HLA - IG基于人工抗原提呈细胞可高效体外扩展人类的CTL
2011年4月11日
描述一个新的DC抗原特异性T细胞的诱导和扩张的独立方法。基于HLA A2 - Ig的人工抗原提呈细胞（AAPC）加载与HLA - A2限制性肽能够有效地扩大多样化的抗原特异性CTL的。该技术拥有CTL为基础的过继免疫治疗的巨大潜力。
该程序的总体目标是使用人工抗原呈递细胞或 A PC 进行人抗原特异性 CTL 的离体扩增，以潜在地用于过继免疫治疗。这是通过首先将 HLA A、两个 IG 和抗人 CD 28 单克隆抗体与磁性 dyna 磁珠偶联以制备 A A 来实现的。该程序的第二步是执行 A A PC 的质量控制和肽加载。该程序的第三步是分离人外周血 CD 8 个阳性 T 细胞。该程序的最后一步是将 CD 8 阳性 T 细胞与 A PC 孵育一周。
然后收获 CTL 并对其进行表征，然后再使用或再刺激一周，以达到所需的特异性和扩增水平。最终，可以获得 teum 或染色结果，表明在 A A PC 存在下扩增的 CTL 具有更高的抗原特异性。今天，我将向您展示一个基于 HI IG 的 A A PC 系统，以及与其他现有方法相比，如何使用该系统有效地扩展 CMV 特异性人体 CTL 体外。
我们的 A A PC 技术具有几个重要优势。它是现成的，数量不限，假设 A A PC 可用于所有 HRAA 两个阳性供体。好的，让我们开始将 1 毫升 M 4 个 50 环氧树脂珠子从大约 4 亿个珠子中转移到无菌拧松玻璃锉中。
通过加入 1 毫升 Boid 缓冲液清洗珠子一次，然后将玻璃瓶放在全磁铁 NBC 1 上，同时将珠子粘附在小瓶的侧面。通过抽吸 Resus 去除 snat。将微珠悬浮在 Boid 缓冲液、HLA、A 双 IG 二聚体和抗人 CD 28 单克隆抗体的混合物中。
然后，为了促进蛋白质与微珠的偶联，将玻璃瓶在旋转器上以 4 摄氏度旋转 24 小时。接下来，将试管放入 MPC one 磁铁中并去除所有硼酸盐缓冲液。去除缓冲液后，用 1 mL 磁珠洗涤缓冲液洗涤磁珠两次。
现在，将磁珠在 1 毫升磁珠洗涤缓冲液中孵育，并在 4 摄氏度下旋转样品瓶 24 小时，以封闭磁珠上残留的蛋白质结合位点。然后从玻璃瓶中取出缓冲液，并用 1 毫升新鲜的微珠洗涤缓冲液替换。将 100 微升传真洗涤缓冲液转移到传真管中，然后向第五个珠子中加入 5 乘以 10。
在 4 摄氏度下染色 20 分钟后，用 1 微升抗缪斯 IgG、1 微升 PE 和 1 微升抗缪斯 IgG 2 次对珠子进行染色。向每个染色样品中加入 3 毫升传真洗涤缓冲液。然后在 4 摄氏度下以 300 G 的浓度放置 5 分钟，使 A A PC 沉淀。
Reus 将 A A PC 悬浮在新鲜的传真缓冲液中，并立即用流式细胞仪读取染色结果。像以前一样，用无菌 PBS 洗涤珠子两次。接下来，用 10 微升 CMV 肽加载珠子。
通过血细胞计数器对珠子进行计数，然后用珠子的日期和浓度标记它们。以每毫升珠子为单位。将 A A PC 与肽在 4 摄氏度下孵育至少 3 天，将来自 HLA A 双阳性供体的大约 100 毫升新鲜外周血以 300 Gs 离心在 10 个肝素真空注射管中 10 分钟。
在室温下，通过抽吸小心地去除顶部血浆层。用无菌 PBS 替换收集的血浆，并将血液转移到无菌 T 75 培养瓶中。一旦所有血液都以 15 毫升 fial 包装加四个 50 毫升锥形管收集，通过移液将血液和 PBS 充分混合。
在每根试管的 fial 顶部缓慢覆盖 30 至 35 毫升血细胞。保持 fial 和 blood cells 之间的界面清晰，在室温下以 500 GS 离心血液和 fial 梯度 20 分钟，尽可能降低断裂和加速，以保持层之间的清晰界面，离心吸出顶部血浆层，然后使用血清移液管小心吸出 PBMC 层。当所有 PBMC 都以 30 毫升 PBS 收获到细胞中时，将 PBMC 转移到新鲜的 50 毫升锥形管中并离心。
接下来，丢弃 supernat 并清洗沉淀。再用 30 毫升 PBS 去除残留的 fi call，然后使用 Milton Human CD 8 阳性 T 细胞分离试剂盒富集 CD 8 阳性 T 细胞群。根据制造商的方案，对 CD 8 个阳性 T 细胞进行计数，并通过传真分析确认纯度。
将 100 万 CTL 悬浮于 8 毫升 T 细胞生长因子、2 x 培养基和 8 毫升完全 RPMI 培养基中，并添加 6 个 A A PC 混合物的 1 倍 10 倍。然后，使用多通道移液器将每孔 160 微升细胞接种到 96 孔 U 形底组织培养板上。将细胞在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳中孵育 7 天。
在第 4 天用每孔 80 微升的 T 细胞生长喂养细胞。因子 2 x 培养基。在第 7 天收获细胞，然后将细胞靠在磁铁上，当所有珠子都粘附在小瓶壁上时，去除旧的 A A PC。
收获细胞并将其转移到另一个 50 毫升锥形管中，并计数细胞数量。根据制造商的方案，通过四聚体染色确定 A A PC 的抗原特异性。在相同条件下用新的 A A PC 重放收获的细胞，以产生增加的细胞数量转化为抗原特异性。
这是培养一周后由 A A PC 生成的 CMV 特异性 CTL 的代表性四聚体染色结果。此处显示的是 A-A-P-C-C-M-V 特异性产生的 CMV 特异性 CTL 的代表性细胞内细胞因子染色结果，通过四聚体染色为 61%。这种方法可用于回答 T 细胞领域的关键问题，例如我们如何确定最佳培养条件和 T 细胞功能调节的要求。
Lowly 方法为治疗病毒性疾病提供了见解。它也可以应用于其他领域，例如癌症。
概述
本文描述了一种使用HLA A2-Ig基人工抗原呈递细胞（aAPC）诱导和扩增抗原特异性T细胞的新方法。该技术旨在提高细胞毒性T淋巴细胞（CTL）扩增的效率，以便在采用性免疫疗法中应用。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 细胞生物学
- 治疗学
背景
- 采用性免疫疗法利用T细胞靶向特定抗原。
- 传统的T细胞扩增方法在效率上可能受到限制。
- 人工抗原呈递细胞（aAPC）可以增强T细胞的活化和扩增。
- HLA A2-Ig基aAPC可以加载特定肽以实现靶向CTL扩增。
研究目的
- 开发一种高效体外扩增人类抗原特异性CTL的方法。
- 展示使用HLA A2-Ig基aAPC相对于现有方法的优势。
- 评估扩增CTL的抗原特异性。
使用的方法
- 将HLA A2-Ig和抗人CD28单克隆抗体结合到磁珠上。
- aAPC的质量控制和肽负载。
- 分离人外周血CD8+ T细胞。
- T细胞与aAPC孵育以实现扩增和表征。
主要结果
- 扩增的CTL展示出更高的抗原特异性，如四聚体染色所示。
- 该方法允许aAPC的现货可用性和无限数量。
- 使用描述的aAPC系统有效地扩增了CMV特异性CTL。
- CTL的表征确认了其功能性和特异性。
结论
- HLA A2-Ig基aAPC系统是一种有前途的CTL基免疫疗法工具。
- 该方法提供了一种可扩展的方法来生成抗原特异性T细胞。
