Name: 优化和利用农杆菌介导的瞬态蛋白生产中烟草 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 23 min 21 s
Description: 了解农杆菌介导的真空渗透技术，用于在烟草植物中高效生产重组蛋白和疫苗抗原。该方法通过优化水培条件和菌株选择，实现了可规模化应用的瞬时蛋白表达系统。

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本工作由美国弗劳恩霍夫分子生物技术中心、iBio公司以及国防高级研究计划局（资助号 # HDTRA1-07-C-0054）提供支持。作者感谢普渡大学生物科学系Stanton Gelvin博士慷慨提供的赠品Agrobacterium tumefaciens 菌株）以及大型生物学公司（Large Scale Biology Corp.）的韦恩·菲茨莫里斯（Wayne Fitzmaurice）N. excelsiana 种子），以及美国的 Jennifer Nicholson 烟草属 采集，北卡罗来纳州立大学（N. excelsior 种子）。作者感谢Margaret Shillingford和Christopher Hull提供植物材料及出色的技术支持。作者还感谢Stephen Streatfield博士和Natasha Kushnir博士在编辑方面提供的帮助。

1. 植物培养
为了后续的农杆菌浸润实验，我们评估了两种野生型Nicotiana物种（N. benthamiana和N. excelsior）以及一种杂交种（N. excelsiana），这些植物均在室内设施中采用岩棉水培方式培养。
<ol>
	<li>将岩棉板浸泡在植物肥料溶液中。</li>
	<li>在已吸收养分的岩棉表面播种野生型 N. benthamiana、N. excelsior 以及 N. excelsiana（N. benthamiana × N. excelsior 的杂交种）的种子。</li>
	<li>在受控条件下培养种子（24 °C，相对湿度40-65%），采用长日照光周期（光照14小时，黑暗10小时，光照强度为130-150 μE m-2 sec-1），N. benthamiana 和 N. excelsiana 培养4-5周，N. excelsior 培养5-6周。</li>
</ol>
2. 农杆菌浸润载体的构建
<ol>
	<li>分别将合成报告基因（绿色荧光蛋白 [GFP]）、来自流感病毒株 A/California/04/2009 的全长血凝素（HA）（HAC1）以及重新设计的地衣酶（LicKM）18 插入启动载体 pBID418（基于烟草花叶病毒的载体）中，获得 pBID4-GFP、pBID4-HAC1 和 pBID4-LicKM 分别对应18,32,41,47。</li>
	<li>将 10–50 ng 携带 GFP 或 HAC1 的 pBID4 载体导入农杆菌 A. tumefaciens 菌株 GV3101 的电感受态细胞中，将 LicKM 导入农杆菌 A. tumefaciens 菌株 GV3101、C58C1、GLA4404、At06、At10、At77 和 A4 的电感受态细胞中，使用基因 MicroPulser 电穿孔仪完成转化。</li>
	<li>除非另有说明，使用转化后的 Agrobacteria 进行侵染实验。</li>
</ol>
3. 真空浸润 农杆菌 进入 烟草属 植物
<ol>
	<li>培养 A. tumefaciens 在LB培养基、YEB培养基或AB培养基中加入50 mg/L卡那霉素，于28 °C、200-250 rpm振荡条件下过夜培养菌株。</li>
	<li>稀释 农杆菌 在600 nm处的光密度（A）用Milli-Q水将溶液调至6000.5 的光密度或离心 农杆菌 在LB、YEB或AB培养基中培养的细胞，4,000 × 4 °C下离心10 min，弃上清，用诱导培养基（1× MS盐，10 mM MES，200 µM乙酰丁香酮，2%蔗糖 [MMA]）重悬至A600 0.5，并在室温下搅拌1-3小时，除非另有说明。</li>
	<li>在真空室中通过浸没法渗透植物 烟草属 植物地上组织 农杆菌 悬浮并施加50-400 mbar的真空压力，持续30或60秒。通常在50-100 mbar压力下持续60秒以实现最佳渗透效果。</li>
	<li>真空解除后，将植物从真空室中取出，用水冲洗，并在与浸润前相同的生长条件下培养5-7天。</li>
	<li>测试诱导化学物质的功效 农杆菌 vir基因，添加不同浓度的乙酰丁香酮（0、100、200 或 400 µM）至 农杆菌 悬浮于侵染缓冲液（1x MS、10 mM MES、2% 葡萄糖）中。为考察单糖对vir基因诱导的影响，向缓冲液中分别添加不同浓度的葡萄糖（0、1、2 或 4%）。 农杆菌 悬浮于侵染缓冲液（1x MS，10 mM MES，200 µM 乙酰丁香酮）中。 N. benthamiana 植物按上述步骤3.3和3.4进行侵染。</li>
	<li>农杆菌 实验室菌株GV3101、C58C1和LBA4404，以及携带pBID4-LicKM载体的野生型菌株A4、At06、At10和At77，用Milli-Q水稀释至A600 0.5。 N. benthamiana 按照上述步骤3.3和3.4，用每种特定菌株对植物进行侵染。</li>
