血脑肿瘤屏障或 BBTB 模型:血脑屏障或 BBB 模型的改编，用于评估向肿瘤提供治疗药物

血脑屏障（BBB）是内皮细胞和脑细胞（如星形胶质细胞）的选择性屏障，调节血液和大脑之间物质的运输。

要开发 BBB 模型，请将膜插入物倒置到培养板盖上。

膜上播种星形胶质细胞。将培养板放在插入物上并孵育。

这将星形胶质细胞困在膜和孔表面之间。

板恢复到底部，并将星形胶质细胞带到底部，并向孔中添加合适的培养基。

在插入片段中，添加表达最佳紧密连接蛋白的内皮细胞，这些蛋白可增强屏障形成所需的细胞间接触。

孵育以使内皮细胞粘附在膜上。

取出用过的培养基并将插入片段转移到另一种含有良好生长因子的星形胶质细胞培养基中。

随后，将不含生长因子的内皮细胞培养基添加到插入片段中并孵育。

生长因子的缺乏会抑制细胞分裂，保持细胞间接触并稳定屏障特性。

内皮细胞和星形胶质细胞相互作用形成具有紧密连接（如血脑屏障）的基底膜。

接下来，在新培养物井中接种神经胶质瘤球体。

BBB 模型转移到这些球体上并孵育以形成血脑肿瘤屏障或 BBTB 模型。

靶分子添加到 BBTB 模型中，以评估它们向肿瘤部位的递送。

在无菌细胞培养罩下，用5毫升无菌PBS仔细洗涤培养的星形胶质细胞。使用真空泵轻轻丢弃PBS，加入2毫升细胞解离试剂5分钟，使细胞分离。

然后，向容器中加入10毫升无菌完全星形胶质细胞培养基，以抑制细胞解离试剂的活性。使用无菌血清移液器将分离的细胞从血管转移到无菌的 15 毫升管中。

室温下以 250 x g 离心 3 分钟。同时，放置插入物。使用无菌镊子将插入物的脑面朝上放在无菌 6 孔板的盖子上。

心完成后，小心地从细胞悬液中弃去上清液，并将星形胶质细胞沉淀重悬于 1 毫升 ABM plus 中，方法是将沉淀轻轻移液到管壁上最多五次。

然后，对细胞进行计数，并将细胞悬液密度调整为每个插入片段 400 微升 ABM 加中的 150,000 个细胞。将该细胞悬液放入插入物膜的脑侧中间，并用无菌移液器吸头使用毛细管力小心地将其铺开。

在插入物的脑侧仍然向上的情况下，将 6 孔板放回插入物上。将板和插入物的大脑面朝上放入 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的培养箱中，以允许细胞粘附。

之后，将 6 孔板恢复到其正常位置，插入物现在血面朝上。加入培养基并按照文本方案中的概述继续孵育。在无菌细胞培养罩下，用5毫升无菌PBS仔细洗涤培养的内皮细胞。

使用真空泵轻轻丢弃PBS，加入2毫升细胞解离试剂5分钟，使细胞分离。然后，向血管中加入10毫升无菌完全内皮细胞培养基，以抑制细胞解离试剂的活性。

使用无菌血清移液器将分离的细胞从血管转移到无菌的 15 毫升管中。在室温下以 250 x g 离心 3 分钟。之后，弃去上清液，将内皮细胞沉淀重悬于1毫升EBM中，方法是在管壁上缓慢移液细胞悬液最多五次。

细胞进行计数，并将细胞悬液密度调整为2.5毫升内皮细胞培养物中的200,000个细胞，每个插入片段不含血清和血管内皮生长因子-A。取回包含刀片的板。

小心地从血液侧丢弃培养基，并用 2.5 毫升内皮细胞悬液代替。然后，将板放回培养箱并放置过夜，以使内皮细胞粘附在膜上。

第二天，通过将 3 毫升预热的 ABM 减去转移到每个孔中来制备一个 6 孔板。使用无菌镊子，处理插入物，小心地从血液侧丢弃内皮完全培养基，并将插入物放入含有ABM减去的新板中。然后，加入 2.5 毫升 EBM 减去。

插入物在培养箱中放置 5 天，物理干扰或温度变化最小。转移当天，更换介质。对于免疫荧光成像，将最多四个圆形无菌硼硅酸盐盖玻片放入含有 2 毫升聚-D-赖氨酸的 6 孔板的每个孔中。在室温下孵育30分钟。

同时，使用无菌血清移液器小心地将肿瘤球从细胞培养容器转移到 15 毫升无菌管中。将肿瘤球体以250 x g 离心3分钟。弃去上清液，轻轻将球体重悬于1毫升GBM减号中。

细胞进行计数并将细胞密度调整为大约 10,000 个球体或每毫升 GBM 减去 100,000 个细胞。接下来，从孔中弃去聚-D-赖氨酸，并用无菌PBS冲洗孔三次。用 3 毫升肿瘤球体悬液接种板的每个孔，并将带有 BBTB 模拟物的插入物转移到肿瘤细胞悬液上。

37摄氏度下与5%的二氧化碳孵育过夜，以使测定的血液和脑肿瘤部位达到平衡。第二天，用补充感兴趣的分子、药物或纳米颗粒的EBM替换血液侧的培养基。