隙构型，然后再推入接触状态，重新回到间隙构型。现在我们将移除一个腔室。接下来的操作流程是：去除聚苯乙烯的旧涂层，清洗芯片，然后涂上新的聚苯乙烯涂层，并为细胞培养做好准备。通过去除旧的聚苯乙烯涂层并重新涂覆新鲜涂层，我们可以确保先前实验的任何残留因素都不会干扰新的实验。实验结束后，首先需要对细胞进行漂白处理，然后用水冲洗干净梳子。在将芯片放入toing之前，务必确保芯片完全干燥。这里有几个梳子，我刚刚放置了一段时间使其自然风干，并检查是否已完全干燥。现在，我们将取一些四氢大麻酚（THC）放入这个玻璃扬声器中。这里将使用玻璃移液管，以避免其溶解。由于四氢大麻酚会溶解塑料，因此不能使用普通的聚苯乙烯移液管。好了，差不多就这些。现在我们取其中几部分放入容器中，打开振荡器进行振荡，并用铝箔覆盖，以防止甲苯挥发。经过两小时后，甲苯应已溶解梳子上的大部分聚苯乙烯，此时我们只需将梳子取出，并在空气中干燥即可。万圣节冲洗后，各部件应基本不含聚苯乙烯，且相对洁净。然而，我们需要部件达到极高的清洁度，以确保新一层聚苯乙烯能够良好附着；若清洁度不足，当细胞开始对其施加拉力时，聚苯乙烯层容易在实验过程中发生剥离。接下来我们要进行的是过硫酸混合液清洗。我已经将部件放入一个玻璃烧杯中，接下来要对其进行加热，因此我们要将其放在加热板上。这里我们有硫酸和过氧化氢。我将先倒入硫酸，并确保所有芯片都浸没在液体下方。有时它们容易漂浮。此外，由于我们现在正在处理具有较强腐蚀性的化学品，务必确保穿戴适当的防护装备。这里，我佩戴的是腈类手套。接下来，我们将把过氧化氢倒入酸中，操作时需格外小心，因为这是一个放热反应。因此，你可以看到反应过程中会冒出一些烟，但我们需要向体系中加入更多能量以使其反应性更强。现在我们将温度升至约120摄氏度，目前已经接近120度，这样你就可以完全放心，芯片上残留的任何细胞培养物都将被彻底清除。此时，你只需让反应进行到底，直至所有过氧化氢被完全消耗。此时，混合物将停止冒泡。反应大约需要半小时才能完成。当看不到气泡产生时，即可关闭加热板，让其自然冷却。然后将它们转移到BAK曲线水中。再次强调，此处必须使用聚四氟乙烯镊子，而非金属镊子，可直接夹取并转移。接下来，我们将用去离子水（DDH₂O）在持续水流下冲洗，我通常直接从纯水机接水，并让水流持续至少10分钟。通过上述操作，我们将用流水冲洗切碎后的样品10分钟，以彻底去除所有酸的残留。应将酸从样品片中完全去除，随后将其保存在水中，直至准备进行包被。包被所用的材料为来自Sigma的分子量为45,000的聚苯乙烯。接下来，我们将称取少量该聚苯乙烯用于实验。我们有 400 毫克样品，将用甲苯以每毫升 100 毫克的浓度进行溶解。因此，甲苯必须在通风橱中操作。另外，由于我们将使用甲苯来溶解聚苯乙烯，需确保不使用任何由聚苯乙烯制成的实验防护用品。这里我们使用聚丙烯锥形管和玻璃移液管。由于我有400毫克的聚苯乙烯，我将加入4毫升的四氢呋喃。接下来，我们将涡旋混合半小时，直到聚苯乙烯完全溶解。现在，我们将以最低速度涡旋混合约20分钟至半小时。现在我将把试管连接到涡旋振荡器上。我不需要一直用手按住。经过20到30分钟后，聚苯乙烯应已溶解，此时我们就可以进行包被了。现在我们将在实验室内进行聚苯乙烯的旋涂。