</ol>
4. 病毒沉默抑制子的共农杆菌渗透实验步骤
<ol>
	<li>按 1:1、2:1、3:1 和 4:1 的比例混合携带 GFP 基因的 Milli-Q 水稀释的 Agrobacterium GV3101 菌液与携带番茄丛矮病毒（Tomato bushy stunt virus，TBSV）的病毒沉默抑制子 p19 的菌液。按上文所述方法侵染 N. benthamiana 植株。</li>
	<li>将两种经 Milli-Q 水稀释的 Agrobacterium GV3101 菌液混合后侵染 N. benthamiana 植株：第一种携带 pBID4-HAC1 质粒，第二种携带任一沉默抑制子——TBSV 的 p19 或柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus）的 p23，分别位于 pCassp 质粒（pCassp19）和 pGR 双元质粒的 35S 启动子下游（pGR-P23），混合比例为 4:1。</li>
</ol>
5. 蛋白质印迹分析
<ol>
	<li>从植株上随机采集叶片样本 N. benthamiana，N. excelsior 或 N. excelsiana 在接种后4-7天采集植株，于液氮中研磨成细粉。</li>
	<li>向每个样本中加入三倍体积的含0.5% Triton X-100的1×PBS缓冲液。</li>
	<li>在 4 °C 条件下轻轻振荡提取的样品 15 分钟。</li>
	<li>离心提取物5分钟，收集总可溶性蛋白至新的离心管中。</li>
	<li>将提取物用1× PBS提取缓冲液稀释至适当浓度（1:50 至 1:100），并加入5×上样缓冲液（250 mM Tris-HCl [pH 6.8]、10% SDS、0.5%溴酚蓝、50%甘油 v/v 和 500 mM DTT），使终浓度为1×。</li>
	<li>将样品煮沸5分钟。</li>
	<li>使用10% SDS-PAGE分离蛋白质，转移至Immobilon-P转印膜，并用0.5% I-block封闭。</li>
	<li>使用兔多克隆抗GFP抗血清（1:5,000）和小鼠抗多聚组氨酸单克隆抗体（1:1,000）在封闭液中孵育1小时，以检测GFP和HAC1。</li>
	<li>一抗孵育后，用1× PBST-20洗涤膜三次，每次10分钟，随后分别加入1:5,000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记抗兔抗体（用于GFP检测）或1:10,000稀释的HRP标记抗小鼠抗体（用于HAC1检测），室温孵育1小时。</li>
	<li>使用 SuperSignal West Pico 化学发光底物处理 Western 印迹。</li>
	<li>使用 GeneTools 软件分析蛋白条带强度，并获得条带校准定量结果。</li>
</ol>
蛋白质产量计算公式：（校准量 × 样品稀释倍数）/ 上样量）× 4 = mg/kg。 
公式说明：蛋白质产量（P），校准量（C），样品稀释倍数（D），上样量（S）。

6. 酶谱分析
<ol>
	<li>采集经 pBID4-LicKM 浸润的 N. benthamiana 随机组织样本。</li>
	<li>采用上述用于 Western blot 分析的相同方法提取蛋白质，然后通过含有 0.1% 地衣多糖的 10% SDS-PAGE 进行分析。</li>
	<li>电泳结束后，用洗涤缓冲液（100 mM Tris-HCl [pH 8.0] 和 0.1% Triton X-100）洗涤凝胶两次，每次 10 分钟，随后在 65 °C 的洗涤缓冲液中孵育 1 小时。</li>
	<li>孵育后，弃去洗涤缓冲液，在室温下用 0.5% 刚果红染色 5 分钟。</li>
	<li>用 Milli-Q 水冲洗凝胶三次，每次 10 分钟，然后加入 1 M NaCl 以显色地衣酶活性。纯化的细菌地衣酶蛋白作为酶活性的阳性对照。</li>
</ol>
7. GFP 成像
<ol>
	<li>使用手持式长波长紫外灯对瞬时转化的完整植株进行GFP荧光的目视检测。</li>
	<li>通过Yellow 8, ES 52滤光片，用数码相机拍摄瞬时转化植株的图像（曝光时间15秒）。</li>
	<li>使用GeneGnome设备上的GeneSnap软件获取Western印迹分析图像，并利用GeneTools软件进行结果定量，定量依据为纯化的GFP标准品绘制的校准曲线。</li>
	<li>使用基于流感病毒A/Indonesia/05/05株纯化HAC蛋白标准品绘制的校准曲线，对HAC1蛋白进行定量。</li>
	<li>所有实验均基于3–4个重复样本计算平均值。</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

本研究中，我们建立了一种简单的农杆菌浸润法，用于在选定的Nicotiana物种中利用携带启动载体的Agrobacterium菌株进行常规瞬时蛋白表达。此外，我们还确定了在该瞬时植物表达系统中实现最高重组蛋白表达水平的最佳条件。
