Name: HLA - IG基于人工抗原提呈细胞可高效体外扩展人类的CTL (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 了解利用HLA A2-Ig人工抗原提呈细胞高效体外扩增人抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的方法。该技术通过磁珠偶联和肽负载实现CTL的高效扩增，适用于过继免疫治疗应用。

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感谢 Aaron Selya 提供的有益讨论。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 AI29575、CA108835、AI077097（授予 JS）、约翰·霍普金斯大学疟疾研究所的试点项目资助以及美国国防部资助项目 PC 040972（授予 M.O.）支持。

1. 制备基于 HLA-A2-Ig 的人工抗原呈递细胞（aAPC）
<ol>
	<li>制备无菌硼酸盐缓冲液
 <ol>
 	<li>将硼酸溶解于水中，配制成 0.1M 溶液，调节 pH 至 7.0。</li>
 <li>经 0.22μm 无菌滤膜过滤后，于 4°C 保存。</li>
 
 </ol>
 
 </li>
 <li>制备无菌珠洗缓冲液
 	<ol>
 	<li>取 956ml 不含镁和钙的 PBS。</li>
 <li>加入 30ml 人 AB 型血清。</li>
 <li>加入 EDTA 至终浓度为 2mM。</li>
 <li>加入 0.1g 叠氮化钠。</li>
 <li>经 0.22 μm 无菌滤膜过滤后，于 4°C 保存。</li>
 </ol>
 
 </li>
 <li>从库存中取出 1ml Invitrogen M-450 环氧基磁珠，约含 4 亿个磁珠（可通过血细胞计数板计数），置于无菌螺口玻璃小瓶中。</li>
 <li>将小瓶紧贴 Dynal 磁力架 MPC-1，待磁珠吸附至管壁一侧后，用移液器吸除上清液。用 1ml 硼酸盐缓冲液洗涤磁珠一次。</li>
 <li>将磁珠重悬于 1ml 硼酸盐缓冲液与 20 μg HLA-A2-Ig 二聚体及 20 μg 抗人 CD28 单克隆抗体（克隆号 9.3）的混合液中。</li>
 <li>蛋白与磁珠偶联：将玻璃小瓶置于旋转仪上，于 4°C 旋转孵育 24 小时。</li>
 <li>将小管置于 MPC-1 磁力架中，完全去除硼酸盐缓冲液。</li>
 <li>用 1ml 珠洗缓冲液洗涤磁珠两次。</li>
 <li>将磁珠悬浮于 1ml 珠洗缓冲液中，于 4°C 旋转孵育 24 小时。由于珠洗缓冲液中含有人 AB 型血清，可封闭磁珠上所有残留的蛋白结合位点。</li>
 <li>去除玻璃小瓶中的上清液，替换为 1ml 新鲜的珠洗缓冲液。</li>
</ol>
2. 可溶性人工抗原提呈细胞的质量控制及多肽负载、储存
<ol>
	<li>在FACS管中，将约5×105个磁珠加入100μl FACS洗涤缓冲液，加入1μl抗小鼠IgG1-PE（识别HLA-A2-Ig的Fc段）和1μl抗小鼠IgG2a-FITC（识别抗CD28单克隆抗体的Fc段）。在FACS洗涤缓冲液中染色20分钟后，再次洗涤，并立即通过流式细胞仪读取染色结果（图4）。</li>
	<li>肽段负载至磁珠：在玻璃小瓶中用1ml无菌PBS洗涤磁珠两次。重悬于1ml无菌PBS后，加入10μl CMV肽段（1mg/ml）。</li>
	<li>使用血细胞计数板计数磁珠，并在小瓶上标注日期和浓度。</li>
	<li>人工抗原呈递细胞（aAPC）需在4°C下与肽段孵育至少3天，以确保肽段充分结合至HLA-A2-Ig二聚体，此后即可使用。磁珠可在4°C保存，且至少6个月内保持功能活性。</li>
</ol>
3. 人CTL的分离
<ol>
	<li>从健康的 HLA-A2 阳性供体采集约 100 ml 新鲜外周血至 10 支 BD 肝素钠真空采血管中。使用 21 号或更大规格的针头，以防止溶血。</li>
 <li>在室温下以 300×g 离心 10 分钟。</li>
 <li>小心吸除上层血浆层。该血浆可用作培养基的补充成分。</li>
 <li>用无菌 PBS 替代采集的血浆，并将血液转移至无菌 T75 培养瓶或 50 ml 圆底离心管中。通过反复吹打充分混匀血液与 PBS。</li>
 <li>在完成全部血液采集后，准备另外四个 50 ml 圆底离心管，并在每管中加入 15 ml Ficoll-Paque Plus。</li>
 <li>缓慢将每管 30–35 ml 血细胞液叠加于 Ficoll 液面上方。保持 Ficoll 与血细胞之间界面清晰分明。</li>
 <li>在室温下以 500×g 离心 20 分钟。关闭离心机刹车，并将加速度调至最低，以维持各层之间清晰的界面。</li>
 <li>使用血清移液管小心吸取 PBMC 层，并将 PBMC 收集至新的 50 ml 圆底离心管中。收集全部 PBMC 后，加入 30 ml PBS，在 400×g 条件下离心 10 分钟。弃去上清液，并再用 30 ml PBS 洗涤一次，以彻底去除残留的 Ficoll。</li>
 <li>使用 Miltenyi 人 CD8+ T 细胞分离试剂盒，按照制造商提供的操作说明进行 CD8+ T 细胞分离。该试剂盒通过去除 CD8- 细胞，可高度富集 CD8+ 细胞（通常 >95%）。</li>
 <li>计数 CD8+ T 细胞。预期纯度应高于 95%。为确认纯度，取 2×105 个细胞进行 CD4/3/8 流式细胞术分析。剩余的 CTL 可立即用于抗原特异性 aAPC 刺激，也可冻存以备后续使用。</li>
</ol>
4.	体外 基于aAPC的培养系统
<ol>
	<li>准备培养基
 <ol>
 	<li>用于TF（T细胞生长因子，实验室制备4）的2倍浓度培养基：完全RPMI培养基，添加5%供体自体血浆和8% T细胞生长因子。</li>
 <li>供体自体血浆可用热灭活的人AB血清替代。</li>
 </ol>
 
