Name: 有条件的遗传跨突触标记在胚胎小鼠脑 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: 学习使用三种细胞标记系统和双向跨突触示踪剂追踪胚胎小鼠大脑神经回路发育的方法。该技术可在单细胞分辨率下可视化神经连接，适用于发育神经科学研究。

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感谢 Michael Candlish 对本文手稿提出的宝贵意见。本项目得到了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）资助，资助编号为 BO1743/6 以及 SFB/TRR 152 P11 和 Z02，授予 Ulrich Boehm。

注意：伦理声明：涉及动物受试者的实验程序已获得汉堡大学和萨尔兰大学动物福利委员会的批准。
1. 胚胎组织的制备与固定
<ol>
	<li>在处死动物前，准备好解剖胚胎所需的所有设备，并配制后续组织固定的溶液。 
	注意：务必现配新鲜的 4% 多聚甲醛（PFA）溶液（4% PFA 溶于 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PBS）中，调节 pH 至 7.4）。</li>
	<li>采用符合伦理批准的方法处死定时妊娠的雌性小鼠。</li>
	<li>将小鼠转移至操作平台，用 70% 乙醇润湿腹部腹侧，使用锋利剪刀做垂直切口，暴露腹腔。</li>
	<li>识别胚胎串，用钝头镊子小心将其拉出，并放入冰上预冷的 PBS 中。</li>
	<li>使用精细剪刀和镊子从胚胎串中分离各个胚胎，去除胚胎周围的多余组织，并在冰上预冷的 PBS 中清洗胚胎。</li>
	<li>在将胚胎转移至 PFA 溶液前，取少量尾部组织样本，放入尾部裂解缓冲液中，用于性别鉴定及示踪等位基因的 PCR 基因分型。</li>
	<li>从最外侧的胚胎开始，将每个胚胎分别转移至含有冰上预冷 4% PFA 的离心管中，并置于摇床上。</li>
	<li>对于 E13.5 及更早期的胚胎，在冰上持续摇动浸泡 1.5 小时；对于 E14.5 和 E15.5 期胚胎，在冰上持续摇动浸泡 2.5 小时。</li>
	<li>对于 E16.5 及更晚期的胚胎，在浸泡前需先断头并去除外部皮肤，再将头部浸入 PFA 溶液中。E16.5 胚胎的头部可在冰上持续摇动浸泡 4.5 小时。</li>
	<li>适当固定后，用冰上预冷的 PBS 清洗胚胎三次。将胚胎转移至含 30% 蔗糖的 PBS 溶液中，4 °C 下保存直至胚胎沉降至管底。</li>
</ol>
2. 冷冻
<ol>
	<li>开始冷冻过程前，准备好所需全部材料：冷冻模具、冷冻手套、超轻型昆虫镊子、记号笔和最佳切割温度化合物（O.C.T.）。</li>
	<li>使用永久性耐酒精记号笔在冷冻模具上标注（注明组织方向、日期和基因型）。在冰桶中制备粉碎干冰与100%乙醇的混合物，形成浆状。将盛有异戊烷的玻璃烧杯放入其中，静置10分钟，使异戊烷充分冷却。</li>
	<li>在此期间，将组织从蔗糖溶液中取出，用实验室擦拭纸擦去组织周围的过量蔗糖。将组织转移至预先标记好的冷冻模具中，并加入足量O.C.T.完全覆盖组织。注意避免O.C.T.中产生气泡，尤其是组织周围。</li>
	<li>使用超轻型昆虫镊子在O.C.T.中调整组织方向，避免损伤组织。将冷冻模具放入预冷的异戊烷浴中开始冷冻。注意不要将异戊烷溅入O.C.T.中，否则会导致组织无法正常冻结。将样品用铝箔包裹后，于-80 °C保存。</li>
</ol>
3. 冷冻切片
<ol>
	<li>使用冷冻切片机将样品切成14 µm厚的连续切片，每五片为一组，收集到SuperFrost® Plus载玻片上，用于免疫荧光（IF）分析。将载玻片储存于-80 °C，直至使用。</li>
</ol>
4. 使用酪胺信号放大（TSA）法进行示踪剂可视化
<ol>
	<li>配制染色所需的缓冲液和试剂。Tris-NaCl-Tween（TNT）缓冲液必须在使用当天新鲜配制。
	<ol>
		<li>使用 100 ml 1 M Tris-HCl pH 7.5、30 ml 5 M NaCl 和 ddH₂O 配制 TNT 缓冲液2加水至终体积为 1 L。使用 1 ml 移液器加入 500 µl 吐温 20。缓慢加入吐温 20，并反复吹打移液器数次，以确保所有吐温 20 完全溶解。</li>
