HLA - IG基于人工抗原提呈细胞可高效体外扩展人类的CTL

该程序的总体目标是使用人工抗原呈递细胞或 A PC 进行人抗原特异性 CTL 的离体扩增，以潜在地用于过继免疫治疗。这是通过首先将 HLA A、两个 IG 和抗人 CD 28 单克隆抗体与磁性 dyna 磁珠偶联以制备 A A 来实现的。该程序的第二步是执行 A A PC 的质量控制和肽加载。该程序的第三步是分离人外周血 CD 8 个阳性 T 细胞。该程序的最后一步是将 CD 8 阳性 T 细胞与 A PC 孵育一周。

然后收获 CTL 并对其进行表征，然后再使用或再刺激一周，以达到所需的特异性和扩增水平。最终，可以获得 teum 或染色结果，表明在 A A PC 存在下扩增的 CTL 具有更高的抗原特异性。今天，我将向您展示一个基于 HI IG 的 A A PC 系统，以及与其他现有方法相比，如何使用该系统有效地扩展 CMV 特异性人体 CTL 体外。

我们的 A A PC 技术具有几个重要优势。它是现成的，数量不限，假设 A A PC 可用于所有 HRAA 两个阳性供体。好的，让我们开始将 1 毫升 M 4 个 50 环氧树脂珠子从大约 4 亿个珠子中转移到无菌拧松玻璃锉中。

通过加入 1 毫升 Boid 缓冲液清洗珠子一次，然后将玻璃瓶放在全磁铁 NBC 1 上，同时将珠子粘附在小瓶的侧面。通过抽吸 Resus 去除 snat。将微珠悬浮在 Boid 缓冲液、HLA、A 双 IG 二聚体和抗人 CD 28 单克隆抗体的混合物中。

然后，为了促进蛋白质与微珠的偶联，将玻璃瓶在旋转器上以 4 摄氏度旋转 24 小时。接下来，将试管放入 MPC one 磁铁中并去除所有硼酸盐缓冲液。去除缓冲液后，用 1 mL 磁珠洗涤缓冲液洗涤磁珠两次。

现在，将磁珠在 1 毫升磁珠洗涤缓冲液中孵育，并在 4 摄氏度下旋转样品瓶 24 小时，以封闭磁珠上残留的蛋白质结合位点。然后从玻璃瓶中取出缓冲液，并用 1 毫升新鲜的微珠洗涤缓冲液替换。将 100 微升传真洗涤缓冲液转移到传真管中，然后向第五个珠子中加入 5 乘以 10。

在 4 摄氏度下染色 20 分钟后，用 1 微升抗缪斯 IgG、1 微升 PE 和 1 微升抗缪斯 IgG 2 次对珠子进行染色。向每个染色样品中加入 3 毫升传真洗涤缓冲液。然后在 4 摄氏度下以 300 G 的浓度放置 5 分钟，使 A A PC 沉淀。

Reus 将 A A PC 悬浮在新鲜的传真缓冲液中，并立即用流式细胞仪读取染色结果。像以前一样，用无菌 PBS 洗涤珠子两次。接下来，用 10 微升 CMV 肽加载珠子。

通过血细胞计数器对珠子进行计数，然后用珠子的日期和浓度标记它们。以每毫升珠子为单位。将 A A PC 与肽在 4 摄氏度下孵育至少 3 天，将来自 HLA A 双阳性供体的大约 100 毫升新鲜外周血以 300 Gs 离心在 10 个肝素真空注射管中 10 分钟。

在室温下，通过抽吸小心地去除顶部血浆层。用无菌 PBS 替换收集的血浆，并将血液转移到无菌 T 75 培养瓶中。一旦所有血液都以 15 毫升 fial 包装加四个 50 毫升锥形管收集，通过移液将血液和 PBS 充分混合。

在每根试管的 fial 顶部缓慢覆盖 30 至 35 毫升血细胞。保持 fial 和 blood cells 之间的界面清晰，在室温下以 500 GS 离心血液和 fial 梯度 20 分钟，尽可能降低断裂和加速，以保持层之间的清晰界面，离心吸出顶部血浆层，然后使用血清移液管小心吸出 PBMC 层。当所有 PBMC 都以 30 毫升 PBS 收获到细胞中时，将 PBMC 转移到新鲜的 50 毫升锥形管中并离心。

接下来，丢弃 supernat 并清洗沉淀。再用 30 毫升 PBS 去除残留的 fi call，然后使用 Milton Human CD 8 阳性 T 细胞分离试剂盒富集 CD 8 阳性 T 细胞群。根据制造商的方案，对 CD 8 个阳性 T 细胞进行计数，并通过传真分析确认纯度。

将 100 万 CTL 悬浮于 8 毫升 T 细胞生长因子、2 x 培养基和 8 毫升完全 RPMI 培养基中，并添加 6 个 A A PC 混合物的 1 倍 10 倍。然后，使用多通道移液器将每孔 160 微升细胞接种到 96 孔 U 形底组织培养板上。将细胞在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳中孵育 7 天。

在第 4 天用每孔 80 微升的 T 细胞生长喂养细胞。因子 2 x 培养基。在第 7 天收获细胞，然后将细胞靠在磁铁上，当所有珠子都粘附在小瓶壁上时，去除旧的 A A PC。

收获细胞并将其转移到另一个 50 毫升锥形管中，并计数细胞数量。根据制造商的方案，通过四聚体染色确定 A A PC 的抗原特异性。在相同条件下用新的 A A PC 重放收获的细胞，以产生增加的细胞数量转化为抗原特异性。

这是培养一周后由 A A PC 生成的 CMV 特异性 CTL 的代表性四聚体染色结果。此处显示的是 A-A-P-C-C-M-V 特异性产生的 CMV 特异性 CTL 的代表性细胞内细胞因子染色结果，通过四聚体染色为 61%。这种方法可用于回答 T 细胞领域的关键问题，例如我们如何确定最佳培养条件和 T 细胞功能调节的要求。

Lowly 方法为治疗病毒性疾病提供了见解。它也可以应用于其他领域，例如癌症。