 </li>
 <li>将100万CTL重悬于8 ml TF 2X培养基和8 ml完全RPMI培养基中，加入1×106个aAPC，充分混匀。</li>
 <li>使用多通道移液器将细胞接种至96孔U型底组织培养板中（每孔160 μl）。</li>
 <li>将细胞在37°C、5% CO2培养箱中培养7天。在第4天每孔补充80 μl TF 2X培养基。</li>
 <li>第7天可收获细胞。收获后，将细胞置于磁铁旁，去除旧的aAPC。</li>
 <li>抗原特异性可通过四聚体染色法检测，具体操作按照试剂生产商的说明书进行。表型染色和胞内细胞因子染色参照我们之前的研究方法3。</li>
 <li>收获的细胞可在相同条件下再次与aAPC共培养。经过多次刺激后，细胞数量和抗原特异性预期会增加。</li>
 
</ol>
5. 代表性结果：
图4展示了aAPC在与HLA A2-Ig和抗-CD28偶联后的示例。通过相应抗体染色的明显偏移可判断蛋白偶联成功。外周血中CMV特异性CTL的频率通常为0.5–1%，而在aAPC介导刺激一周后，特异性可达55–93%（图2和图3）。不同供体之间抗原特异性CTL的扩增程度可能存在较大差异，但在同一供体中结果具有可重复性。根据推算，与直接取自体外（ex vivo）的前体细胞水平相比，CMV特异性细胞的扩增可达数千倍（数据未显示）。细胞内细胞因子染色（图3）显示，经过长期培养和显著增殖后，这些扩增的CTL具有多效功能，而非耗竭状态。
<img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig1.jpg" alt="骨髓移植过程示意图，显示CTL淋巴细胞和CMV特异性细胞毒性T细胞。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 基于人工抗原呈递细胞（aAPC）体外扩增人细胞毒性T淋巴细胞（CTL）用于同种异体造血干细胞移植（HSCT）中过继性免疫治疗的代表性流程图
<img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig2.jpg" alt="流式细胞术图；CD8 FITC 对比 四聚体 PE；细胞群体分析；象限百分比。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 经aAPC共培养一周后生成的CMV特异性CTL的代表性四聚体染色结果
<img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig3.jpg" alt="流式细胞术散点图；TNF 与 IFN 表达；细胞群体分析；定量数据。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. 由人工抗原呈递细胞（aAPC）诱导生成的针对巨细胞病毒（CMV）特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的代表性胞内细胞因子染色结果（CMV 特异性为 61%）
<img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig4.jpg" alt="流式细胞术直方图，小鼠IgG2a FITC与小鼠IgG1 PE荧光强度比较。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4. M-450环氧珠在蛋白偶联后，使用抗小鼠IgG1-PE和抗小鼠IgG2a-FITC染色的代表性染色结果