		<li>使用100 ml 1 M Tris-HCl（pH 7.5）、30 ml 5 M NaCl和ddH₂O配制Tris-NaCl-封闭（TNB）缓冲液2加水定容至1 L。在搅拌条件下，将5 g封闭试剂（随试剂盒提供）分小份缓慢加入缓冲液中。持续搅拌并逐渐加热溶液至55 °C，以完全溶解封闭试剂（此过程不应超过30–60分钟）。为实现均匀加热，可使用55 °C水浴。溶液将呈现乳白色。使用前冷却至室温。分装后于-20 °C长期保存。</li>
		<li>将生物素酪胺试剂（试剂盒提供）用分子生物学/HPLC级DMSO溶解。根据所用试剂盒的不同，所需DMSO的适量可能有所差异。将储备液储存于4 °C。 
		注意：来自相应基因杂合型动物的组织部分 Cre 和 R26 等位基因可用于电路分析。使用同窝幼崽中携带一个等位基因的组织切片 Cre 或一个 R26 等位基因作为阴性对照。将双杂合动物的阴性对照切片与其他双杂合动物来源的切片同样处理。此外，增设一个来自双杂合动物的对照切片，但不加入TSA试剂（未扩增对照）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用锋利的新手术刀去除组织切片周围多余的O.C.T.，并用PAP笔在切片周围标记边界。</li>
	<li>将载玻片在室温（RT）下干燥 2–3 分钟。在室温下用 TNT 溶液洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗 3 次。将载玻片在含 0.3% H₂O₂ 的溶液中室温孵育 30 分钟。2O2 用冰冷的甲醇溶液淬灭内源性过氧化物酶活性。</li>
	<li>室温下用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。在 PBS 中加入 0.5% Triton-X 100，室温孵育 10 分钟，以实现组织通透。室温下用 TNT 洗涤载玻片 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>在湿盒中，室温下用 TNB（封闭液，每张切片 200–300 µl）封闭 30 分钟。确保所有切片区域均被 TNB 完全覆盖。各步骤之间切勿让切片干燥。</li>
	<li>吸去多余的封闭缓冲液，加入用TNB稀释的一抗血清（BL使用1:1,000稀释的山羊抗WGA，GTT使用1:15,000稀释的兔抗GFP），室温孵育2小时或4 °C过夜。确保使用足够的液体体积完全覆盖组织切片（每张载玻片200–300 µl）。 
	注意：此处推荐的一抗稀释比例可能需要进行调整。</li>
	<li>室温下用TNT缓冲液振荡洗涤载玻片，每次5分钟，共洗3次。</li>
	<li>将切片与识别第一抗体宿主的生物素标记的二抗（抗WGA使用1:500稀释的马抗山羊IgG，抗GFP使用1:5,000稀释的山羊抗兔IgG，溶于TNB缓冲液）在室温下孵育1小时。</li>
	<li>在室温下用 TNT 振荡洗涤 3 次，每次 5 分钟。在湿盒中，于 TNB 中加入 1:100 稀释的链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物（SA-HRP，试剂盒提供），室温孵育 30 分钟。室温下用 TNT 振荡洗涤载玻片 3 次，每次 5 分钟。同时将 TSA 缓慢解冻。</li>
	<li>将TSA以1:50比例用扩增稀释液（随试剂盒提供；BL检测使用TSA试剂盒，GTT检测使用TSA+试剂盒）稀释。将组织切片置于稀释后的TSA中，室温精确孵育10分钟。TSA应在使用前现配，最好在前一步洗涤过程中进行稀释；剩余的稀释TSA不可用于后续实验，每次均需新鲜配制。</li>
	<li>在室温下用TNT缓冲液振荡洗涤载玻片，每次5分钟，共洗3次。在室温下，用TNB缓冲液按1:500比例稀释的Alexa Fluor® 546链霉亲和素偶联物孵育30分钟。在室温下用TNT缓冲液振荡洗涤载玻片，每次5分钟，共洗3次。</li>
	<li>在室温下用含5% bisbenzimide的PBS溶液孵育10分钟，进行细胞核染色。室温下用TNT缓冲液振荡洗涤切片，每次5分钟，共洗3次。用Fluromount G封片，进行落射荧光显微镜或共聚焦显微镜观察。 
	问题排查： 示踪剂转移的效率取决于该基因的表达水平 ROSA26 产生细胞中的位点（由所用的Cre驱动品系决定）以及所分析的神经环路例如 产生示踪剂的神经元数量，汇聚性 等等。因此，此处推荐的一抗稀释度可能需要调整，以避免信号过弱或过强。应始终使用适当的对照切片分析背景（见上文）。</li>
