研究胰腺癌干细胞特性开发新的治疗策略

以下程序的总体目标是使用 Anchorage 非依赖性培养技术在体外扩增癌症干细胞，然后测试新型癌症干细胞靶向疗法的代谢效应。这是通过首先将人胰腺癌组织样本解离成单细胞悬液来实现的。在第二步中，用酶进一步消化肿瘤组织，然后接种到明胶板上为了去除成纤维细胞群，然后将分离的癌细胞接种在超低附着多孔板中，并用感兴趣的药物处理以评估肿瘤球的代谢活性和形成。

最终，感兴趣的药物可用于携带患者来源的异种移植物的免疫功能低下的小鼠，以验证药物在体内的效果。这些方法是研究癌症干细胞生物学的有力工具，是开发新的癌症干细胞靶向疗法的第一步。演示该程序的是我自己，乳腺癌研究所癌症和衰老干细胞中心的初级研究员和我实验室的博士生 Tini Cruz 在无菌生物安全柜中从胰腺导管腺癌中分离癌症干细胞。

使用无菌手术刀和镊子在含有 1 毫升无菌 PBS 的 60 x 15 毫米培养皿中将人肿瘤切碎，根据需要再添加 3 至 4 毫升 PBS，直到组织完全解离。将组织悬液转移到无菌锥形管中，并加入 PBS 至最终体积为 5 mL。然后用解离离心机对样品进行机械匀浆，并在 37 摄氏度下用胶原酶消化匀浆的组织。

离心一小时后，细胞复苏，将沉淀悬浮在 10 毫升完全培养基中。通过 40 微米过滤器过滤细胞悬液，然后再次旋转细胞。这一次，将沉淀悬浮在 5 毫升 CK 中 在室温下 5 分钟后，通过离心去除红细胞裂解缓冲液，并将沉淀重悬于癌症干细胞培养基中。

然后将细胞在 37 摄氏度的明胶涂层培养皿上孵育，以去除大部分快速附着的成纤维细胞。一小时后，回收上清液并量化活胰腺癌细胞的数量，以促进癌症肿瘤球的形成。干细胞富集在适当体积的癌症干细胞培养基中将细胞稀释至终浓度为 2 乘以 10 至每毫升 3 个细胞，并在冰上冷却几分钟。

然后，在 24 个超低附着细胞板的第一行和最后一行加入 500 微升 PBS 后，用移液管重新悬浮细胞，并将每孔 1 毫升细胞接种到板的空孔中。用目标药物处理四个细胞孔，用载体处理至少四个阴性对照孔。然后将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育一周。

每隔一天，为我们的车辆的每个井添加新鲜的处理剂。在第 5 天或第 7 天，使用自动细胞计数器评估已形成的肿瘤球的数量，该计数器允许识别用于肿瘤球体系列包装的较大结构。第 7 天，使用 40 微米的细胞过滤器收获球体。

接下来，旋转球体，并在 37 摄氏度下与 1 毫升胰蛋白酶一起孵育 20 分钟，以将沉淀解离成单细胞悬液。然后，如刚才所示，将细胞再扩增 7 天，以准备球体以测量其解离后的活性氧或 ROS 产生，如刚刚所示，旋转球体并将沉淀重悬于含有适当探针的 HBSS 中。在 37 摄氏度的黑暗中孵育 20 分钟后，将细胞置于冰上，直到通过流式细胞术进行分析，以准备球体以测量其耗氧量。

首先，在室温下用细胞和组织粘合剂包被 96 孔细胞培养板至少 20 分钟。接下来，如图所示解离球体和胰蛋白酶。然后用水洗涤板 2 至 3 次，以去除多余的粘附板，将单个细胞按每孔 3 次 10 至 5 个细胞。

在 150 μL 含葡萄糖和丙酮酸钠的耗氧量测定培养基中，通过离心将细胞粘附在孔底部，直至达到 100 倍 G。让离心机随着断裂而停止。然后反转板的方向并重复旋转。

现在将细胞在 30 摄氏度下孵育 37 分钟，无需二氧化碳。同时，加载检测试剂盒导入。A、B 和 C.分别注射 25 微升 3、6 和 9 毫摩尔浓度的目标药物，并导入 25 微升 1 微摩尔浓度的线粒体抑制剂 rone 的 D。

细胞准备好后，校准小柱并加载细胞培养板。最后使用混合和测量的标准方案进行测定在这些代表性实验中，用二甲双胍治疗胰腺癌干细胞强烈减小了肿瘤球的大小和数量。此外，这些减少表现在二级和三级球体培养物中。

据报道，即使仅用二甲双胍处理了原代球培养物，二甲双胍也起着线粒体抑制剂的作用。事实上，在该实验中，观察到该药物可诱导肿瘤细胞中耗氧量的快速和剂量依赖性降低，这与其诱导 ROS 产生的能力相关。重要的是，与对照动物相比，二甲双胍处理的小鼠胰腺癌进展表现出短期但显着的减少。

看完这个视频，你应该对如何解离新鲜的人类肿瘤有一个很好的了解。分离原代癌细胞，设置为球体形成培养物，并评估胰腺癌干细胞的代谢活性。