大豆原生质体分离的简易方法及其在瞬态基因表达分析中的应用

我们开发了一个简单和有效的协议, 以制备大量的大豆原生质体研究复杂的调控和信号机制的活细胞。

该方法的总体目标是从大豆中获得高质量的原生质体细胞，以检查活大豆细胞中的调节和信号传导机制。这种方法可以帮助回答调节网络中的关键问题，例如它们的直接靶基因是什么，打开输血因子，以及它们的相互作用伙伴是什么，打开蛋白质。这种技术的主要优点是艺术。

它产生大量均匀的大豆原生质体细胞，而且简单易行。一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为除非你在特定阶段展开，否则很难从大豆叶中获得很好的原生质体。在适当的发育阶段选择叶片是大豆原生质体制备成功的关键。

从 10 天大的大豆幼苗上剪下新扩展的单叶叶。为确保当样品产生高原生质体产量时，至少收集三个处于略有不同发育阶段的单叶叶样品。用新鲜的剃须刀片，从每片单叶子上去除中肋，然后将残余部分切成 0.5 到 1 毫米的条状。

使用一对镊子，将叶条立即轻轻转移到 15 毫升试管中的 10 毫升新鲜制备的酶溶液中。在室温下真空渗入叶条15分钟。将叶条在酶溶液中在室温下轻轻搅拌孵育 4 至 6 小时。

随着原生质体的释放，酶溶液会变成黄绿色。在显微镜下以 10 倍放大倍率检查酶原生质体溶液，以选择具有最佳原生质体消化的样品。释放的原生质体呈球形，而未消化的细胞呈不规则或椭圆形。

为了停止消化，将 10 毫升具有最佳原生质体消化的酶原生质体溶液轻轻倒入 50 毫升管中，并在室温下加入 10 毫升 W5 溶液。轻轻地将试管倒置几次。然后，将酶原生质体溶液轻轻倒入放置在 50 毫升试管顶部的干净的 75 微米尼龙网中，以去除未消化的叶组织。

接下来，在室温下以 100 倍 G 离心流过的原生质体酶溶液 1 至 2 分钟。然后，使用 10 毫升血清移液管轻轻去除上清液，而不会干扰原生质体沉淀。将原生质体重悬于冷冻的 W5 溶液中，并将 50 毫升试管保持在冰上。

显微镜下用血细胞计数器计数原生质体数后，在冷冻的 W5 溶液中稀释至每毫升原生质体的两倍乘以 10 至第五原生质体的浓度。将原生质体在冰上放置 30 分钟。在室温下以 100 倍 G 离心悬浮液 1 至 2 分钟。

然后使用 1 毫升移液器轻轻去除 W5 溶液，而不会干扰原生质体沉淀。在室温下以每毫升 10 倍的 2 倍至第五原生质体的浓度在 MMG 溶液中重悬原生质体。为了准备原生质体进行转化，使用未切割的 200 微升移液器吸头在 1.5 毫升低粘附微量离心管中制备 100 微升原生质体等分试样。

留出一份等分试样作为阴性对照。向剩余的原生质体等分试样中，加入 10 微升质粒 DNA。在 1.5 mL 微量离心管的内壁上缓慢加入 110 μL 新鲜制备的 peg 溶液。

然后轻轻倒置并旋转试管，直到溶液变得均匀。将转化混合物在室温下孵育 15 分钟。为了停止转化，在室温下向每根 1.5 毫升试管中缓慢加入 400 微升 W5 溶液，然后轻轻倒置试管，直到溶液变得均匀。

在室温下以 100 倍 G 离心试管 1 至 2 分钟。丢弃上清液。向每管中加入 1 毫升 WI 溶液。

涂布六孔组织培养板的孔表面，以防止原生质体粘附在板上。向每个孔中加入 1 毫升 5% 无菌犊牛血清，几秒钟后，使用移液管去除犊牛血清。将重悬的原生质体转移到培养板的孔中，并盖上盖子。

收获前，将原生质体在室温下在黑暗中孵育两天。两天后，将原生质体溶液转移到 1.5 毫升低粘附微量离心管中。在室温下以 100 倍 G 离心试管 1 至 2 分钟。

用移液管去除上清液。将 10 μL 原生质体转移到载玻片上。使用未转化的原生质体作为阴性对照，在荧光或共聚焦显微镜下观察荧光信号。

从 10 日龄大豆的不同器官制备原生质体细胞，并在显微镜下观察。来自下尾和上尾的细胞壁几乎没有被消化。一些细胞保持相互附着。

在尾铅和根中，仅在一小部分细胞中去除了细胞壁。相比之下，当使用 unifoliate 时观察到大量的原生质体。这张照片中从左到右的幼苗说明了未展开、刚刚展开或完全展开的单叶叶子。

虽然未展开和刚刚展开的单叶叶都导致了原生质体的高产量，但来自刚刚扩展的单叶叶的原生质体的大小比未展开的单叶叶更均匀。对于完全扩增的单叶细胞，大多数细胞中的细胞壁仍然完好无损。测试一系列不同量的质粒 DNA 表明，更大量的 DNA 导致更高的转化效率。

用表达 GFP 的构建体与豆科植物特异性 E1 基因融合的大豆原生质体的共聚焦图像显示 E1 GFP 融合蛋白的核定位，与之前使用拟南芥原生质体系统的研究一致。在尝试此程序时，重要的是要记住根据经验优化每个实验条件，例如选择正确的叶材料阶段、细胞壁消化时间的长度、浓缩年龄和用于转化的质粒 DNA 的量。在此程序之后，可以执行其他方法，例如 RNA 和蛋白质复制，以回答其他问题，例如哪些基因或哪些蛋白质受到调节或不受调节？

看完这个视频，你应该对如何获得高质量的大豆原生质体细胞有了很好的了解。