</ol>
5. 胚胎切片的 τlacZ 染色
<ol>
	<li>准备染色所需的缓冲液和试剂。LacZ 缓冲液 C 必须在使用前新鲜配制。
	<ol>
		<li>通过将 40 g X-gal 溶解于 1 ml 70% 二甲基甲酰胺（DMF）中，配制 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃苷（X-gal）储存液（40 mg/ml）。用铝箔包裹，长期保存时置于 -20 °C 保存。</li>
		<li>通过将 50 g NBT 溶解于 1 ml 70% DMF 中，配制硝基蓝四氮唑（NBT）储存液（50 mg/ml）。用铝箔包裹，长期保存时置于 -20 °C 保存。</li>
		<li>使用 80 µl 25% 戊二醛、5 ml 4% 多聚甲醛（PFA）、20 µl 1 M MgCl2、100 µl 500 mM EGTA、1 ml 1 M 磷酸盐缓冲液 pH 7.4，并用 ddH2O 定容至 10 ml，配制 LacZ 固定液。</li>
		<li>使用 1 ml 1 M MgCl2、5 ml 500 mM EGTA、50 ml 1 M 磷酸盐缓冲液 pH 7.4，并用 ddH2O 定容至 500 ml，配制 LacZ 缓冲液 A。</li>
		<li>使用 1 ml 1 M MgCl2、5 ml 500 mM EGTA、5 ml 1% 脱氧胆酸钠、100 ml 10% NP-40、50 ml 1 M 磷酸盐缓冲液 pH 7.4，并用 ddH2O 定容至 500 ml，配制 LacZ 缓冲液 B。</li>
		<li>向 1 ml LacZ 缓冲液 B 中加入 10 µl NBT 储存液和 12.5 µl X-gal 储存液，配制 LacZ 缓冲液 C。使用前新鲜配制，并用铝箔包裹。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将载玻片在室温下干燥至少 10–15 分钟（同时用 PAP 笔标记载玻片）。</li>
	<li>在化学通风橱内的湿盒中，用 LacZ 固定液于室温固定组织切片 2 分钟。用含 2 mM MgCl2 的 PBS 洗涤 3 次。</li>
	<li>用 LacZ 缓冲液 A 漂洗载玻片。在室温下用 LacZ 缓冲液 A 洗涤 3 次，每次 10 分钟。再用 LacZ 缓冲液 B 洗涤 2 次，每次 5 分钟。将载玻片置于湿盒中，在 30–37 °C 下用 LacZ 缓冲液 C 孵育 6 小时或过夜。 
	注意：加入足量的 LacZ 缓冲液 C；孵育过程中切勿让载玻片干燥。</li>
	<li>适当孵育后，用含 2 mM MgCl2 的 PBS 洗涤载玻片。用 ddH2O 短暂漂洗组织切片。用 Mayer 甘油明胶封片。适用于配备微分干涉差（DIC）成像系统的光学显微镜观察。</li>
</ol>
6. 性别与示踪基因分型
<ol>
	<li>使用1 ml 1 M Tris-HCl（pH 8.5）、100 µl 500 mM EGTA、200 µl 10% SDS、400 µl 5 M NaCl，并用ddH2O定容至10 ml，配制尾组织裂解缓冲液。</li>
	<li>向每个含有尾组织样本的Eppendorf管中加入500 µl尾组织裂解缓冲液。加入蛋白酶K，使其终浓度为100 mg/ml。在55 °C摇床中孵育过夜。</li>
	<li>在室温下以17,000 × g离心10分钟，将上清液转移至新的离心管中。向上清液中加入500 µl异丙醇。通过反复倒置混匀至少5分钟。</li>
	<li>在室温下以17,000 × g离心5分钟，弃去上清液。加入200 µl 70%乙醇，振荡至少5分钟。</li>
	<li>以17,000 × g离心5分钟，用移液器吸除上清液（不要倾倒）。将沉淀在37 °C温育箱中干燥15–30分钟。</li>
	<li>使用宽口滤芯吸头，将沉淀重悬于100 µl低TE缓冲液（pH 8.0）或水中。在55 °C放置1小时，随后在37 °C过夜以充分溶解。储存于4 °C。</li>
	<li>取1 µl DNA用于PCR反应（50 μl反应体系，包含1 μl尾组织DNA、2.5 μl DMSO、每种引物10 pM、每种dNTP 25 μM以及1 M甜菜碱）。用于基因分型和性别鉴定的PCR引物列于材料表中。</li>
</ol>

