优化和利用农杆菌介导的瞬态蛋白生产中烟草

基于真空浸润土壤杆菌携带发射向量（ 烟草花叶病毒为基础）是一种快速和经济的方法来生产疫苗抗原和治疗性蛋白质的瞬态蛋白生产中烟草属植物。我们简化了程序，并通过优化细菌培养的条件，在选择宿主物种，并同时引入的RNA沉默抑制改善目标的积累。

该程序的总体目标是开发一种简单、高效且可扩展的方法，用于使用农业渗透技术在植物性系统中生产瞬时重组蛋白。这是通过首先优化植物生长条件来实现的。第二步是用结合植物病毒成分和二元质粒成分的启动载体转化农杆菌，然后培养转化的农杆菌用于农用实验。

在农杆菌渗透过程中，植物被倒置，地上部分被浸没在农杆菌悬浮液中。然后施加真空，使空气从叶组织的细胞间隙中排出。通过 St Rapid，在释放真空后再加压导致农杆菌悬浮液注入叶子中。

最终，免疫印迹和荧光测定用于显示浸润植物中的重组蛋白产生。与手动浸润等现有方法相比，该技术的主要优点是真空浸润方法可以扩大用于重组蛋白（包括疫苗和治疗性蛋白质）的工业生产。该方法有助于回答植物生物技术中的关键问题，并进一步促进植物作为商业重组蛋白生产的替代平台。

当我们发现在土壤生长植物中扩大农业过滤规模具有挑战性时，我们第一次有了这种方法的想法。由于多种原因，土壤中含有病毒、细菌、线虫等 uchin，此外，土壤含量和灌溉水量因批次和季节而异，土壤卵会随着时间的推移而储存。此外，土壤生长植物的翻转会导致土壤在渗透过程中不必要地滴入农杆菌培养物中。

来自植物生物学和工程实验室的高级研究助理 Rebecca Snow 和 Emma Gut Robin Lobe 将演示此程序。她、她和 Adam Trevor，他们是我实验室的研究助理。本研究使用水培植物生长培养基和营养液来确保植物生长的均匀性，并消除与使用土壤进行植物种植相关的复杂性。

要开始此过程，请将岩棉板浸泡在植物肥料溶液中 5 分钟，然后手动将种子播种在营养浸湿的岩棉表面上。本研究将使用雪松评估三种 Nico Oceana 物种，两种野生型物种 Nico Oceana、Benham Ana 和 Nico Oceana Excelsior，以及 Benham、Ana 和 Excelsior 的杂交种，名为 Nico Oceana。Excela 在受控条件下从种子中种植植物，并在水培级联系统中进行长时间的照相。

Nico Oceana、Bentham Miana 和 Nico Oceana Excela 为期 4 至 5 周，Nico Oceana Excelsior 为期 5 至 6 周。本实验中使用的农杆菌肿瘤 Fasion 菌株已使用随附的手稿中描述的适当启动载体进行了转化。为了进行本演示，使用了五种转化的农杆菌菌株。

GV 3 1 0 1，携带一个报告绿色荧光蛋白，或 GFP 基因 GV 3 1 0 1，携带番茄浓密特技病毒 P 19 和 A 四个 GV 3 1 0 1 和一个 T 10 的沉默抑制基因。携带载体蛋白修饰的 liase 或 lick KM 的基因在 LB 培养基中培养农杆菌菌株过夜，在 28 摄氏度下补充每升 50 毫克罐头霉素，第二天以 200 至 250 RPM 摇动。为所需实验准备农杆菌悬浮液，以检查使用多种农杆菌菌株生产瞬时蛋白质生产的可行性，稀释一种实验室菌株和两种野生型菌株，在毫 Q 水中含有 PBI 四舔 km 载体，光密度为 600 纳米 0.5。