- 进一步的研究可以增强该技术在临床环境中的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Efficient ex vivo expansion of antigen-specific CTLs is a critical bottleneck in adoptive immunotherapy development for infectious diseases and cancer. The HLA-Ig based artificial antigen presenting cell (aAPC) platform enables scalable, reproducible generation of highly specific CTLs, addressing limitations of autologous dendritic cell-based methods. This technology supports portfolio advancement by providing a standardized, off-the-shelf solution for robust T cell manufacturing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of CTL activation pathways and antigen specificity in controlled ex vivo systems.
- Supports functional validation of immune targets by expanding CTLs with defined peptide specificity.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing direct assessment of CTL effector function and phenotype.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible platform for generating validated CTL populations for downstream assays.
- Standardizes expansion conditions, improving assay comparability and quantitative output reliability.
- Enables scalable production of CTLs for compound screening or immunomodulatory studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by generating effector-memory CTLs for functional studies.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by enabling repeated, high-fidelity CTL expansion.
- Reduces biological risk in preclinical models by providing consistent, antigen-specific T cell populations.
Pipeline & Workflow Integration
This aAPC-based method integrates into the immunotherapy pipeline from early discovery through preclinical validation, enabling iterative hypothesis testing and functional assessment of CTLs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven evaluation of antigen-specific CTL responses and pathway modulation.
- Screening: Delivers standardized, reproducible CTL populations for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative readouts such as tetramer staining and cytokine profiling for condition comparison.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease-relevant immune biomarkers and preclinical model requirements.
- Enterprise Reuse: Offers an off-the-shelf, scalable platform adaptable to multiple antigens and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in CTL function and specificity for target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of CTL expansion workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and reduces late-stage biological risk in immunotherapy portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of CTL-based therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunology, cell culture, and flow cytometry for quality control and characterization.
- Needs access to magnetic bead conjugation, peptide synthesis, and analytical instrumentation.
- Demands cross-team standardization of expansion protocols and analytical endpoints.
- Adaptable to various antigens but limited to HLA-matched donor systems as described.
- Dependent on validated peptide loading and functional CTL assessment for each application.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:39
Making HLA-A2-Ig-based aAPC
2:47
Quality Control of aAPC and Peptide Loading and Storage
3:43
Human CTL Isolation
5:22
In Vitro aAPC-based Culture System
6:25
Expanded CTL Are Polyfunctional - Not Exhausted - after Prolonged Cell Culture and Proliferation
6:49
Conclusion