<ol><li>Walter, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+cellular+immunity+against+cytomegalovirus+in+recipients+of+allogeneic+bone+marrow+by+transfer+of+T-cell+clones+from+the+donor%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor.</a> N Engl J Med. 333, 1038-1038 (1995).</li>
<li>Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cell+transfer%3A+a+clinical+path+to+effective+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Adoptive cell transfer: a clinical path to effective cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Cancer. 8, 3669-3669 (2008).</li>
<li>Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nat Med. 9, 619-619 (2003).</li>
<li>Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+antigen-presenting+cells%3A+artificial+solution+for+real+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Artificial antigen-presenting cells: artificial solution for real diseases.</a> Trends Mol Med. 11, 412-412 (2005).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文所述的aAPC系统是一种高效的人类细胞毒性T淋巴细胞（CTL）体外扩增系统，可用于针对多种抗原的CTL扩增。在实验过程中，需特别注意蛋白质偶联的质量，以及在96孔板培养中aAPC与CTL的均匀分布。采用该方法，我们已成功将CTL扩增超过8周，并在此期间将抗原特异性CTL扩增达一百万倍4。目前已开发出多种基于细胞系或其他无细胞平台的人工抗原呈递细胞（APC）系统5；然而，根据已发表的数据，每种系统在扩增能力与特异性方面均具有独特特征，适用于不同的应用场景。尤为重要的是，由于CTL的质量与其数量同等重要，本系统所产生的巨细胞病毒（CMV）特异性CTL具备多效功能，预期可带来更优的抗病毒效果。

<table><tbody><tr><td>真空采血管（含肝素）</td><td>BD Biosciences</td><td>367874</td><td></td></tr><tr><td>人CD8+ T细胞分离试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-156</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-450 Epoxy</td><td>Invitrogen</td><td>140.11</td><td></td></tr><tr><td>Dynal MPC-1 磁力架</td><td>Invitrogen</td><td>120-01D</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>HLA-A2-Ig 二聚体 X</td><td>BD Biosciences</td><td>551263</td><td></td></tr><tr><td>iTAgMHC 四聚体（HLA-A2-CMV）-PE</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>T20099</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 透明 96 孔微孔板</td><td>BD Biosciences</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 IgG2a-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>553390</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG1-PE</td><td>Invitrogen</td><td>P21129</td><td></td></tr><tr><td>人 AB 型血清</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S40110</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD8a-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0772</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD8a-APC</td><td>BD Biosciences</td><td>340684</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人 IFN&amp;#947;-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>340449</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人 TNF&amp;#945;-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>340512</td><td></td></tr></tbody></table>