为了研究在浸润之前诱导农杆菌毒力基因的必要性，首先将携带 P bid 4G FP 载体的农杆菌培养物离心，在 LB 培养基中以 4， 000 倍 G 在 4 摄氏度下生长 10 分钟。然后在 MMA 诱导培养基中重悬至 600 纳米 0.5 的光密度，并在室温下搅拌 2 小时，以测试乙酰锥是否增强瞬时蛋白质生产离心机和农杆菌培养。携带在 LB 培养基中生长过夜的 PBI 4G FP 载体，并在含有 1 X ms 盐、10 毫摩尔盐、MES 和 2% 葡萄糖的浸润缓冲液中重悬。

将细胞悬液分成四个容器。向每个农杆菌悬浮液中加入不同浓度的 aceto 锥体，并在室温下孵育 3 小时。测试病毒沉默抑制因子的共浸润对瞬时 GFP 蛋白生产混合物的影响。

在植物真空渗透过程中，携带 GFP 基因的毫 Q 水稀释的农杆菌培养物和携带病毒沉默抑制因子 P 19 的培养物以四比一的比例进行验证。接下来是控制真空压力和渗透持续时间的关键，以真空渗透植物。首先，将制备好的农杆菌悬浮液转移到真空室内的容器中。

然后将植物倒置在稀释的农杆菌中，并施加 50 至 400 毫巴的真空 30 或 60 秒。最佳浸润通常在 50 至 100 毫巴下应用，持续 60 秒。一旦真空被打破，从真空室中取出植物，用水冲洗，并在用于预过滤生长的相同生长条件下生长 5 到 7 天。

为了准备用于蛋白质分析的样品，首先，在渗透后 4 到 7 天从 Nico Oceana、Benham Miana、Nico Oceana Excelsior 或 Nico Oceana Excela 植物收集随机叶子样品，或者 DPI 在液氮中将叶子样品粉碎成细粉。向每个样品中加入 3 体积的含有 0.5%Triton X 100 的 XPBS 缓冲液，然后将样品转移到 einor 管中。在 4 摄氏度下轻轻摇晃或旋转提取的样品 15 分钟。

将提取物旋转 5 分钟，然后将总可溶性蛋白收集到干净的 einor 管中。在一种 XPBS 提取缓冲液中将提取物稀释至适当的稀释度，并添加 5 x 样品缓冲液至最终 1 X 浓度。将样品煮沸 5 分钟，然后通过 SDS 页面分离蛋白质。

蛋白质转移到固定的 P 转移膜上后，并在封闭溶液中使用稀释度为 1 至 5， 000 的兔多克隆抗 GFP 抗血清检测 GFP。用 1 个 X-P-B-S-T 20 洗涤膜 3 次后，在室温下轻轻摇动孵育 1 小时。与辣根过氧化物酶偶联的抗狂犬病抗体一起孵育，加入 1 至 5， 000 的稀释液，持续 1 小时，用于 GFP 检测。

随后，处理蛋白质印迹并按照随附手稿中的描述分析与蛋白质相对应的条带强度。使用手持式长波长紫外灯完成整个瞬时转化植物中 GFP 荧光的视觉检测，使用数码相机和 15 秒的曝光时间，通过黄色 8 ES 52 滤光片拍摄瞬时转化的植物。使用基因组上的基因捕捉软件从蛋白质印迹分析中获取图像。

使用基因工具软件对结果进行量化，并使用基于纯化 GFP 标准的校准曲线，将 Nick Oceana Bentham Miana 生长在浸泡在市售肥料中的洛氏板上，以确定植物生长和生物量积累的最佳条件。磷的存在对于实现 NICO Oceana 的发芽和生长至关重要。这些六周龄的植物生长在含 4.8% 磷的肥料溶液或含 0% 磷的肥料溶液中的 Bentham 种子。