稀释液的真空浸润 A. 根癌农杆菌 含有启动载体 pBID4 的菌株 GV3101 N. benthamiana, N. excelsiana 和 N. 卓越 在7 dpi时，与其他植物物种相比，导致了更高的靶蛋白产量 Pisum sativum 浸润含有GV3101的菌液 苜蓿花叶病毒- 或 黄瓜花叶病毒基于35S启动子驱动GFP报告基因表达的载体41，或 &#160;Lactuca sativa, Solanum lycopersicum 和 拟南芥 thaliana 用C58C1菌株侵染 A. tumefaciens 携带β-葡萄糖醛酸酶报告基因57. N. benthamiana 和 N. excelsiana 在50 mbar下真空浸润30-60秒易于操作，浸润效率达到90-95%。剩余5-10%的叶片区域未被浸润，原因是部分叶片在溶液表面漂浮所致 农杆菌 抽真空过程中保持悬浮状态。由于该载体具有细胞间移动的能力18，7 dpi时，整个叶片及叶柄中均出现瞬时蛋白积累。10 dpi时，GFP的表达量略有降低，因为pBID4表达载体可在细胞间移动，但不能进行系统性移动。18；因此，新长出的叶片不含载体，不参与目标蛋白的生产。此外，重组蛋白随时间的降解也可能导致10天时蛋白水平下降。我们的结果表明，农杆菌侵染 A. tumefaciens 菌株GV3101介导的瞬时蛋白高水平表达 N. benthamiana此外，目标蛋白可被设计为与地衣酶（LicKM）、β-1,3-1,4-葡聚糖酶（一种来源于嗜热菌的耐热酶）进行N端、C端或内部融合。 Clostridium thermocellum 并赋予许多目标蛋白融合体热稳定性18浸润 N. benthamiana 与 A. tumefaciens 野生型菌株（at6、at10 和 at77）携带目的基因后表现出轻度或重度症状：叶片卷曲、叶柄伸长和卷曲。在未观察到任何病理症状的 N. benthamiana 用含有空pBID4载体的实验室菌株GV3101进行浸润，而将某些基因插入pBID4并转化至实验室菌株GV3101、C58C1或LBA4404后，在叶片浸润区域引发轻微的坏死反应及叶片失绿/黄化症状。由野生型引起的坏死症状 农杆菌 或在茄科植物中报道过无毒菌株56,57坏死反应可能是由III型分泌系统的毒力因子、通过IV型分泌系统转移至植物细胞的细菌蛋白和/或对鞭毛蛋白的敏感性所导致58-60我们发现，异源蛋白的瞬时表达也可能引发侵染植物叶片的致病性及过敏反应。许多研究人员报道，利用农杆菌浸润法将不同植物物种与植物双元载体共培养，其瞬时蛋白表达水平可比稳定转化植株高出5至20倍。28,57我们的数据显示 N. benthamiana 用携带pBID4-GFP的GV3101侵染后瞬时表达高水平GFP，其GFP产量与报道的相似 N. benthamiana 浸润 农杆菌 携带pICH-GFPSYS病毒载体（占总可溶性蛋白的80%）44农杆菌浸润法使用我们的启动载体后，热稳定蛋白LicKM的产量显著提高，比使用标准双元质粒时高出50倍18.
为了检测根癌农杆菌（A. tumefaciens）的侵染能力以及启动载体的稳定性，我们使用含有pBID4-GFP质粒的GV3101菌株培养液（以Milli-Q水稀释）对每小时接种一盘的N. benthamiana进行浸润，持续长达8小时&#160;。实验结果表明，GV3101菌株在至少8小时内均具有高效的侵染能力，且pBID4（启动载体）在长达8小时的浸润过程中非常稳定。
在-80 °C保存的含有pBID4-HAC1启动载体的GV3101菌株甘油菌种（细胞库）已证明在三年内非常稳定，且在浸润植物中的瞬时蛋白表达未发生改变。&#160;
在适宜条件下生长且播种后35至42天的N. benthamiana植株，最适合用于真空浸润介导的瞬时基因表达40。较年轻的植株（3–4周龄）由于叶片会漂浮在细胞悬浮液表面，且在施加真空时易受机械损伤，因此无法完全浸润。而在超过45天的植株中，N. benthamiana已进入抽薹期，在所采用的最适光照条件下，瞬时表达水平较低。
已知低分子量酚类化合物（乙酰丁香酮）和单糖（葡萄糖）能够诱导根癌农杆菌（A. tumefaciens）中的vir基因55,61。此外，有研究表明，在50–600 µM浓度的乙酰丁香酮存在下，将含有双元载体pCAMBIA(gfp)的农杆菌渗入本氏烟（N. benthamiana）叶片，可轻微提高瞬时基因表达水平40。在本研究中，我们通过在MMA培养基中向携带pBID4-GFP质粒的GV3101菌液添加不同浓度的乙酰丁香酮和葡萄糖，处理3小时，考察了这些化合物在本系统中的作用，结果发现GFP表达水平无显著差异。有趣的是，将携带pBID4-GFP质粒的GV3101菌液用超纯水稀释至A600为0.5后直接进行渗入，即使未进行vir基因诱导，其GFP表达量与经诱导处理的菌液渗入后相当。根癌农杆菌的vir基因可能被植物组织中存在的酚类化合物（如乙酰丁香酮和芥子酸）以及植物单糖（如葡萄糖和果糖）所诱导。因此，我们推测，在外源vir基因诱导剂存在或缺失的情况下GFP表达水平相似，可能是由于在植物细胞内GFP表达启动载体复制过程中，胞质中存在的内源vir基因诱导物质发挥了作用所致。