我们的旋涂仪位于洁净室中，因此在这里我们必须佩戴帽子、护目镜、实验服、鞋套和手套，但你们实验室的规定可能有所不同。在使用此卡盘之前，我想保护它免受聚苯乙烯的影响。因此，我们将用铝箔将其包裹，并尽可能使其紧贴表面，以便芯片能够平整地贴合在表面上。我们将在中心位置戳一个小孔，以便能够对芯片保持真空。将旋涂仪设定为 2,400 RPM，持续 30 秒。现在我们可以取其中一块芯片，将其放置在中心位置以覆盖住孔洞。我在放置聚苯乙烯时会先关闭真空，然后打开真空，再启动旋转。对于较小的区域，我们只需滴加略少于 10 滴即可。对于较大的部件，需要使用略多于10滴的聚苯乙烯溶液。我们将在2,400 RPM的转速下旋转30秒。接下来，我们将取涂有聚苯乙烯的芯片，放入120°C的烘箱中，该温度高于聚苯乙烯的玻璃化转变温度。因此，这将使表面重新流动，略微变得平滑，同时也会使塑料致密化并硬化。通常我会将其在烤箱中放置过夜。该过程可能至少需要数小时才能完成。经过一夜烘烤后，芯片即可进行等离子体处理。接下来，我们将聚苯乙烯暴露于氧气等离子体中，这会改变其表面能，从而使蛋白质和细胞更易附着。现在，我们只需将芯片装入等离子体腔室，并抽真空至所需真空度。一个合适的设置是在氧气流下，使用200毫托的真空度和200瓦的功率处理一分钟。现在系统已抽至所需真空，我们将引入氧气。好的，现在可以打开射频电源，激发等离子体并维持一分钟。当等离子体运行时，它实际上会发光，就像荧光灯管一样。经过一分钟的等离子体处理后，我们将压力恢复至大气压，然后就可以取出部件了。现在，各部件已准备好进行蛋白包被和细胞培养。设计该装置的目标是使我们能够以动态方式调控组织的微结构。因此，体内组织的微观结构，特别是细胞相对于彼此的位置，在体外培养中对决定每个特定细胞的功能至关重要。直到最近，我们还无法很好地实现这一点。但在过去五到十年间，人们开始能够将细胞微图案化地排列在组织培养基质上，从而将细胞精确地放置在组织培养板中我们希望其所在的位置。通过这种方式，已经能够发现一些关于细胞间相互作用在微尺度下基本生物学的重要方面。然而，到目前为止，我们尚未能够动态地实现这一过程。这是指在实验过程中改变细胞培养的结构。这一点非常重要，因为在生物体内，组织并非静态环境。细胞会移动并重新排列，尤其是在伤口愈合或发育过程中。但即使是在处于稳态的正常器官中，也有大量物质在不断移动。学习过程中最困难的技术环节是如何在物理操作上精准地处理这些部分。在刚开始使用该系统时，你可能会因为这些部件的脆弱性，或所需操作动作的微小程度而感到畏惧。但我认为，只要稍加练习，应该不会遇到太大困难。在某些应用场景中，例如胚胎发育过程中，当细胞穿过不同的胚胎层时，会与一系列不同的细胞微环境发生接触。已知细胞在依次接触各层时所产生的相互作用，会逐步推动细胞向特定的分化路径发展。因此，我们认为这类装置可能适用于在实验室中模拟此类事件。我们特别希望研究的微环境组织的一个方面，是细胞通过接触相互作用进行通讯与通过分泌可溶性因子进行通讯之间的差异：前者指细胞膜彼此直接接触，后者指因子被分泌到周围培养基中，并扩散至稍远一些的细胞。很多时候，当细胞处于共培养状态并相互产生影响时，尚不明确这种作用是由细胞接触介导，还是由分泌的因子所导致。

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