通过比较烟草中 GFP 的生产，研究了农杆菌生长和渗透介质对植物健康和蛋白质生产的影响。Hamana 植物用 PBI 4G FP 真空渗透，含有在三种不同培养基中生长的农杆菌培养物。在 YEB 或 LB 培养基中生长过夜的 YEB AB 和 LB 培养物以低速离心并重悬于 MMA 诱导培养基中或在 YEB LB 或 AB 培养基中生长过夜，并用 Milli Q 水直接稀释 1 至 5 或 1 至 10，如该蛋白质印迹结果所示，用在 YEB LB 或 AB 培养基中生长并用 Milli Q.Water 稀释的农杆菌培养物浸润的植物显示无显著差异离心并重悬于 MMA 中的培养物的平均 GFP 产量。

因此，建议使用 milli Q 水稀释农杆菌培养物以进行植物渗透，并常规用于后续实验，以达到 600 纳米的光密度为 0.5。接下来，检查农杆菌细胞悬液密度和时间进程对靶标表达的影响。评估了四种不同细胞悬浮密度的携带 PBI 4G FP 的农杆菌，并在浸润后 4 天、 7 天和 10 天收集叶样，或在 4 DPI 下收集叶样进行蛋白质印迹分析，用不同细胞悬浮密度的农杆菌浸润的植物之间 GFP 荧光存在显着差异在 7 D-P-I-G-F-P 处未观察到 GFP 表达为 600 为 0.05。

在细胞悬液中浸润的植物中荧光相似。密度为 601.0 0.5 和 0.1，但在 A 600 为 0.05 时浸润的植入物较低，而在 10 DPI 时则较低。在用四种细胞悬浮密度中的任何一种浸润的植物之间未观察到 GFP 产生的差异，以增加可用于瞬时蛋白质生产的农杆菌菌株的多样性。

Nicotiana Benham miana 植物被 7 种不同的农业细菌菌株真空浸润，这些菌株含有 4 公里的载体 KBI。以 7 DPI 收集浸润的叶片，并通过 Western blot 估计激酶表达水平。如图所示，菌株 GV 3 1 10、1 A four 和 LBA 4 4 0 4 实现了最高水平的脱链酶产生，差异略有不同。

虽然表达水平最低的是 C 5、8、C 1 中间裂解酶的产生，但菌株 A T 77、T 0 6 和 T 10 裂解酶的酶活性使用 XMO Graham 测定法得到证明。纯化的细菌裂解酶蛋白用作酶活性的阳性对照。有趣的是，用 A 4 和 T 7 野生型农杆菌菌株渗透的 nicotiana Benham miana 植物在 7 DPI 时表现出发育迟缓、宠物伸长和卷曲以及叶片卷曲等病理症状。

T 10 菌株用野生型浸润的 nicotiana benham 植物中，症状轻微。在用实验室菌株 GV 3 1 0 1 浸润的 Nico Oceana Benham 植物中未观察到症状。野生型物种中植物生物量生产的比较表明，在相同的生长条件下，Nico Oceana Excela 可产生的最高叶片生物量比 Nico Oceana 高出约两倍。

在用农杆菌菌株渗透的 Nico Oceana Benham、Nico Oceana Excelsior 和 Nico Oceana Excela 中检查了 Benham 蛋白质的产生。在整个浸润叶片中，以 7 DPI 评估了含有 PBI 4G F-P-G-F-P 积累的 GV 3 1 0 1。在紫外光下对 GFP 表达的目视检查显示，GFP 在 Nico Oceana Hamana 和 Nico Oceana Excela 中分布均匀，而在 Nico Oceana Excelsior 中分布不均匀，因为难以渗透到 Nico Oceana Excelsior 的整个叶区 蛋白质印迹分析表明，在 7 DPI 时，这些浸润叶片中 GFP 积累的分析表明，Nico Oceana Hamana 中的 GFP 水平高于 Nico Oceana Excela 和 NicoOceana Excelsior Nico Oceana 的低水平蛋白质生产。