<ol><li>Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+techniques+for+tracing+pathways+in+the+central+nervous+system+of+developing+and+adult+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals.</a> Brain. Res. Bull. 51, 11-28 (2000).</li>
<li>Huang, Z. J., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+approaches+to+neural+circuits+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic approaches to neural circuits in the mouse.</a> Annu. Rev. Neurosci. 36, 183-215 (2013).</li>
<li>Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+half+century+of+experimental+neuroanatomical+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">A half century of experimental neuroanatomical tracing.</a> J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).</li>
<li>DeFalco, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-assisted+mapping+of+neural+inputs+to+a+feeding+center+in+the+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus.</a> Science. 291, 2608-2613 (2001).</li>
<li>Kumar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+arcuate+nucleus+kisspeptin+neurons+communicate+with+GnRH+neurons+in+utero%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Murine arcuate nucleus kisspeptin neurons communicate with GnRH neurons in utero.</a> J. Neurosci. 34, 3756-3766 (2014).</li>
<li>Horowitz, L. F., Montmayeur, J. P., Echelard, Y., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+approach+to+trace+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A genetic approach to trace neural circuits.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3194-3199 (1999).</li>
<li>Maskos, U., Kissa, K., ST Cloment, C., Brulet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+trans-synaptic+transfer+of+green+fluorescent+protein+allows+the+genetic+mapping+of+neuronal+circuits+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Retrograde trans-synaptic transfer of green fluorescent protein allows the genetic mapping of neuronal circuits in transgenic mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 10120-10125 (2002).</li>
<li>De Roux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypogonadotropic+hypogonadism+due+to+loss+of+function+of+the+KiSS1-derived+peptide+receptor+GPR54%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hypogonadotropic hypogonadism due to loss of function of the KiSS1-derived peptide receptor GPR54.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10972-10976 (2003).</li>
<li>Seminara, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GPR54+gene+as+a+regulator+of+puberty%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">The GPR54 gene as a regulator of puberty.</a> N. Engl. J. Med. 349, 1614-1627 (2003).</li>
<li>Mayer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+completion+of+puberty+in+female+mice+depend+on+estrogen+receptor+alpha-signaling+in+kisspeptin+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor alpha-signaling in kisspeptin neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 22693-22698 (2010).</li>
<li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat. Genet. 21, 70-71 (1999).</li>
<li>Seibler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+copy+shRNA+configuration+for+ubiquitous+gene+knockdown+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Single copy shRNA configuration for ubiquitous gene knockdown in mice.</a> Nucleic Acids Res. 33, e67(2005).</li>
<li>Semaan, S. J., Kauffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+on+the+epigenetic+and+transcriptional+regulation+of+the+Kiss1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts on the epigenetic and transcriptional regulation of the Kiss1 gene.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 31, 452-462 (2013).</li>
<li>Feil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-activated+site-specific+recombination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ligand-activated site-specific recombination in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10887-10890 (1996).</li>
</ol>