基于hla-ig的人工抗原呈递细胞用于高效 离体 人类ctl的扩增

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

具有最佳效应功能的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）在介导抵御多种胞内感染和癌症方面发挥着关键作用。然而，个体可能表现出抑制性免疫微环境，与其自身抗原提呈细胞激活CTL的作用相反，这些细胞更倾向于使抗原特异性CTL发生耐受或无能。因此，尽管仍处于实验阶段，基于CTL的过继性免疫治疗已发展成为治疗癌症和病毒感染等多种疾病的一种有前景的策略。在初期实验中 离体 扩增的巨细胞病毒（cytomegalovirus, CMV）特异性CTL已用于治疗免疫功能低下异基因骨髓移植患者中的CMV感染。尽管这些患者中出现危及生命的CMV病毒血症较为常见，但接受扩增CTL治疗的患者均未发生CMV相关疾病，表明通过过继转移的CTL可建立抗CMV免疫。1在黑色素瘤中也观察到了有希望的结果，并可能推广至其他类型的癌症2. 
虽然有许多方法可以 离体 刺激和扩增人细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的现有方法受限于成本和技术局限。例如，当前的金标准依赖于使用自体树突状细胞（DC）。该方法要求每位患者捐献大量白细胞，且成本高昂、操作繁琐。此外，对体外扩增的DC来源CTL进行的详细表征表明，这些细胞仅具有次优的效应功能 3. 
在此，我们介绍一种高效的基于aAPC的系统 离体 用于过继性免疫治疗的人巨细胞病毒特异性CTL扩增（图1）。aAPC通过将细胞大小的磁珠与人HLA-A2-Ig二聚体和抗CD28单克隆抗体偶联制备而成4制备好的人工抗原呈递细胞（aAPC）可加载多种感兴趣的肽段，并能保持数月的功能活性。本报告中，aAPC被加载了来自巨细胞病毒（CMV）的主要抗原肽pp65（NLVPMVATV）。在培养纯化的人源CD8⁺ T细胞后+ 来自健康供体的CTL与aAPC共培养一周后，CMV特异性CTL的特异性可显著提高至98%（图2），扩增倍数超过10,000倍。若需要更多CMV特异性CTL，可通过重复使用aAPC刺激实现进一步扩增。表型与功能特征分析显示，扩增后的细胞具有效应记忆性表型，并可产生大量TNFα和IFNγ（图3）。

介绍了一种新的无需树突状细胞的抗原特异性T细胞诱导与扩增方法。基于HLA A2-Ig的人工抗原呈递细胞（aAPC）可加载HLA-A2限制性多肽，从而高效扩增具有不同抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。该技术在基于CTL的过继性免疫治疗中具有广阔的应用前景。

基于HLA-Ig的人工抗原呈递细胞用于高效 离体 人类CTL的扩增

效应功能最佳的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）在介导抵御多种胞内感染和癌症方面发挥着关键作用。然而，个体……