野生型 N. benthamiana 已被用作瞬时蛋白表达的模式宿主49。然而， N. benthamiana其相对较低的生物量产量限制了其在重组蛋白大规模生产中的应用。理想的宿主应兼具高水平的瞬时表达、温室中易于培养以及对...的易感性 农杆菌 浸润2. 为选择替代宿主，我们侵染了两种不同的野生型物种 烟草属 (N. benthamiana 和 N. excelsior以及一种杂交 N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior）与 A. tumefaciens 菌株GV3101携带pBID4-GFP质粒。在这三种物种中，GFP表达水平略高 N. benthamiana. N. excelsior 由于叶片革质化，植物在真空农杆菌浸润过程中表现出困难，且 N. excelsiana 在相同生长条件下，其生物量大约高出两倍。在接种后7天（7 dpi）时，GFP的瞬时表达水平相对相似。 N. benthamiana 和 N. excelsiana因此， N. excelsiana 可能是更适合重组蛋白生产的宿主。
农杆菌介导的瞬时蛋白表达受转录后基因沉默（PTGS）限制26，可通过共表达植物病毒来源的基因沉默抑制因子来克服62瞬时蛋白表达在存在TBSV的p19蛋白时可提高50倍，该蛋白可抑制浸润组织中的转录后基因沉默（PTGS）34在本研究中，我们分别评估了两种病毒沉默抑制子（p19 和 p23）与启动载体 pBID4-HAC1 共同浸润对瞬时表达的影响。结果表明，共浸润这些沉默抑制子对 HAC1 的瞬时表达影响较小，仅在共浸润 p23 或 p19 时观察到 HAC1 蛋白积累量略有增加（15–25%）。为有效提高蛋白产量，可能需要针对目标植物物种和病毒载体特异性地选择沉默抑制子。63TMV解旋酶具有RNA沉默抑制活性64,65我们的数据证实了这一观察结果，将p23或p19与pBID4-HAC1共浸润并未导致GFP表达增加，或仅引起瞬时HAC1蛋白产生的轻微增加。
综上所述，我们改进并优化了植物和Agrobacterium的生长条件，提高了真空浸润的效率。该技术使我们能够在数小时内种植并浸润数百千克的植物材料。我们成功实现了植物瞬时表达技术的自动化，可在现行药品生产质量管理规范（cGMP）条件下，以工业规模进行高通量疫苗生产。有关在cGMP条件下自动化及利用植物瞬时蛋白表达系统生产重组蛋白（包括亚单位疫苗候选物）的更多信息，读者可访问网站 <a href="http://fhcmb.org/">www.fhcmb.org/</a>。

目前，植物已被公认为是一种安全、可靠、可扩展且成本低廉的异源重组生物制药和工业蛋白生产平台1-3，相较于微生物和动物细胞表达系统具有重要优势4。植物能够表达正确折叠的蛋白质，并进行翻译后修饰，包括组装成多聚体的抗体5-7。多种来源于植物的重组药用蛋白正在接受临床评估8。这些蛋白包括用于治疗非霍奇金淋巴瘤的患者特异性重组独特型疫苗（scFv）9、基于血凝素的流感大流行及季节性流感候选疫苗10,11（Cummings et al.，已提交至Vaccine），用于治疗龋齿的抗链球菌表面抗原I/II抗体12，以及用于治疗糖尿病的人胰岛素13。此外，用于戈谢病患者酶替代疗法的人重组葡萄糖脑苷脂酶已在以色列和美国获批，并通过扩展使用计划在美国以外地区提供14,15。
异源蛋白可以在稳定转化（转基因或质体转化）或瞬时转化的植物中进行生产。与在转基因植物中生产相比，瞬时蛋白表达具有多项优势，包括实现表达和积累所需时间较短16，并且可通过将细菌双元载体或重组植物病毒载体导入植物组织来实现4。目前最先进的瞬时表达系统基于“启动载体”的使用，该载体结合了植物病毒和双元质粒的元件，并通过农杆菌浸润法递送17,18。基于烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）的启动载体经农杆菌浸润后，已在实验室规模成功用于在N. benthamiana叶片中生产针对多种病原体的疫苗抗原，如人乳头瘤病毒19、Yersinia pestis20、甲型流感病毒21,22、Bacillus anthracis23以及天花病毒24。Agrobacterium介导的瞬时表达也是同时生产多种蛋白的一种有前景的方法2,25-27。例如，植物瞬时表达系统已被用于生产肿瘤特异性重组抗体28,29、针对表皮生长因子受体的糖基化重组抗体30，以及特异性识别炭疽保护性抗原的单克隆抗体31,32。将目标基因与基因沉默抑制子共同浸润入Nicotiana benthamiana植物，可显著增强目标蛋白的表达水平33,34。
农杆菌浸润是一种将含有目的基因的细菌均匀导入植物组织的常用方法35-37. 真空浸润 农杆菌 在完整植物叶片中进行瞬时基因表达是生产外源蛋白的一种快速、可扩展且实用的方法，无需创制转基因植物38-41在真空农杆菌浸润过程中，将植物倒置，使地上部分浸入 农杆菌 悬浮液。随后施加真空，使气体通过气孔从叶片的细胞间隙中排出。释放真空后迅速重新加压，导致液体浸入叶片细胞间隙。 农杆菌 将悬浮液注入叶片。在真空渗透后 农杆菌，之后继续培养植株并监测目标蛋白的表达。使用双元载体时，目标蛋白表达水平通常在侵染后2-3天达到最高；使用启动载体时，则在侵染后4-7天达到峰值，随后表达水平通常逐渐下降17,18,42-45. 根癌农杆菌 是将目的基因导入植物以进行蛋白生产的最常用载体。农杆菌浸润法在植物中效果极佳。 N. benthamiana 但在包括大多数其他植物中则相对较差， 拟南芥46.
