操纵细胞与细胞间相互作用的硅微芯片

嗨，我是 Elliot 胡，我是麻省理工学院 Tia 实验室的博士后研究员。今天，我们将在硅微机械芯片上制备细胞培养物。这些设备看起来像锁定在一起的小梳子，它们使我们能够精确纵两个不同细胞群之间的相互作用。

今天，我们将研究肝细胞和支持基质细胞之间的相互作用。具体来说，三个 T 3 成纤维细胞在梳子的顶面上培养，因此通过移动梳子手指，您可以移动细胞并改变它们的空间排列。每个器件都分为两部分，它们以两种可能的配置卡在一起。

第一个使两个细胞群相互接触。第二个将两个群体稍微分开，使细胞无法接触。在这里，将阻止接触交互，但会保留通过分泌因子的交互。

让我们先谈谈如何用镊子处理零件。我喜欢使用较大的特氟龙镊子和较小的圆尖金属镊子。使用较大的镊子，您可以像这样用手臂拾取较大的部分，您必须小心不要折断手臂，因为它们非常脆弱。

所以你想像这样在零件的后面拾取它们。使用金属镊子，您可以伸入孔中直接拾取芯片。较大的部件将适合 12 孔板的壁，而较小的部件将适合 24 孔板或可以与较大的部件配对。

在 12 孔板中，通常使用金属镊子。当我处理板中的部件以将两个部件卡在一起时，通常我会先将较大的部件放入孔中，然后将其一直推到一侧。然后我拿起免费的维修物，把它放在井的另一边，我用两把镊子把它们推在一起，每个孔里一把。

所以现在我可以在 gap 配置或 contact 配置中将零件锁定在一起。如果我想把零件拆开，我喜欢把零件拉到间隙配置，然后垂直向上拉来卸下零件。现在这些设备是由硅制成的，因此需要对其进行涂层以允许适当的电池粘附。

您可能会收到已经涂有聚苯乙烯和等离子体处理的设备，因此我们假设这是我们的起点。首先，我们将使用胶原蛋白来覆盖肝细胞将附着的表面。我们将肝细胞梳放入每磨 50 微克胶原蛋白（一种溶液）中，并在 37 C 下孵育 45 分钟。

另一方面，成纤维细胞梳子，我们不需要涂层。孵育后，我们吸出胶原蛋白溶液并洗涤并加水。现在，我们将 ES 与互补部件接触，以便形成用于细胞接种的平面。

首先，我们将用 70% 乙醇填充一些井。我将在每个孔中放入一对，然后将它们锁定在一起。锁定在一起后，我们想在显微镜下观察零件，以确保有共面。

有时，零件可能会锁定在一起，错位。在显微镜上，你会看到它们位于两个不同的焦平面上。在这种情况下，只需将部件分开并将它们推回原处。检查对齐正常后，我们将部件在乙醇中放置一段时间进行消毒。

我经常很匆忙，所以我只泡了 10 分钟。消毒后，我们需要冲洗干净。乙醇彻底吸出并在水中洗涤，然后吸出并再次在水中洗涤，最后吸出水并替换为您的培养基。

现在让我们将 Cells Seed 到设备上。通常，我们以每毫升 500， 000 个细胞的浓度悬浮细胞，并使用 12 孔板在每个梳子对上移液 1 毫升悬浮液。因此，我们以每毫升 500， 000 个细胞的密度接种在其中两个孔中。

同样，我们取每孔 500， 000 个肝细胞的悬浮液，并将它们接种到其他两个孔中。现在，在孵育之前，我们将彻底摇晃细胞，以确保它们均匀分布。我喜欢垂直摇晃 3 次，水平摇晃 3 次，然后重复 3 次。

摇动后，我们将其放入培养箱中，让细胞静置 15 分钟，然后再次摇动它们。每 15 分钟摇晃一次 1 小时后，我们将吸出细胞悬液，并在新的细胞悬液上进行研究。我们将重复此作，直到我们得到一个融合的细胞层。

通常对于成纤维细胞，需要一个或两个座位。对于肝细胞，可能需要 2 到 4 个座位。为了获得汇合的单层，将细胞以相当高的密度放置，振荡以确保细胞均匀分布。

在第一次就座后，形成一个稀疏的细胞层。请注意，细胞仅附着在涂有聚苯乙烯和胶原蛋白的手指上。接种新鲜细胞并再孵育一小时后，再次每 15 分钟摇动一次，细胞层变得更致密。