未声明利益冲突。

与立体定位注射示踪剂或嗜神经病毒相比，将跨突触示踪剂作为转基因表达以追踪基因定义神经元群体的神经环路具有多项优势。首先，示踪剂作为内源性蛋白产生，因此不会引发任何免疫反应，并且可在不同动物中高重复性地分析特定神经通路。其次，由于该方法为非侵入性，可用于追踪难以通过立体定位注射接近的神经元环路，例如在子宫内（in utero）的神经元。其局限性包括跨突触传递效率普遍较低，可能导致示踪剂检测困难。此外，示踪分子在每次突触传递过程中都会被稀释。相比之下，嗜神经病毒可在细胞内复制，病毒在跨越突触后的复制过程可实现信号放大。然而，病毒复制也会导致固有的病毒细胞毒性，这是使用嗜神经病毒的主要局限之一。遗传性跨突触示踪剂与基因改造的嗜神经病毒的一些特性比较见表1。
在Cre介导的重组条件下，R26-BIZ 和 R26-GTT 等位基因相互补充，有助于对遗传学上明确的神经元群体的神经环路进行可视化。R26 启动子已被充分表征，可介导广泛但强度适中的表达11,12。采用高灵...

解剖学路径示踪是解析脑与行为关系最常用的工具之一1。神经环路示踪技术的进步使神经科学家能够从基因明确的小鼠神经元群体中追踪神经环路2。尽管技术不断进步，揭示神经环路的形成过程仍然具有挑战性，尤其是在胚胎发育成熟阶段。这是因为迄今为止开发的大多数示踪方法依赖于立体定位注射跨突触示踪剂或基因改造的嗜神经病毒（图1）2,3。虽然这些技术能够实现连接性的空间和时间分辨率，但仍存在若干固有局限性，例如向发育中的脑组织注射示踪剂技术难度较高、注射位点的可重复性差、注射部位可能引发炎症反应，以及最重要的是嗜神经病毒引起的细胞毒性，这些因素限制了它们的应用4。
另一种方法是在基因改造小鼠中将跨突触示踪剂表达为转基因。我们最近改进了该技术，开发出一种双元遗传性跨突触示踪系统，用于绘制任何基因定义神经元群体的神经环路5。我们的实验策略基于两种新的基因敲入小鼠品系，这两种品系在Cre介导的重组后，可在ROSA26位点分别表达双向示踪剂大麦凝集素（barley lectin, BL）6，或表达与GFP融合的破伤风毒素C片段（Tetanus Toxin fragment C fused to GFP, GTT）这一逆向示踪剂7。本文中，我们利用这些小鼠品系在表达kisspeptin的神经元中选择性地表达BL和GTT，kisspeptin是一种参与调控生殖轴成熟过程的神经肽8,9。我们证明，该技术适用于可视化雌性小鼠脑胚胎发育过程中kisspeptin神经环路的发育与成熟5。
育种策略
R26-BL-IRES-τlacZ（BIZ）和 R26-GFP-TTC（GTT）示踪小鼠品系是携带重组ROSA26等位基因的基因敲入品系5。R26-BIZ和R26-GTT等位基因由于存在一个两侧由loxP位点包围的强转录终止信号而处于转录沉默状态5。BIZ和GTT转基因的表达可通过Cre介导切除该转录终止信号而被激活。通过将R26-BIZ或R26-GTT品系分别与Cre驱动品系杂交，即可独立使用这两个等位基因。用于分析的动物可选用分别携带相应Cre和R26等位基因的杂合子。对照组应选用同窝出生、仅携带一个Cre或一个R26等位基因的动物。此外，也可构建同时携带Cre、R26-BIZ和R26-GTT三个基因敲入等位基因的动物，但这需要额外进行一次杂交。