在本研究中，我们建立了一种简单、高效且经济的瞬时蛋白表达方法，适用于5–6周龄 N. benthamiana 使用 A. tumefaciens 浸润。农杆菌浸润技术在工业化放大的主要缺点是需要对收获的细菌进行离心，并将细菌沉淀重悬于含有4'-羟基-3',5'-二甲氧基苯乙酮（乙酰丁香酮）、单糖以及2-(N-吗啉代）乙磺酸（MES）缓冲液用于诱导 病毒 基因。我们通过优化已能够克服这些问题 农杆菌 在AB培养基（最小培养基）中培养后，直接用Milli-Q水稀释，并控制侵染时长和条件。我们还比较了在野生型烟草宿主物种中目标蛋白的表达水平 N. benthamiana 和 N. excelsior，以及在杂交种中 N. excelsiana.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Nicotiana benthamiana&lt;/em&gt;</td><td>烟草种质资源库，北卡罗来纳州立大学作物科学系</td><td>PI 555478 TW16</td><td>浸润</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Nicotiana excelsior&lt;/em&gt;</td><td>烟草种质资源库，北卡罗来纳州立大学作物科学系</td><td>PI 555685 TW47</td><td>浸润</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Nicotiana excelsiana&lt;/em&gt;</td><td>Dr. Wayne Fitzmaurice，Large Scale Biology Corporation，Vacaville，CA</td><td>LSBC EBA 042304.02</td><td>浸润</td></tr><tr><td>真空撬装装置</td><td>Abbas，阿什兰，马萨诸塞州</td><td>定制</td><td>植物浸润</td></tr><tr><td>岩棉</td><td>Grodan 公司，安大略省，加拿大</td><td>AO 50/40</td><td>用于植物栽培的水培介质</td></tr><tr><td>2-(&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-吗啉代）乙磺酸</td><td>Acros Organics，Thermo Fisher Scientific，新泽西州</td><td>172595000</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>穆拉希格 &amp;amp; 斯科格盐（MS盐）</td><td>植物技术实验室</td><td>M524</td><td>组织培养基</td></tr><tr><td>乙酰丁香酮</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>D134406-5G</td><td>农杆菌诱导</td></tr><tr><td>Immobilon-P 转印膜</td><td>Millipore，Billerica，MA</td><td>IPVH00010</td><td>蛋白质印迹法</td></tr><tr><td>I型阻断剂</td><td>应用生物系统公司，加利福尼亚州福斯特城，CA</td><td>T2015</td><td>蛋白质印迹法</td></tr><tr><td>兔多克隆抗GFP抗血清&amp;nbsp;</td><td>华盛顿生物技术公司，马里兰州巴尔的摩市</td><td></td><td>蛋白质印迹法</td></tr><tr><td>小鼠抗&amp;ndash;多聚组氨酸单克隆抗体</td><td>Qiagen GmbH, Hilden</td><td>34670</td><td>蛋白质印迹法</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的抗兔抗体&amp;nbsp;</td><td>杰克逊免疫研究实验室，宾夕法尼亚州韦斯特格罗夫</td><td>111-035-003</td><td>蛋白质印迹法</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的抗小鼠抗体</td><td>杰克逊免疫研究实验室，韦斯特格罗夫，宾夕法尼亚州</td><td>115-035-003</td><td>蛋白质印迹法</td></tr><tr><td>SuperSignal&amp;reg; West Pico 化学发光底物</td><td>Thermo Scientific Pierce，罗克福德，伊利诺伊州</td><td>34078</td><td>蛋白质印迹法</td></tr><tr><td>地衣聚糖（1-3:1-4-β-D-葡聚糖）</td><td>Megazyme，爱尔兰威克洛郡布雷</td><td>P-LICHN</td><td>地衣酶活性</td></tr><tr><td>刚果红&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯</td><td>C6277</td><td>凝胶染色</td></tr><tr><td>数码相机&amp;nbsp;</td><td>奥林巴斯，美国宾夕法尼亚州森特瓦利</td><td>C-8080</td><td>化学发光成像</td></tr><tr><td>GeneGnome</td><td>Syngene, Frederick, 