本实验的总体目标是利用人工抗原呈递细胞（aAPC）在体外扩增人源抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL），以期用于过继性免疫治疗。该过程首先将HLA-A2-Ig及抗人CD28单克隆抗体共价偶联至磁性Dyna珠，制备aAPC；第二步为对aAPC进行质量控制并加载抗原肽；第三步是从人外周血中分离CD8阳性T细胞；最后一步是将CD8阳性T细胞与aAPC共同孵育一周。随后收获CTL并进行表征，然后将其直接使用，或再刺激一周，以达到所需的特异性和扩增水平。最终可获得四聚体或染色结果，显示在A APC存在下扩增的CTL具有更高的抗原特异性。今天，我将向您展示一种基于HI IG的A APC系统，以及如何利用该系统在体外高效扩增CMV特异性人CTL，并与其他现有方法进行比较。我们的 A A PC 技术具有多项重要优势：它可直接购买获得，数量不受限制，且可用于所有 HRAA 2 阳性供者。现在开始操作：将一毫升 M four 50 环氧珠从储备液（约四亿个珠子）转移至无菌螺口玻璃管中。加入一毫升 boid 缓冲液洗涤磁珠一次，然后将玻璃小瓶紧贴 dyin all magnet NBC one，使磁珠吸附在小瓶管壁上。通过抽吸去除上清液。将磁珠重悬于 boid 缓冲液、HLA A2 Ig 二聚体和抗人 CD28 单克隆抗体的混合液中。然后，为促进蛋白质与磁珠的偶联，在4°C条件下将玻璃小瓶置于旋转仪上旋转24小时。接下来，将离心管放入MPC1磁铁中，彻底去除所有硼酸盐缓冲液。缓冲液去除后，用1毫升磁珠洗涤缓冲液将磁珠洗涤两次。现在将珠子在1 mL珠子洗涤缓冲液中孵育，并在4°C下旋转小瓶24小时，以封闭珠子上残留的蛋白质结合位点。然后从玻璃小瓶中移除缓冲液，并替换为1 mL新鲜的珠子洗涤缓冲液。将100 µL Fax洗涤缓冲液转移至Fax管中，然后加入5 × 10⁵个珠子。将珠子与一微升抗小鼠IgG、一微升PE标记的抗小鼠IgG二抗在4°C下避光孵育20分钟。每个染色样本中加入三毫升FACS洗涤缓冲液。然后在4°C下以300 × g离心五分钟，沉淀AA PC。将A A PC重悬于新鲜的fax缓冲液中，并立即通过流式细胞仪读取染色结果。用无菌PBS按前述方法将磁珠洗涤两次。接着，向磁珠中加入10 µL CMV肽进行负载。使用血细胞计数器对珠子进行计数，然后标注珠子的日期和浓度，单位为每毫升珠子数。将AAPC与多肽在4摄氏度下孵育至少三天。从HLA-A*02阳性供体采集约100毫升新鲜外周血，置于含10单位钠肝素的真空采血管中，以300 × g离心10分钟。在室温下，小心吸取上层血浆层。用无菌 PBS 替代收集的血浆，并将血液转移至无菌的 T75 培养瓶中。当所有血液收集完毕（共 15 毫升采血管加上 4 个 50 毫升锥形管）后，通过移液充分混匀血液与 PBS。将30至35毫升的血细胞缓慢叠加到每根试管中分离液的上方。保持分离液与血细胞之间的界面清晰，将血液与分离液梯度在室温下以500 ×g离心20分钟，关闭刹车并尽可能调低加速度，以维持离心后各层之间清晰的界面。离心后，吸除上层血浆层，然后使用血清学移液管小心吸取PBMC层。将所有收集的PBMC转移至一个新的50毫升锥形管中，加入30毫升PBS重悬细胞，随后进行离心。接下来，弃去上清液并洗涤沉淀。再用 30 毫升 PBS 洗涤一次，以去除残留的纤维蛋白，然后使用 Miltenyi 人 CD8 阳性 T 细胞分离试剂盒，按照制造商的说明书富集 CD8 阳性 T 细胞群体。通过流式分析计数 CD8 阳性 T 细胞并确认其纯度。将100万个CTL悬浮于8毫升含T细胞生长因子2×的培养基和8毫升完全RPMI培养基中，并加入1×10⁶个A APC混合物。然后使用多通道移液器将每孔160微升细胞悬液接种至96孔U型底组织培养板中。将细胞在37°C、5%二氧化碳条件下孵育7天。第4天，每孔加入80 µL T细胞生长因子2×培养基，对细胞进行换液。第7天收集细胞，然后将细胞置于磁铁上，当所有磁珠吸附至离心管管壁时，去除旧的AA PC。收获细胞并转移至另一个50毫升锥形管中，计数细胞数量。根据制造商说明书，通过四聚体染色法确定抗原提呈细胞（A A PC）的抗原特异性。在相同条件下，将收获的细胞与新的抗原提呈细胞（A A PC）共同培养，以扩增具有抗原特异性的细胞数量。以下是一例经 A A PC 培养一周后生成的针对巨细胞病毒（CMV）特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的四聚体染色结果。图中同时展示了一例相应的细胞内细胞因子染色结果。通过四聚体染色检测，CMV 特异性 CTL 的比例为 61%。该方法可用于解答T细胞研究领域中的关键问题，例如：如何确定T细胞功能调控所需的最优培养条件及其相关要求。这一简单方法为治疗病毒性疾病提供了见解，也可应用于癌症等其他领域。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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在此，我们介绍一种可快速、可重复地制备具有可调控大小、形状及表面蛋白呈递能力的仿生可降解人工抗原呈递细胞（aAPC）的实验方案，用于T细胞扩增。 离体 或 体内.

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