第三次接种后，我们获得了良好的细胞密度，现在我们可以在将细胞接种到蜂巢上后停止接种。我们想将细胞纵成所需的实验配置。现在，设备与其互补部件分离并孵育 24 小时。

24 小时后，细胞扩散，在梳子表面形成汇合的单层。现在我们想形成一种共生文化。肝细胞梳和成纤维细胞梳现在转移到同一孔中并锁定在一起，形成所需的初始配置。

如果需要。一段时间后，您可以更改配置。例如，我们可以在 18 小时后移动到间隙配置，将零件放入相同的位置，充分推在一起，直到达到间隙配置，然后将触点推回间隙配置中。

现在我们要 Remove one comb（删除一个梳子）。我们现在要做的是：剥去旧的聚苯乙烯涂层，清洁芯片，然后涂上新的聚苯乙烯涂层，为细胞培养做准备。同样，通过剥去旧的聚苯乙烯涂层并穿上新的涂层，我们确保先前实验的历史不会干扰新的实验。

因此，在完成实验后，您要做的第一件事是漂白细胞，然后冲洗掉梳子和水。因此，在将筹码放入脚趾之前，您需要确保它们完全干燥。所以在这里，我们有一些梳子，我刚刚把它们放在外面风干一会儿，并检查它是否完全干燥。

所以现在我们要把它放进这个玻璃扬声器中。在这里使用玻璃移液器，这样我们就不会溶解它。万圣节会溶解塑料，因此我们不能使用典型的聚苯乙烯移液器。

好吧，这就够了。现在我们取几个零件，将它们放入脚趾中，我要打开摇床进行搅拌，然后用铝箔覆盖它，以防止甲苯蒸发。所以两个小时后，甲苯应该已经溶解了梳子上的大部分聚苯乙烯，我们只需将它们拉出并风干梳子即可。

万圣节漂洗后，部件应相对不含聚苯乙烯，并且应相对干净。但是，我们需要零件非常干净，这样如果它们不是非常干净，新的聚苯乙烯层就会形成良好的粘合力。当细胞开始拉扯它时，聚合物往往会在实验过程中剥落。

所以我们现在要做的是食人鱼酸洁净。我已经把零件放进一个玻璃扬声器里，我们要加热它。所以我们要放一个热板。

这里我们有硫酸和过氧化氢。我首先要倒入硫酸，然后确保所有木屑都浸入液体下方。有时它们有漂浮的倾向。

而且，现在我们正在使用腐蚀性很强的化学品，请确保您佩戴了正确的防护装备。这里。我戴着丁腈手套。现在我们要将过氧化氢倒入酸中，注意这里，因为这是一个放热反应。

所以你可以看到它在反应时有点冒烟，但我们想向系统中添加一些能量，使其反应性更强。所以现在我们要把它加热到 120 摄氏度，大约在 1 20 摄氏度，这样您就可以放心，细胞培养物的任何残留物都会从芯片上完全清除。所以在这一点上，你只想让反应完全进行，直到所有的过氧化氢都被消耗掉。

到那时，混合物将停止冒泡。所以反应大约需要半小时才能进行。在您不再看到气泡后，您可以关闭热板并让它冷却。

我们要将它们转移到 BAK 曲线水中。再一次，确保您在这里使用的是特氟龙镊子，而不是金属镊子，您可以捡起它们，将它们转移过来。所以现在我们只是在稳定的 DDH 流下冲洗它，两个 O.I 通常直接从 Meine 取它，我们会让它在这里运行 10 分钟。

通过这样做，我们将在水流下切碎 10 分钟后洗掉所有酸的痕迹。应该从木片中重新去除酸，我们将将它们存放在水下，直到我们准备好涂覆我们从 Sigma 获得的 45， 000 分子量聚苯乙烯。我们将在这里称量一小部分。

我们有 400 毫克，我们打算以每毫升 100 毫克的浓度将其溶解在甲苯中。所以甲苯需要在引擎盖中处理。另一件事是，由于我们要使用甲苯来溶解聚苯乙烯，因此我们希望确保不使用任何由聚苯乙烯制成的实验室服装。