医学博士</td><td></td><td>化学发光成像&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>GFP 标准品&amp;nbsp;</td><td>自制</td><td></td><td>化学发光成像&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>植物肥料溶液</td><td>Griffin Greenhouse Nursery Supplies，纽瓦克，DE</td><td>67-23-20</td><td>植物培养</td></tr><tr><td>地衣酶标准品</td><td>纯化于本实验室</td><td></td><td>蛋白质印迹法</td></tr><tr><td>MicroPulser 电穿孔仪</td><td>BioRad，Hercules，CA</td><td>165-2100</td><td>农杆菌转化&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

农杆菌介导的烟草属植物瞬时蛋白表达的优化与应用

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

农杆菌介导的植物瞬时蛋白表达是一种在短时间内生产疫苗抗原和治疗性蛋白的有前景的方法。然而，该技术目前才刚开始应用于大规模生产，因为许多制约放大的技术障碍正在被逐步克服。本文展示了一种基于真空浸润的、适用于工业化规模的瞬时蛋白生产的简单且可重复的方法。 烟草属 植物与 农杆菌 携带载体的优化。 农杆菌 在AB培养基中培养可直接用Milli-Q水稀释细菌培养物，从而简化浸润过程。在三种测试的物种中 烟草属, N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior)被选为最有前景的宿主，因其易于侵染、报告蛋白产量高，且在受控环境条件下生物量产量高出约两倍。诱导 农杆菌 携带 pBID4-GFP（烟草花叶病毒基于化学物质（如乙酰丁香酮和单糖）的处理对蛋白质生产水平没有影响。在50至100 mbar压力下对植物进行30或60秒的浸润，可实现约95%的植物叶片组织浸润。浸润时采用 农杆菌 实验室菌株GV3101的蛋白产量相较于其他菌株最高 农杆菌 实验室菌株LBA4404和C58C1及野生型 农杆菌 菌株 at6、at10、at77 和 A4。共表达病毒RNA沉默抑制子 p23 或 p19，在 N. benthamiana 导致目标蛋白（流感病毒血凝素）更早积累并增加产量（15–25%）。

瞬时蛋白表达在 烟草属 基于真空渗透的植物 农杆菌 携带的启动载体（烟草花叶病毒基于瞬时表达系统的方法是一种快速且经济的疫苗抗原和治疗性蛋白生产途径。我们通过优化细菌培养条件、选择适宜的宿主物种以及共导入RNA沉默抑制子，简化了操作流程并提高了目标蛋白的积累量。

农杆菌介导的植物瞬时蛋白表达是短期内生产疫苗抗原和治疗性蛋白的一种有前景的方法……

本实验的总体目标是建立一种简单、高效且可放大的基于植物系统的瞬时重组蛋白生产方法，该方法采用农杆菌浸润技术。首先通过优化植物生长条件来实现这一目标；第二步是用包含植物病毒组分和双元质粒的“启动载体”转化农杆菌，随后培养转化后的农杆菌用于农杆菌浸润实验。在农杆菌浸润过程中，将植物倒置，使其地上部分浸入农杆菌悬浮液中。随后施加真空，使叶片组织的细胞间隙中的空气被抽出。通过快速释放真空后的迅速重新加压，导致农杆菌悬浮液注入叶片内部。最终，通过免疫印迹和荧光检测来验证在浸润植物中重组蛋白的表达。与现有的手工浸润等方法相比，该技术的主要优势在于真空浸润法可放大用于重组蛋白的工业化生产，包括疫苗和治疗性蛋白。该方法有助于解答植物生物技术领域的关键问题，并进一步推动植物作为商业化重组蛋白生产替代平台的应用。当我们发现将农杆菌过滤法扩大应用于土壤种植植物时存在困难，便首次提出了这一方法。原因有多个：土壤中含有多种污染物，如病毒、细菌、线虫等；此外，土壤成分和灌溉水的性质会因批次和季节而变化，且土壤在储存过程中会随时间老化。另外，在对土壤种植的植物进行翻转时，会导致土壤滴入农杆菌培养物中，从而在渗透过程中造成不必要的污染。本次实验操作由植物生物学与工程实验室的高级研究助理Rebecca Snow，以及Emma Gut Robin Lobe进行演示。她和来自我实验室的研究助理Adam Trevor共同完成本研究。本研究采用水培植物生长介质和营养液，以确保植物生长的一致性，并消除使用土壤进行植物培养时可能带来的复杂因素。开始此实验步骤时，将岩棉板浸泡在植物营养液中5分钟，然后将种子手动播种到已吸收营养液的岩棉表面。本研究将评估三种 Cedar three Nico Oceana 物种：两种野生型物种，分别为 Nico Oceana Benham Ana 和 Nico Oceana Excelsior，以及由 Benham Ana 与 Excelsior 杂交而成的杂交种 Nico Oceana Excela。在受控环境和长日照光周期条件下，利用水培级联系统培育这些种子生长成植株。Nico Oceana、Bentham Miana 和 Nico Oceana Excela 培养四到五周，Nico Oceana Excelsior 培养五到六周。本实验所用的农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株已如随附文稿所述，转化了相应的启动载体。本演示实验中使用了五种转化后的农杆菌菌株。