<table><tbody><tr><td>双苯并咪唑（Hoechst 33258 染料）</td><td>Sigma</td><td>14530-100MG</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma</td><td>32205-1L</td><td></td></tr><tr><td>冷冻模具（Peel-a-way）</td><td>Polyscience Inc.</td><td>18646A-1</td><td>22 x 22 x 20mm</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418-100ML</td><td></td></tr><tr><td>二甲基甲酰胺（DMF）</td><td>VWR Chemicals</td><td>23470,293</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>ROTH</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Sigma</td><td>G5882-50ML</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>Sigma</td><td>34988-7</td><td></td></tr><tr><td>异戊烷（甲基-2-丁烷）</td><td>Sigma</td><td>M32631-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Kaiser's 甘氨酸明胶</td><td>Merck</td><td>1092420100</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma</td><td>494437-1L</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M2670-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ROTH</td><td>HN00.2</td><td></td></tr><tr><td>NBT</td><td>Sigma</td><td>298-83-9</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 替代品</td><td>Fluka</td><td>743.85</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Leica</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td>PAP 笔</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma</td><td>D6750-25G</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost 载玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>FT4981GLPLUS</td><td></td></tr><tr><td>TSA 试剂盒</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL700</td><td></td></tr><tr><td>TSA plus 试剂盒</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL749A001KT</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>ROTH</td><td>AE15.2</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>ROTH</td><td>3051.2</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>ROTH</td><td>9127.1</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>ROTH</td><td>2315.1</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>配备微分干涉（DIC）成像系统的光学显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop2 配备 Axio Vision 软件</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop2 配备 Axio Vision 软件</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>PS6</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗 WGA 抗体（识别 BL）</td><td>Vector Laboratories</td><td>AS-2024</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的马抗山羊 IgG</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-9500</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的山羊抗兔 IgG</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>兔抗 GFP 抗体（识别 GTT）</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>兔抗 GnRH 抗体</td><td>Affinity Bio Reagent</td><td>PA1-121</td><td></td></tr><tr><td>Dylight488 标记的驴抗兔 IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>SA5-10038</td><td></td></tr><tr><td>SA-Alexa Fluor 546</td><td>Life Technologies</td><td>S-11225</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">引物</td></tr><tr><td>BL 正向引物（用于 BIZ 基因分型）</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>ATGAAGATGATGAGCACCAGGGC</td></tr><tr><td>BL 反向引物（用于 BIZ 基因分型）</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>AGCCCTCGCCGCAGAACTC</td></tr><tr><td>Cre 正向引物（用于 Cre 基因分型）</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG</td></tr><tr><td>Cre 反向引物（用于 Cre 基因分型）</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC</td></tr><tr><td>TTC 正向引物（用于 GTT 基因分型）</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT</td></tr><tr><td>TTC 反向引物（用于 GTT 基因分型）</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA</td></tr><tr><td>XY 正向引物（用于性别基因分型）</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>TGAAGCTTTTGGCTTTGA</td></tr><tr><td>XY 反向引物（用于性别基因分型）</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CCGCTGCCAAATTCTTTG</td></tr><tr><td>ROSA26 正向引物</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC</td></tr><tr><td>ROSA26 反向引物</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GCAGATGGAGCGGGAGAAAT</td></tr><tr><td>SA 反向引物</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC</td></tr></tbody></table>

胚胎小鼠大脑中的条件性遗传跨突触示踪

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

解剖学路径示踪对于揭示脑与行为之间的关系至关重要。然而，由于目前大多数跨突触示踪方法依赖于立体定位示踪剂注射，因此在胚胎脑发育过程中解析神经回路的形成在技术上具有挑战性。为克服这一问题，我们开发了一种二元遗传策略，用于在小鼠脑中进行条件性遗传跨突触示踪。为此，我们构建了两种互补的基因敲入小鼠品系，可在Cre介导的重组后，从ROSA26位点特异性表达双向跨突触示踪剂大麦凝集素（BL）以及逆行性跨突触示踪剂破伤风毒素C片段。这些小鼠中示踪剂的细胞特异性表达由基因编码，无需机械性示踪剂注射。因此，我们的实验方法适用于研究胚胎小鼠脑中神经回路的形成。此外，由于示踪剂在突触间的传递依赖于突触活性，这些小鼠品系可用于在单细胞分辨率下分析脑发育过程中遗传定义的神经元群体之间的信息传递。本文提供了利用新型ROSA26等位基因在小鼠胚胎中进行跨突触示踪的详细实验方案。我们已应用该技术系统描绘了发育中的雌性小鼠脑中调控生殖轴成熟所依赖的神经回路结构。

本部分展示了使用该方法可获得的代表性结果 R26-BIZ (BL-IRES-τlacZ) 以及 R26-GTT（G荧光偏振-TTC) 等位基因。在此我们使用 R26-BIZ 和 R26-GTT 等位基因，用于分析调控生殖轴的神经回路的成熟过程。脊椎动物的生殖活动主要由下丘脑中一小群神经元通过分泌促性腺激素释放激素（GnRH）进行中枢调控。Kisspeptin 是 GnRH 神经元的强效激活剂，已被证实参与调控 GnRH 神经元的活动，然而在发育中的雌性小鼠大脑中，GnRH 神经元与 kisspeptin 神经元之间的神经回路何时建立尚不清楚5首先，我们证明BIZ和GTT转基因的表达在胚胎期弓状核（ARC）的kisspeptin神经元中，可特异性地通过Cre依赖性重组被激活。图2使...

