有条件的遗传跨突触标记在胚胎小鼠脑

以下实验的目标是通过使用双向传播的反式突触示踪剂、仅以逆行方式传播的第二示踪剂和不从目标细胞传播的第三标记，使用三种不同的细胞标记系统来可视化胚胎小鼠大脑中神经回路的发育。可以识别目标神经元上游神经元和下游神经元。结果表明，该实验方案可用于以单细胞分辨率分析胚胎雌性小鼠大脑中神经回路的形成。

这种方法可以帮助回答发育神经科学领域的关键问题，例如特定的神经回路何时形成以及它们在胚胎发育过程中是如何组织的。这种方法也可用于追踪成年小鼠的神经回路。具体来说，它可用于分析遗传鉴定神经元之间的突触活动，并可用于分析不同的实验条件如何随着时间的推移调节神经回路。

从一只刚刚安乐死的怀孕老鼠开始。用 70% 乙醇清洁腹部腹侧，然后做一个垂直切口，露出胚胎。去除胚胎链并将它们转移到培养皿中的冰冷 PBS 盘中。

使用钝镊子取出单个胚胎。使用细剪刀和镊子将溶液中的单个胚胎分开，当胚胎完全清洁时，在此过程中去除多余的组织。从每个胚胎中取出一个小尾活检，并放入一管裂解缓冲液中，以收集 DNA 用于性别鉴定和基因分型。

然后将胚胎转移到新鲜制作的冰冷的 4% PFA 冰上。处理完每个胚胎后，让它们在 PFA 中搅拌孵育至少 1.5 小时，具体取决于它们的大小。孵育完成后。

用冰冷的 PBS 洗涤固定的组织 3 次，每次洗涤至少 5 分钟。然后将胚胎转移到 30% 蔗糖溶液中，保持在 4 摄氏度。当组织完全沉入溶液中时，继续进行冷冻切片。

首先，首先使用永久性耐酒精标记标记低温模具。接下来，在冰桶中准备 100% 乙醇中的碎干冰浆，使用浆液将装有异戊烷的玻璃烧杯冷却约 10 分钟。等待时，从蔗糖溶液中取出组织，并用标准实验室抹布擦去多余的蔗糖。

然后将组织转移到预先标记的冷冻模具中。用足够的 OCT 覆盖组织。不要在 OCT 中形成任何气泡，尤其是在组织周围。

接下来，使用羽毛重量的昆虫学镊子定位组织，以造成最小的损伤。如果需要，将冷冻模具冷冻在冷却的异戊烷浴中，不要引起任何飞溅。冷冻的模具可以包裹并在零下 80 摄氏度下储存以切割模具。

将它们切成 14 微米厚的连续切片，每段 5 个。将每个五片系列收集在超级霜加载玻片上。为该方案准备溶液时，请务必将 tween 20 缓慢添加到 TNT 缓冲液中，TNT 缓冲液必须新鲜制备。

然后缓慢上下冲洗溶液以混合。在制备 TNB 缓冲液时，在搅拌的同时以小增量缓慢添加封闭试剂。然后使用水浴将溶液加热至 55 摄氏度。

溶液会变成乳白色。现在，要开始处理组织，首先使用手术刀去除组织切片周围多余的 OCT。然后用巴氏笔标记每个部分的边界。

让载玻片达到室温。然后在室温下洗涤 1 个 XPBS 缓冲液，每次洗涤 3 次，每次洗涤时间应为 5 分钟。接下来，将载玻片在冰冷的 0.3% 过氧化氢甲醇溶液中孵育半小时，以淬灭内源性过氧化物酶活性。

随后在室温下在 PBS 中洗涤 3 次，每次洗涤 5 分钟。然后将玻片在 PBST 中孵育 10 分钟以渗透组织。这一次，用 TNT 洗涤载玻片 3 次。

现在在加湿室中，将组织封闭在足够的 TNB 中以覆盖每张载玻片。让块在室温下放置半小时。不要让载玻片变干。

排空封闭缓冲液后，用 TNB 中的一抗完全覆盖载玻片以结合示踪剂。在 RT 下孵育 2 小时或在 4 摄氏度下过夜。要去除一抗，请在室温下用 TNT 洗涤玻片 3 次，每次洗涤 5 分钟。

在这些洗涤过程中，使用一些温和的搅拌。接下来，将切片在二抗溶液中孵育一小时。之后在室温下，使用 3 次 TNT 洗涤去除未结合的二抗。

然后在加湿室中，将组织在 1 到 100 个剥离的 havein 共轭辣根过氧化物酶的 TNB 中在室温下孵育 30 分钟，同时在 TNT 中洗涤载玻片。孵育后，制作 TSA 溶液的新鲜稀释液。现在，将新鲜制备的 TSA 稀释液在室温下涂抹在组织上整整 10 分钟。

TSA 孵化的准确时间至关重要。因此，不要尝试在我们手中一次处理太多幻灯片。一个步骤最多可处理 10 张玻片。

额外的载玻片可以在 TNT 洗涤缓冲液中等待，直到它们在另一轮洗涤后被处理。用 1 到 500 个 Alexa 地板 5 46 剥离的组织孵育。将其在 TNB 中共轭 30 分钟。

在室温下，用另外三个 TNT 浴去除剥离的常生偶联物。然后进行细胞核染色，在室温下将 5%BIS 苯并溶液溶于 PBS 中 10 分钟，用 3 次 TNT 洗涤去除 BIS 苯并染色。然后用荧光支架 G 安装载玻片并继续进行分析。

使用所描述的方案，在携带 R 26 BIZ 和 R 26 GTT 等位基因的小鼠中分析了调节生殖轴的神经回路的成熟度。使用 Kisspeptin 特异性信条驱动系对亲吻中绿色和 BL 的 kisspeptin 进行双重免疫荧光，通过弓状核中胚胎 kisspeptin 神经元的信条依赖性重组激活转基因的表达。IC R 26 商务。

小鼠在 KISS IC R 26 GTT 中显示 BL 激活小鼠双重免疫荧光显示 KISSPEPTIN 为绿色，被 Cree 驱动程序激活的 GTT 为红色。这些和其他诊断表明，转基因在 E 18.5 实验胚胎中起作用。他在弓状核中的 pepin 神经元被发现已经与 GNRH 交流。

缺乏 Z 的神经元局限于表达 kisspeptin 的 CRE 神经元，而 BL 经突触转移到上游和下游神经元。一些，但不是全部。GNRH 神经元包含 bl.

因此，只有胚胎 GNRH 神经元的一个子集与弓状核 kisspeptin 神经元在突触上连接。GNRH 神经元不包含逆行示踪剂。GTT 证明这些神经元位于 kisspeptin 神经元的下游。

一旦掌握，该技术可以在此程序后的一天内进行。其他方法（如双重免疫荧光）可用于识别连接神经元的生化性质。这项技术应该为神经科学和发育生物学领域的研究人员铺平道路，以探索发育过程中和成年动物中具有单细胞分辨率的神经连接。

看完这个视频，你应该对如何可视化小鼠神经回路的形成和成熟有很好的了解。