GV3101，携带报告基因绿色荧光蛋白（GFP）；GV3101，携带番茄丛矮病毒（tomato bushy stunt virus）沉默抑制子P19的病毒基因；以及四个GV3101菌株，分别携带编码修饰型连接酶（liase）或Lick KM的载体蛋白基因。在LB培养基中于28°C、200至250 rpm振荡条件下，加入50毫克/升卡那霉素，过夜培养农杆菌菌株。次日，为开展所需实验制备农杆菌悬浮液，以评估利用多种农杆菌菌株进行瞬时蛋白表达的可行性。将一株实验室菌株和两株野生型菌株（均含有PBI4 Lick KM载体）用超纯水稀释，使600纳米处的光密度（OD600）达到0.5。为研究在侵染前诱导农杆菌毒力基因的必要性，首先将携带P bid 4G FP载体并在LB培养基中培养的农杆菌菌液于4,000 × g、4°C条件下离心10分钟。随后重悬于MMA诱导培养基中，使在600纳米处的光密度值达到0.5，并在室温下搅拌2小时。为检测乙酰丁香酮是否增强瞬时蛋白表达，将过夜培养于LB培养基中的携带PBI 4G FP载体的农杆菌菌液离心，并重悬于浸润缓冲液中，该缓冲液包含1× MS盐、10毫摩尔MES和2%葡萄糖。将细胞悬浮液分装至四个容器中。向每种农杆菌悬浮液中加入不同浓度的乙酰丁香酮，并在室温下孵育三小时。为检测病毒沉默抑制因子共浸润对瞬时表达GFP蛋白产量的影响，进行混合。将携带GFP基因的农杆菌培养物与携带病毒沉默抑制子P19的培养物按四比一的比例用milli Q水稀释，在接下来将演示的植物真空浸润过程中，控制真空压力以及浸润时间至关重要。首先，将制备好的农杆菌悬浮液转移至真空室内的容器中。然后将植物倒置放入稀释的农杆菌溶液中，施加50至400毫巴的真空压力，持续30或60秒。通常最佳的浸润条件为50至100毫巴，持续60秒。真空解除后，将植物从真空室中取出，用水冲洗，并在与过滤前生长相同的培养条件下培养5至7天。为进行 Western 杂交分析，首先在侵染后 4 至 7 天（DPI）随机采集 Nico Oceana、Benham Miana、Nico Oceana Excelsior 或 Nico Oceana Excela 植物的叶片样品，将叶片样品在液氮中研磨成细粉。向每个样品中加入三倍体积含 0.5% Triton X-100 的 1× PBS 缓冲液，并将样品转移至 eppendorf 管中。在 4°C 下轻轻振荡或旋转提取样品 15 分钟。将提取物离心五分钟，收集总可溶性蛋白至洁净的离心管中。用1× PBS提取缓冲液将提取物稀释至适当浓度，并加入5×上样缓冲液，使终浓度为1×。在进行SDS-PAGE分离蛋白前，将样品煮沸五分钟。将蛋白质转移至不移动的P转移膜后，使用兔多克隆抗GFP抗血清以1:5,000的稀释比例在封闭液中孵育以检测GFP。室温下轻轻摇动孵育一小时，随后用1×PBST-20洗涤膜三次。再与辣根过氧化物酶标记的抗兔抗体以1:5,000的稀释比例孵育一小时，用于GFP检测。随后，按照随附稿件中所述方法对蛋白质印迹进行处理，并分析对应于蛋白质的条带强度。使用手持式长波长紫外灯观察瞬时转化植株整体的GFP荧光信号，并通过黄色八ES 52滤光片，采用数码相机以15秒曝光时间拍摄瞬时转化植株的图像。使用基因扫描软件在基因组成像系统上获取蛋白质印迹分析的图像。使用基因分析软件，基于纯化的GFP标准品绘制的校准曲线对结果进行定量分析。将Nico Oceana Bentham Miana种植于浸泡过市售肥料的Rockwell平板上，以确定植物生长和生物量积累的最佳条件。磷元素的存在对于NICO Oceana Bentham种子的萌发和生长至关重要，如图中六周龄植株所示：分别在含4.8%磷的肥料溶液和不含磷（0%磷）的肥料溶液中生长的植株表现出显著差异。通过比较农杆菌在不同培养基中生长及其浸润介质对烟草植物健康和蛋白质表达的影响，检测了绿色荧光蛋白（GFP）的表达水平。将携带PBI 4G FP质粒的农杆菌在三种不同培养基中培养后，对烟草植株进行真空浸润。在YEB或LB培养基中过夜培养的农杆菌经低速离心后重悬于MMA诱导培养基中，或在YEB、LB或AB培养基中过夜培养后直接用Milli-Q水按1:5或1:10比例稀释，如本蛋白免疫印迹结果所示，用在YEB、LB或AB培养基中培养并以Milli-Q水稀释的农杆菌浸润的植株，其平均GFP表达水平与经离心后重悬于MMA培养基的处理组相比无显著差异。因此，建议使用超纯水（milli Q water）稀释农杆菌培养物用于植物浸润，并在后续实验中常规使用该水配制，以达到600纳米波长下0.5的光密度值。接下来，考察了农杆菌细胞悬浮液浓度及时间进程对目标蛋白表达的影响。评估了携带PBI 4G FP的农杆菌四种不同的细胞悬浮浓度，并在浸润后4天、7天和10天（DPI）采集叶片样品，用于蛋白印迹分析。在浸润后第4天，用不同浓度农杆菌悬浮液浸润的植株之间，GFP荧光存在明显差异；在光密度600为0.05时，未观察到GFP表达。在细胞悬浮液浓度为601.0、0.5和0.1时浸润的植株中，荧光强度相似，但在10天接种后（10 DPI），以A600为0.05浓度浸润的植株中荧光强度较低。在用四种不同细胞悬浮液密度浸润的植株中，GFP的表达水平未观察到差异，该实验旨在增加可用于瞬时蛋白表达的农杆菌菌株多样性。将携带载体 KBI four lick km 的七种不同农杆菌菌株用于真空浸润 Nicotiana Benham miana 植物。在接种后第七天采集浸润的叶片，通过蛋白质印迹法检测激酶表达水平。如本图所示，菌株 GV 3 1 10、1 A four 和 LBA 4 4 0 4 所产生的裂解酶水平最高，三者之间差异较小。尽管C58C1菌株的表达水平最低，但A T 77、A T 06和A T 10菌株均实现了中等程度的裂解酶生产。通过XMO Graham法检测证实了裂解酶的酶活性。纯化的细菌裂解酶蛋白被用作酶活性的阳性对照。