利用一种双元遗传策略，我们提供了一种详细的神经环路示踪实验方案，适用于在Cre介导的重组后表达互补性跨突触示踪剂的小鼠。由于细胞特异性的示踪剂表达由基因编码决定，本实验方法可在单细胞分辨率下研究小鼠胚胎脑发育过程中神经环路的形成与成熟。

解剖学路径追踪对于阐明大脑与行为之间的关系至关重要。揭示神经环路的形成……

以下实验的目标是利用三种不同的细胞标记系统，通过一种可双向跨突触传递的示踪剂、一种仅逆行传递的示踪剂以及一种不从靶细胞传播的第三种标记，对小鼠胚胎脑中神经回路的发育过程进行可视化观察。该方法能够识别出目标神经元、上游神经元和下游神经元。实验结果表明，该实验方案可用于在单细胞分辨率下分析中国台湾地区雌性小鼠胚胎脑中神经回路的形成过程。该方法有助于解答发育神经科学领域中的关键问题，例如特定神经回路在何时形成，以及在胚胎发育过程中如何进行组织。该方法也可用于追踪成年小鼠的神经回路。具体而言，它可以用于分析遗传学上可识别的神经元之间的突触活动，并可用于分析不同实验条件如何随时间调节神经回路。取一只刚处死的怀孕小鼠。用70%乙醇清洁其腹部腹侧，然后做一纵向切口以暴露胚胎。取出胚胎串，并将其转移至含有冰上预冷PBS的培养皿中。使用钝头镊子取出各个胚胎。在溶液中用精细剪刀和镊子将各个胚胎分开，同时去除多余组织，直至胚胎完全清理干净。从每个胚胎上取一小段尾部组织样本，放入含有裂解缓冲液的离心管中，用于收集DNA以进行性别鉴定和基因分型。然后将胚胎转移至新配制的冰上预冷的4% PFA溶液中。每处理一个胚胎后，根据其大小，让其在PFA中振荡孵育至少1.5小时。孵育完成后。用预冷的 PBS 在冰上洗涤固定组织三次，每次至少五分钟。然后将胚胎转移至 30% 蔗糖溶液中，置于 4°C 条件下。当组织完全沉入溶液中后，进行冷冻切片。首先，使用耐酒精的永久性标记笔标记一个冷冻模具。接着，在冰桶中用100%乙醇与粉碎的干冰混合制成浆状物，并利用该冷却浴将玻璃烧杯中的异戊烷预冷约10分钟。等待期间，将组织从蔗糖溶液中取出，并用常规实验室擦拭纸擦去多余的蔗糖。然后将组织转移至预先标记的冷冻模具中，加入足量的OCT包埋剂以完全覆盖组织。注意避免在OCT中产生气泡，尤其是组织周围。接下来，使用轻质昆虫学镊子小心地调整组织方向，以尽量减少损伤。如有需要，将冷冻模具浸入冷却的异戊烷浴中速冻，注意避免产生飞溅。冷冻后的模具可包裹后于-80摄氏度保存，以备后续切片使用。将它们切成连续的14微米厚切片，每五片为一组。将每组五片切片收集到一张超冻玻璃载片上。在配制本方案所需溶液时，务必缓慢将Tween 20加入TNT缓冲液中，且该缓冲液必须新鲜配制。然后缓慢上下吹打溶液以混匀。在配制 TNB 缓冲液时，边搅拌边缓慢少量加入封闭试剂。然后使用水浴将溶液加热至 55 摄氏度。溶液将变得浑浊。现在，开始对组织进行操作，首先使用手术刀切除组织切片周围多余的OCT包埋剂，然后用组织标记笔标出每个切片的边界。将玻片恢复至室温。然后用室温的1×PBS缓冲液洗涤三次，每次洗涤持续五分钟。接着，将玻片置于冰上预冷的含0.3%过氧化氢的甲醇溶液中孵育半小时，以淬灭内源性过氧化物酶活性。随后在室温下用 PBS 洗涤三次，每次五分钟。然后将切片在 PBST 中孵育 10 分钟以透化组织。接着用 TNT 溶液洗涤切片三次。现在将组织置于湿盒中，加入足量的TNB缓冲液覆盖每张玻片，进行封闭。室温孵育30分钟。注意防止玻片干燥。完全排干封闭缓冲液后，用 TNB 缓冲液中的初级抗体充分覆盖玻片，以结合示踪物。在室温下孵育两小时，或在 4 摄氏度下孵育过夜。为去除初级抗体，用 TNT 缓冲液在室温下洗涤玻片三次，每次洗涤五分钟。在这些洗涤步骤中，需进行轻柔的振荡。接着，将切片在二抗溶液中室温孵育1小时。随后，使用三次TNT缓冲液洗涤，以去除未结合的二抗。然后在湿化孵育盒中，将组织切片置于含1至100倍稀释的链霉亲和素-辣根过氧化物酶（streptavidin-conjugated horse radish peroxidase）的TNB缓冲液中，室温孵育30分钟，同时用TNT缓冲液洗涤载玻片。