研究胰腺癌干细胞特性以开发新的治疗策略

以下实验方案的总体目标是利用非贴壁依赖性培养技术在体外扩增肿瘤干细胞，随后检测新型靶向肿瘤干细胞疗法的代谢效应。该过程首先将人胰腺腺癌组织样本解离为单细胞悬液；第二步，用酶进一步消化肿瘤组织，然后将其接种至明胶包被的培养板上。为去除成纤维细胞群体，将分离得到的癌细胞接种于超低吸附多孔板中，并加入待测药物，以评估细胞的代谢活性及肿瘤球体的形成能力。

最终，可将目标药物用于携带患者来源异种移植瘤的免疫缺陷小鼠，以验证该药物在体内的作用效果。该方法是研究癌症干细胞生物学的有力工具，也是开发新型靶向癌症干细胞疗法的第一步。演示该实验操作的将是我本人，乳腺癌研究所癌症与衰老干细胞中心的一名初级研究员，以及我实验室的博士研究生 Tini Cruz，我们将在无菌生物安全柜中分离胰腺导管腺癌的癌症干细胞。

使用无菌手术刀和镊子在含有1毫升无菌PBS的60 mm × 15 mm培养皿中切碎人源肿瘤组织，根据需要再加入3至4毫升PBS，直至组织完全解离。将组织悬液转移至无菌锥形管中，并加入PBS至终体积为5毫升。随后使用解离离心机对样本进行机械匀浆，并在37°C条件下用胶原酶消化匀浆后的组织。

离心一小时后，将细胞重悬，用10毫升完全培养基重悬沉淀。将细胞悬液通过40微米滤网过滤，再次离心收集细胞。此次用5毫升CK重悬沉淀。室温孵育5分钟后，通过离心去除红细胞裂解缓冲液，并将沉淀重悬于肿瘤干细胞培养基中。

然后将细胞接种于明胶包被的培养皿中，在37摄氏度孵育，以去除大部分快速贴壁的成纤维细胞。孵育1小时后，收集上清液，并定量有活力的胰腺癌细胞数量，以促进肿瘤球的形成，用于癌症干细胞的富集。用适量的肿瘤干细胞培养基将细胞稀释至终浓度为每毫升2×10³个细胞，并置于冰上预冷数分钟。

随后，向24孔超低吸附细胞培养板的第一行和最后一行各加入500微升PBS，用移液器重悬细胞，并将每毫升细胞悬液接种1毫升至板中的空孔中。用目标药物处理其中四孔细胞，同时至少设置四孔阴性对照孔，仅加入溶剂。然后将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养一周。

每隔一天，向每个孔中加入新鲜的处理剂或对照溶剂。在第5天或第7天，使用可识别较大结构的自动细胞计数仪评估形成的肿瘤球数量，以便对肿瘤球进行连续传代培养。在第7天，使用40微米细胞筛网收集肿瘤球。

接下来，离心收集球状体，并在37摄氏度下用1毫升胰蛋白酶孵育20分钟，以将沉淀解离为单细胞悬液。然后按照前述方法将细胞再扩增7天，以准备检测其解离后的活性氧（ROS）生成水平。如前所述，离心收集球状体，并将沉淀重悬于含有适当探针的HBSS中。在37摄氏度避光孵育20分钟后，将细胞置于冰上，直至通过流式细胞术进行分析，以准备检测其氧消耗水平。

首先，在室温下用细胞和组织黏附剂对96孔细胞培养板包被至少20分钟。接着，按照所示方法用胰蛋白酶消化类球体。然后用纯水洗涤培养板两到三次，以去除多余的黏附剂，每孔接种3 × 10⁵个单细胞。

在含有葡萄糖和丙酮酸钠的150微升氧消耗测定培养基中，通过离心使细胞贴附于孔板底部，直至达到100 × g。关闭离心机制动，让离心机自然停止。然后反转板子方向，重复离心一次。

将细胞在37摄氏度、无二氧化碳条件下孵育30分钟。同时，加载检测用微流控芯片的进样口A、B和C。分别加入25微升浓度为3、6和9毫摩尔的待测药物，进样口D中加入25微升浓度为1微摩尔的线粒体抑制剂rone。

当细胞准备就绪后，校准微流控芯片并加载细胞培养板。最后按照混合与检测的标准方案运行实验。在这些代表性实验中，使用二甲双胍处理胰腺癌干细胞显著减少了肿瘤球的大小和数量。此外，这些减少效应在继代培养的第二代和第三代肿瘤球中均有体现。

即使仅对原代球体培养物使用二甲双胍处理，据报道，二甲双胍仍可作为线粒体抑制剂发挥作用。事实上，在本实验中，观察到该药物可诱导肿瘤细胞耗氧量迅速且呈剂量依赖性地下降，这一效应与其诱导活性氧（ROS）产生的能力相关。重要的是，与对照组动物相比，经二甲双胍处理的小鼠在短期内表现出胰腺腺癌进展的显著抑制。

观看本视频后，您应充分了解如何解离新鲜的人类肿瘤，分离原代癌细胞，建立类球体形成培养，并评估胰腺癌干细胞的代谢活性。