值得注意的是，在接种野生型农杆菌A4和A T 77的本氏烟（Nicotiana benthamiana）植株中，于接种后第7天观察到生长受阻、叶柄伸长与卷曲以及叶片卷曲等病理症状。在接种野生型T10菌株的本氏烟（nicotiana benham）植株中，症状较轻。在接种实验室菌株GV3101的Nico Oceana Benham植株中未观察到任何症状。对野生型植株生物量生产的比较显示，在相同生长条件下，Nico Oceana Excela所产生的最高叶片生物量约为Nico Oceana的两倍。通过农杆菌菌株GV3101（携带PBI4G F-P-G-F-P）浸润，检测了Nico Oceana Benham、Nico Oceana Excelsior和Nico Oceana Excela中的蛋白表达水平。在浸润后第七天（7 DPI），对整片浸润叶片中的GFP积累情况进行评估。在紫外光下对GFP表达进行肉眼观察，结果显示Nico Oceana Hamana和Nico Oceana Excela中GFP分布均匀，而Nico Oceana Excelsior中分布不均，这归因于难以完全浸润Nico Oceana Excelsior的整个叶片区域。在浸润后第七天对这些叶片进行GFP积累的蛋白质印迹（Western blot）分析，结果表明，Nico Oceana Hamana中的GFP水平高于Nico Oceana Excela和Nico Oceana Excelsior，表明Nico Oceana中蛋白生产的水平较低。Excelsior 的产生是由于在采集的叶片中GFP渗透不均匀以及积累分布不均所致。为了测试真空压力对叶片的影响，将携带PBI 4G FP的农杆菌菌株GV 3101在400、200、100或50毫巴的真空压力下，对Nico Oceana Benham植株进行渗透处理，真空维持时间为30秒或60秒。当使用5、100和200毫巴的真空压力处理30秒或60秒时，GFP的表达量未见差异，且对植株健康的影响轻微或无不利影响。通过每小时接种一盘Nico Oceana Benham植物，使用携带PBI 4G FP的GV 3101农杆菌（A600为0.5）进行真空渗透，持续八小时，以评估真空处理时间对目标蛋白表达的影响。在本代表性实验结果所示的同一农杆菌培养物中，长达八小时内的各个时间点绿色荧光蛋白（GFP）的产量均相似，表明在此时间段内农杆菌保持了其释放单链DNA的能力。由于已有多种化学物质和单糖被报道可增强不同植物物种中的瞬时蛋白表达。本研究还评估了乙酰苯（acetophenone）、孕酮（crinone）和葡萄糖在不同浓度下对农杆菌菌株GV3101（携带PBI4GFP质粒）浸润的本氏烟（Nicotiana occidentalis Benham）中瞬时GFP蛋白表达的影响。农杆菌在YEB培养基中过夜培养后，经离心并重悬于MMA培养基中，使A600值达到0.5；重悬液中或含有2%葡萄糖及指定浓度的乙酰苯，或含有200微摩尔乙酰苯及指定浓度的葡萄糖。如图所示，与对照组（诱导培养基中不含乙酰苯或葡萄糖）相比，这些化合物的任一测试浓度均未引起GFP蛋白表达的显著增加。接下来，研究了共浸润沉默抑制因子对农杆菌介导的GFP和HAC1基因在本氏烟（Nicotiana benthamiana）叶片中瞬时表达的影响。含有PBI14GFP载体和番茄丛矮病毒（tomato bushy stunt virus）的病毒沉默抑制因子P19的农杆菌GV3101菌株，分别按1:1、2:1、3:1和4:1的比例混合。如接种后7天（7 DPI）的Western blot分析结果所示，在任何两种农杆菌悬浮液比例下，P19的存在均未增加或减少本氏烟中GFP的表达量。此外，研究了两种病毒基因沉默抑制子P 23和P 19对HAC one转录后基因沉默的抑制作用。将携带启动载体PBI four HAC one以及两种病毒沉默抑制子质粒之一的农杆菌POS，按4:1的比例混合后共浸润入本氏烟（Nicotiana Benthamiana）中。在浸润后3至8天采集叶片样品。该图显示了通过蛋白质印迹分析测定的三次实验中HAC1表达的平均水平。与在60 pi时不使用任何沉默抑制子相比，将Nicotiana benthamiana与P23或P19共浸润导致HAC1产量增加。这表明P23和P19在此系统中具有高效性。还观察到，无论是否存在基因沉默抑制子，HAC1蛋白的表达水平均从接种后第7天开始下降。这表明，在瞬时蛋白表达过程中，用启动载体侵染的本氏烟（Nico Oceana Benham Miana）中蛋白产量下降的时间具有靶标特异性。最后，每年通过使用同一批农杆菌细胞库侵染本氏烟（nicotiana benham）植株来评估该农杆菌细胞库的稳定性，以检测蛋白的积累情况。这些代表性结果表明，HA1 蛋白的生产在过去三年多的时间里一直非常稳定。在烟草本氏植物中，HAC1 的平均产量为 651 ± 49.4 毫克/千克。观看本视频后，您应能够充分掌握如何应用农杆菌浸润技术大规模生产重组蛋白，这些蛋白可用于亚单位疫苗、治疗性蛋白抗体以及诊断用抗原的制备。在进行该操作时，重要的是要牢记通过水培法控制植物杂交，使用具有活性的农杆菌，控制真空压力和处理时间，并监测蛋白表达的载体。一旦掌握，若在受控条件下正确操作，农杆菌过滤法可在24小时内完成。

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生物学

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农杆菌介导的烟草属植物瞬时蛋白表达的优化与应用

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