胚胎小鼠大脑中的条件性遗传跨突触示踪

以下实验的目的是利用三种不同的细胞标记系统，在胚胎期小鼠大脑中可视化神经环路的发育过程。这三种标记系统分别为：一种可双向跨突触传播的示踪剂、一种仅能逆向传播的示踪剂，以及一种无法从靶细胞传播出去的标记物。通过该方法，可以识别出目标神经元、上游神经元和下游神经元。实验结果表明，该实验方案可用于在单细胞分辨率下分析胚胎期雌性小鼠大脑中神经环路的形成过程。

该方法有助于解答发育神经科学领域中的关键问题，例如特定神经环路在何时形成，以及在胚胎发育过程中如何组织。该方法也可用于追踪成年小鼠的神经环路。具体而言，可利用该方法分析基因明确标识的神经元之间的突触活动，并可用于分析不同实验条件如何随时间调节神经环路。

取一只刚处死的怀孕小鼠。用70%乙醇清洁其腹部腹侧，然后做一纵向切口以暴露胚胎。取出胚胎串，并将其转移至含有冰冻PBS的培养皿中。

使用钝头镊子取出各个胚胎。在溶液中用精细剪刀和镊子将各个胚胎分开，并在胚胎完全清理干净的过程中去除多余的组织。从每个胚胎上取一小段尾部组织样本，放入含有裂解缓冲液的离心管中，用于收集DNA以进行性别鉴定和基因分型。

然后将胚胎转移至新配制的预冷的含4%PFA的冰上溶液中。每处理一个胚胎后，根据其大小，在PFA中振荡孵育至少1.5小时。孵育完成后。

用预冷的 PBS 在冰上洗涤固定后的组织，每次至少 5 分钟，共洗涤三次。然后将胚胎转移至 4 ℃保存的 30% 蔗糖溶液中。当组织完全沉入溶液底部后，即可进行冷冻切片。

首先，使用耐酒精的永久性标记笔标记一个冷冻模具。接着，在冰桶中用粉碎的干冰与100%乙醇配制冰浆，并用此冰浆预冷一个盛有异戊烷的玻璃烧杯，持续约10分钟。等待期间，将组织从蔗糖溶液中取出，并用标准实验室擦拭纸擦去多余的蔗糖。

然后将组织转移至预先标记的冷冻模具中，加入足量的OCT包埋剂以完全覆盖组织。注意避免在OCT中产生气泡，尤其是组织周围。

接下来，使用轻型昆虫学镊子小心地调整组织的方向，以尽量减少损伤。如有需要，将冷冻模具浸入冷却的异戊烷浴中速冻，注意避免产生飞溅。冷冻后的模具可包裹后于-80摄氏度保存，以备后续切片使用。

将它们切成连续的14微米厚切片，每五片为一组。将每组五片切片收集到一张超冻玻璃载片上。在配制本方案所需溶液时，务必缓慢将Tween 20加入TNT缓冲液中，且该缓冲液必须新鲜配制。

然后缓慢上下冲洗溶液以混匀。配制TNB缓冲液时，边搅拌边缓慢分次加入封闭试剂。随后将溶液置于水浴中加热至55摄氏度。

溶液将变得浑浊。现在，开始处理组织，首先使用手术刀切除组织切片周围多余的OCT包埋剂，然后用防脱片笔标记每个切片的边界。

将切片恢复至室温。随后用室温的1×PBS缓冲液洗涤切片，每次洗涤5分钟，共洗涤三次。接着，将切片置于冰上预冷的含0.3%过氧化氢的甲醇溶液中孵育30分钟，以淬灭内源性过氧化物酶活性。

随后在室温下用 PBS 洗涤三次，每次洗涤 5 分钟。然后将切片在 PBST 中孵育 10 分钟，以通透组织。接着用 TNT 溶液洗涤切片三次。

现在将组织置于湿盒中，用足量的TNB覆盖每张载玻片以进行封闭。室温孵育半小时。切勿让载玻片干燥。

完全吸尽封闭缓冲液后，用 TNB 缓冲液中的初级抗体完全覆盖切片，以结合示踪物。在室温下孵育两小时，或在 4 摄氏度下过夜孵育。为去除初级抗体，用 TNT 缓冲液在室温下洗涤切片三次，每次五分钟。

在这些洗涤步骤中，需进行轻柔振荡。接着，将切片在二抗溶液中室温孵育一小时。随后，使用三次TNT缓冲液洗涤，以去除未结合的二抗。

然后在湿盒中，将组织在TNB缓冲液中与1至100倍稀释的去糖基化辣根过氧化物酶孵育30分钟，室温下进行，同时用TNT缓冲液洗涤玻片。孵育结束后，配制新鲜的TSA溶液稀释液。立即将在室温下新鲜配制的TSA稀释液准确作用于组织10分钟。

TSA 孵育的精确时间至关重要。因此，切勿试图一次性处理过多的载玻片。每次最多可处理 10 张载玻片。

其他切片可在TNT洗涤缓冲液中等待，直至经过另一轮洗涤后进行处理。将组织与1:500稀释的Alexa Fluor 546标记的抗体在TNB缓冲液中于室温孵育30分钟。

在室温下，用三份 TNT 溶液洗涤以去除去垢剂结合物。然后进行核染色，在室温下用含 5% BIS 苯扎溶液的 PBS 处理 10 分钟，再用三份 TNT 溶液洗去 BIS 苯扎染料。随后用 Fluoro Mount G 封片，进行后续分析。

利用所述方案，分析了携带 R 26 BIZ 和 R 26 GTT 等位基因的小鼠中调控生殖轴的神经回路的成熟过程。通过在胚胎期弓状核的吻素神经元中使用特异性吻素cre驱动小鼠品系，经cre介导的重组激活转基因表达，并对来自吻素神经元的R 26 BIZ样本进行绿色吻素与红色BL的双重免疫荧光染色。

小鼠显示KISS IC R 26 GTT小鼠中BL的激活，双重免疫荧光显示KISSPEPTIN为绿色，由Cree驱动子激活的GTT为红色。这些及其他诊断结果表明，转基因在E 18.5实验胚胎中具有功能活性。弓状核中的Kisspeptin神经元已被发现与GNRH存在通讯。

缺乏Z的神经元仅局限于表达CRE的吻肽神经元，而BL则通过突触传递至上游和下游神经元。部分但并非全部促性腺激素释放激素（GNRH）神经元中含有bl。

因此，只有一部分胚胎期的促性腺激素释放激素（GNRH）神经元在突触水平上与弓状核的吻肽（kisspeptin）神经元相连。GNRH神经元中未检测到逆行示踪剂，葡萄糖耐量试验（GTT）表明这些神经元位于吻肽神经元的下游。

一旦掌握，该技术可在一天内按照本方案完成。其他方法如双重免疫荧光可用于鉴定相连神经元的生化特性。该技术将为神经科学和发育生物学领域的研究人员探索发育过程中及成年动物体内单细胞分辨率水平的神经连接提供重要途径。

观看本视频后，您应能充分理解如何在小鼠中观察神经回路的形成与成熟过程。