所以这里我们使用聚丙烯、锥形和玻璃移液器。因此，由于我有 400 毫克的聚苯乙烯，我要放入 4 毫升的 toing，现在我们要涡旋半小时，直到聚苯乙烯溶解。所以现在我们只需以最低速度涡旋管子大约 20 分钟到半小时。

所以我要把管子连接到漩涡上。我不必一直把它放在那儿。20 到 30 分钟后，聚苯乙烯应该溶解，我们就可以涂上它了。

现在，我们将在我们的工厂中对聚苯乙烯进行旋涂。我们的旋转打码机位于洁净室设施中。所以在这里，我们必须戴上帽式护目镜、长袍、靴子和手套，但在您的设施中，这可能不一样。

在我们使用此卡盘之前，我想保护它免受聚苯乙烯的影响。因此，我们将用铝箔覆盖它，我们希望使其尽可能平整到表面，以便芯片可以与表面齐平。我们将在中心戳一个小孔，这样我们就可以在芯片上保持真空。

旋转编码器设置为 2、400 RPM 和 30 秒。现在我们可以取一个芯片，放置它，使芯片的中心盖住孔，当我打开聚苯乙烯时，我首先要关闭真空，打开真空，然后开始旋转。因此，对于较小的部件，我们可以滴下不到 10 滴。

对于较大的部分，需要 10 滴多一点的聚苯乙烯。我们将以 2， 400 RPM 的速度旋转它 30 秒。现在我们要把涂有聚苯乙烯的木片放入 120 摄氏度的烤箱中，这高于聚苯乙烯的玻璃化转变点。

因此，它将对表面进行回流处理，使其稍微平滑一些，并且还会使塑料致密化和硬化。所以通常我会把它放在烤箱里过夜。该过程可能至少需要几个小时才能完成。

因此，经过一夜烘烤后，木片就可以进行等离子处理了。现在我们要将聚苯乙烯暴露在氧气等离子体中，这将改变表面能，使蛋白质和细胞更好地粘附在它上面。因此，我们只需将芯片装入等离子室，然后将其抽真空。

一个好的设置是 200 mil，真空和 200 瓦的功率，在氧气流下持续一分钟。现在系统已经抽空，我们将引入氧气。好了，现在我们可以打开 RF 电源，敲击等离子体一分钟。

所以当等离子体运行时，它实际上是发光的。它就像一个荧光灯泡。等离子体暴露一分钟后，我们将压力恢复到大气中，然后我们可以将部件拉出。

现在，这些部件已准备好用于蛋白质包被和细胞补料。设计该设备的目标是让我们能够以动态方式纵组织的微结构。因此，体内组织的微观组织，特别是细胞彼此之间的位置，对于确定实验室培养中每个特定细胞的功能非常重要。

直到最近，我们还无法很好地复制这一点，但在过去的 5 年或 10 年里，人们已经开始能够将细胞微模式化到组织培养基质上，从而将细胞准确地放在组织培养板中我们想要的位置。在此过程中，已经能够在微观尺度上发现细胞细胞相互作用的基础生物学的一些重要方面。现在，到目前为止，我们还无法做到的是动态地做到这一点。

也就是说，在实验的中间改变细胞培养物的组织。这很重要，因为在身体中，所以组织实际上并不是一个静态的环境。我们的细胞会四处移动和重组，尤其是在伤口愈合或发育过程中。

但即使在体内平衡的正常器官中，也有很多东西在移动。最难学习的技术方面是如何实际吃掉这些零件。最初，当你开始使用该系统时，你可能会被这些部分的脆弱程度或你需要制造的情感有多小

但我认为，如果你只是用它练习一会儿，你应该不会有太多的麻烦。我们看到这种设备在一些地方发挥作用，例如，在胚胎发育中，当细胞通过各种胚胎层出芽时，细胞将与一系列不同的细胞环境接触。众所周知，当它们依次接触时，与每一层的相互作用会推动我们沿着特定的分化途径走得更远。

因此，我们认为这种类型的设备可能适合尝试在实验室中复制这种类型的事件。我们特别想研究的微组织的一个方面是细胞通过接触相互作用进行交流的细胞之间的差异，其中细胞膜可以相互接触，而可溶性因子分泌到周围介质中，扩散到稍远一点的细胞中。很多时候，当细胞处于共培养状态并且它们相互影响时，尚不清楚这些是接触相互作用还是分泌因子在发挥作用。