Excelsior 是由于收集的叶片中积累的 GFP 渗透不均匀和分布不均匀。为了测试真空压力对叶片的影响，在 400、200、100 或 50 毫巴的真空压力下，在 30 或 60 秒的真空保持时间内，用含有 PBI 4G FP 的农杆菌菌株 GV 3 1 0 1 1 渗透到 Nico Oceana Benham 植物中。当施加 5、100 和 200 毫巴的真空压力 30 或 60 秒时，未观察到 GFP 产生差异，对植物健康有轻微或无不利影响。

通过每小时渗透一株 Nico Oceana Benham 植物，用 GV 3 1 0 1 的 A 600 为 0.5 含有 PBI 4G FP 8 小时来评估真空持续时间对目标表达的影响。在该代表性结果所示的相同农杆菌培养物中，GFP 的产生水平始终相似，指向长达 8 小时，这表明在这段时间内，农杆菌保持其发射单链 DNA 的能力。由于据报道许多化学物质和单糖可以增强各种植物物种的瞬时蛋白质产生。

本研究还评估了不同浓度的乙酸、克里酮和葡萄糖的效果。在 Nico Oceana Benham 的瞬时 GFP 蛋白生产中，Ana 渗透了含有 PBI 4G FP 的农杆菌菌株 GV 3 1 0 1。将农业细菌在 YEB 培养基中生长过夜，离心并重悬于含有 2% 葡萄糖和指定浓度乙酰血清酮的 MMA 中，或重悬于含有 200 微摩尔苯乙酮和指定浓度葡萄糖的 MMA 中，浓度为 0.5。如此处所示，与诱导培养基不含苯乙酮或葡萄糖的对照相比，这些化合物的测试浓度均未诱导 GFP 蛋白产生的显着增加。

接下来，沉默抑制因子的共浸润对 Nico Oceana 中 GFP 和 HAC one 基因瞬时表达的影响。在浸润之前检查了 Benham 叶，分别以 1 比 1、2 比 1、3 比 1 和 4 比 1 的比例混合含有 PBI 4G FP 的农杆菌 GV 三一一培养物和番茄浓密特技病毒的病毒沉默抑制因子 P 19。正如 7 DPI 的 Western blot 分析结果所示，P 19 的存在在两种农杆菌悬浮液的任何比例下都不会增加或减少 nicotiana Benham Miana 中的 GFP 产生。

此外，研究了两种病毒基因沉默抑制因子 P 23 和 P 19 对预防 HAC 1 转录后基因沉默的影响。将携带发射载体 PBI 4、HAC 1 和 2 种病毒沉默抑制质粒之一的农杆菌的 POS 分别以 4：1 的比例混合，共渗透到 Nicotiana Bentham Miana 中。从 3 到 8 DPI 收集浸润的叶子样本。

该图显示了通过 Western blot 分析确定的三个实验中 HAC one 表达的平均水平。与 60 pi 时不使用沉默抑制器相比，用 P 23 或 P 19 共浸润 Nico Oceana Benham 导致 HAC one 的产生增加。这表明 P 23 和 P 19 在该系统中是有效的。

还观察到，在存在和不存在沉默抑制因子的情况下，HAC one 蛋白的产生水平在 7 DPI 时开始下降。这表明 Nico Oceana Benham Miana 中瞬时蛋白产量下降的时间是靶标特异性的。最后，每年通过用同一批次的农杆菌细胞库渗透 nicotiana benham 植物来评估农杆菌细胞库的稳定性，以评估蛋白质积累。

这些代表性结果表明，HA one 蛋白的生产已经非常稳定了三年多。Nicotiana benam 植物的平均 HAC one 产量为每公斤 651 毫克或正负 49.4 毫克。看完这个视频，你应该对如何应用农业浸润技术大规模生产重组蛋白有了很好的了解，这些重组蛋白可用于生产亚单位疫苗、theo 蛋白抗体和诊断抗原。

在尝试此过程时，重要的是要记住交叉水培控制植物，使用活的农业细菌，控制真空压力和反应，并监测蛋白质表达的载体。一旦掌握，如果在受控条件下正确执行农业过滤技术，可以在 24 小时内完成。