孵育结束后，配制新鲜的TSA溶液稀释液。立即将在室温下新鲜配制的TSA稀释液加入组织切片，准确孵育10分钟。TSA 孵育的精确时间至关重要。因此，不要试图一次性处理过多的载玻片。每步最多可处理 10 张载玻片。额外的载玻片可在 TNT 洗涤缓冲液中等待，直至完成另一轮洗涤后进行处理。将组织与 1:500 稀释的 Alexa Fluor 546 偶联物在 TNB 中孵育 30 分钟。室温下，用三次 TNT 浸泡去除去垢剂处理的结合物。然后进行核染色，在室温下用 PBS 配制的 5% BIS 苯甲溶液孵育 10 分钟，再用三次 TNT 洗涤去除 BIS 苯甲染色液。随后用 Fluoro Mount G 封片并进行后续分析。利用所述方案，分析了携带 R 26 BIZ 和 R 26 GTT 等位基因的小鼠中调控生殖轴的神经回路成熟过程。通过在胚胎期弓状核的吻肽神经元中使用特异性吻肽 Cre 驱动小鼠品系，经 Cre 依赖性重组激活转基因表达，并对吻肽（绿色）和 BL（红色）进行双重免疫荧光染色，来自 kiss.IC R 26 BIZ。小鼠显示 KISS IC R 26 GTT 小鼠中 BL 的激活，双重免疫荧光显示 KISSPEPTIN 呈绿色，由 Cree 驱动器激活的 GTT 呈红色。这些及其他检测结果表明，在 E 18.5 实验胚胎中，转基因具有功能活性。弓状核中的 Kisspeptin 神经元已被发现与 GnRH 存在通讯。缺乏Z的神经元仅局限于表达CRE的吻素神经元，而BL则通过突触传递至上游和下游神经元。部分但并非全部GnRH神经元含有BL。因此，只有一部分胚胎期的GnRH神经元与弓状核的kisspeptin神经元形成突触连接。GnRH神经元中未检测到逆行示踪剂，葡萄糖耐量试验（GTT）表明这些神经元位于kisspeptin神经元的下游。一旦掌握，该技术可在一天内按照本方案完成。其他方法如双重免疫荧光可用于鉴定相连神经元的生化特性。该技术将为神经科学和发育生物学领域的研究人员探索发育过程中及成年动物中单细胞分辨率水平的神经连接提供重要途径。观看本视频后，您应能充分理解如何在小鼠中观察神经回路的形成与成熟过程。

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有条件的遗传跨突触标记在胚胎小鼠脑

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琼脂糖包埋电穿孔辅助的基因转移技术在小鼠皮层中间神经元前体细胞中的应用

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电穿孔法标记鸡胚后脑以示踪轴突投射路径及突触靶点

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In Utero 电穿孔法结合脑片培养对小鼠胚胎脑中迁移神经元进行延时共聚焦成像

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透射电子显微镜与宫内转导相结合是一种研究神经系统发育过程中精细超微结构形态变化的有力方法。这种联合技术能够深入揭示神经可塑性相关结构细节的变化及其拓扑表征。...

子宫内转导发育期小鼠脑和脊髓后超微结构神经可塑性参数的评估

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胚胎小鼠脑切片中迁移神经元和胶质前体细胞的延时成像

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胚胎小鼠大脑中的条件性遗传跨突触示踪

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