农杆菌介导的病毒诱导的基因沉默含量在棉花

该程序的总体目标是在棉花中开发一种农业细菌介导的病毒诱导的基因沉默测定法，以研究基因功能。这是通过首先将棉花幼苗培养到 10 天到 2 周龄阶段来实现的。然后将棉花叶绿体 rados one 基因克隆到基于烟草拨浪鼓病毒的 vs 载体中。

第三步是制备含有 P-T-R-V-R-N-A 和 P-T-R-V-G-R-C-A 的农杆菌培养物。最后一步是将农杆菌培养物人工接种到棉开口铅蛋白中。最终，通过观察大约两周后棉花植株真叶上的白化表型，可以显示基因沉默的结果。

与转化等现有方法相比，该技术的主要优点是 VIGs 为棉花的基因功能研究提供了一个快速高效的平台。虽然这种方法可以证明是在全基因组水平上快速大规模分析棉花基因功能的强大工具，但它也可以应用于其他重要的作物物种。一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为很难手工接种农杆菌培养物和棉花。

该方法可以帮助回答棉花遗传学和基因组学领域的关键问题，例如探索基因功能 种植棉花幼苗以进行病毒诱导的基因沉默。将 Metro mix 700 加入几个 7 厘米的花盆中，然后将装满的花盆放入托盘中。接下来种植几种陆地棉品种的种子，如纤维 max 8 3 2 phyto、gen 4、2 5、RF phyto、gen four 80 WR 和 delta pine 90。

在准备好的花盆中，用塑料圆顶盖住装有花盆的托盘，然后将托盘放入生长室，23 摄氏度，每秒 120 微爱因斯坦光，12 小时光照，12 小时黑暗光期三到四天后，一旦出现两个夹竹桃，取下塑料圆顶。让棉花植物生长约 10 天，直到植物达到两个完全膨胀的 cot leadin 发育的阶段。但在真叶出现之前，植物就可以用于病毒诱导的基因沉默测定。

这些克隆程序应在棉花植株达到完全膨胀阶段的两周内进行。首先，根据标准 PCR 程序，使用书面方案中提供的引物从 CACI remondi 叶组织的 CD NA 文库中扩增棉花叶绿体一个基因。然后根据酶制造商的方案，用 Echo R one 和 K PN one 消化 GCA one PCR 产物。

在 Athene 溴化物凝胶上观察 500 个碱基对的 PCR 产物。切出条带并提取 DNA 连接物，将纯化的 PCR 产物提取到 PYL 1 56 载体中。使用 T 4 DNA 连接酶，用连接的载体转化感受态大肠杆菌细胞，然后将 10 至 50 μL 转化的细胞涂布到含有 50 μg/mL canam Mycin 的 LBA 琼脂平板上。

第二天将板在 37 摄氏度下孵育过夜。从平板中挑选菌落，在含有每毫升 50 μg 罐头霉素的 2 毫升 LB 肉汤中生长过夜，通过离心收获细菌，并根据标准程序进行 DNA 制备。要纯化质粒 DNA，请通过限制性内切酶消化和测序来验证构建体。

一旦确认 PYL 1 56 载体中存在插入片段并定向，将质粒电作成农杆菌肿瘤 fas GV 3 1 0 1，并在 28 摄氏度的 LB 液体培养基中回收。在含有 50 μg/mL 罐头霉素和每毫升 25 μg 庆大霉素的 LBI 琼脂平板上选择转化体。如果需要，可以将细菌储存在零下 25 摄氏度的 80% 甘油中。

接种条纹前 3 天，T 认为携带 PYL 1 9 2 RNA one PY、1 56 RNA two 和 PY 1 56 RNA 两个 GLA one 的农杆菌肿瘤面的甘油原液在 LB 抗生素琼脂平板上在 28 摄氏度下孵育平板 24 小时。第二天，为每个构建体挑选一个菌落，并将每个菌落接种到 5 mL LB 培养基中。补充每毫升 50 微克罐装霉素和每毫升 25 微克庆大霉素。

将细菌培养物在 28 摄氏度下以每分钟 50 转的速度在摇床中培养过夜。将 PYL 1 56 RNA、两种 GLA one、培养物和对照培养物转移到含有 50 毫升 LB 培养基的分离瓶中，该培养基补充有 50 μg/mL 罐头霉素和 25 μg/mL 庆大霉素，加上 10 毫摩尔 MES 和 20 μmol 乙基。Cy Ringy 在 28 摄氏度下以每分钟 50 转的速度在摇床中培养培养物过夜。

第二天，将培养物转移到离心管中，以每分钟 4， 000 转的速度旋转农业细菌细胞，持续 5 分钟，将培养物重新悬浮在含有 10 毫摩尔氯化镁、10 毫摩尔 MES 和 200 微摩尔乙酰醛的浸润缓冲液中。测量培养物的 OD 600 并用浸润缓冲液调节至 1.5。在农业细菌叶片浸润之前，将培养物在室温下在工作台上孵育 3 小时。

用 25 号针头刺穿棉花植物的 cott leadin 的底面，不要刺穿 cott leadin。在 Cott Leadin 的每个部分上打一两个孔。接下来，将 PYL 1 92 RNA one 农业细菌培养物与 PYL 1 56 RNA two 或 PY 1 56 RNA two GRCA one 以一比一的比例混合。

然后使用 1 毫升针头或注射器。通过打孔将混合物引入孔的底部。用塑料圆顶覆盖植物，并将浸润的植物在室温下在昏暗的光线条件下放置过夜。

将植物转移到温度为 23 摄氏度、每秒每平方米 120 微爱因斯坦光照和 12 小时光照 12 小时黑暗循环的生长室中。检查浸润后 7 至 8 天的沉默表型。此时，被 PY 1 56 RNA 2 GLA one 沉默的植物真叶开始显示白化表型。

携带 PYL 1 56 RNA 2 的农业细菌渗透植物。用作对照。通过使用 RNA 逆转录 PCR 检查内源基因的表达水平，验证基因沉默效率，根据标准程序从对照和沉默的棉花植株中分离。

该图显示了病毒诱导的 GLA one 基因沉默后的纤维最大 8 3 2 品种。请注意这里发生基因沉默的白色叶子。一个 PHYTO 4 80 WR 品种在病毒诱导的基因沉默后也表现出白化表型。

同样，这个植物 4 2 5 RF 栽培品种在发生病毒诱导的基因沉默的地方显示出白色的叶子。最后，这张图片显示了另一个成功的病毒诱导基因沉默实验，这次是在 Delta PINE 90 品种中。在尝试此程序时，重要的是要记住将丙酮添加到农杆菌培养物中，然后再将它们放在工作台上三个小时。

然后可以执行其他方法，如 vig、CD NA 文库克隆，以回答其他问题，例如在开发后探索新的基因功能。这项技术为植物遗传学领域的研究人员探索具有重要经济意义的作物植物中抗生素（一种生物胁迫）的基因功能和防御反应铺平了道路。一旦屏蔽数据，如果执行得当，这项技术可以在两到三天内完成。

看完这个视频，你应该对如何在棉花中进行病毒诱导的基因沉默有了很好的了解。