多重液滴聚合酶链反应检测白细胞中的 DNA 甲基化

DNA 胞嘧啶残基甲基化是白细胞或白细胞的特征。

多重液滴聚合酶链反应 （mdPCR） 允许同时鉴定白细胞内的多个甲基化 DNA 区域。

制备含有反应缓冲液、DNA 聚合酶和无核酸酶水的混合物。添加针对每个靶区域的正向和反向引物以及荧光水解探针。探针包括与猝灭剂结合以抑制荧光发射的不同颜色的荧光团报告基因。

添加亚硫酸氢盐转化的DNA，其中未甲基化的胞嘧啶脱氨成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。混合。

载体油-表面活性剂混合物填充玻璃注射器，用载体油-PCR 混合物填充另一个玻璃注射器，并将它们连接到微流体液滴发生器。载体油-水性 PCR 混合物乳化成亚纳升大小的液滴。表面活性剂稳定乳液并防止液滴合并。

收集液滴，并进行PCR。在每个液滴内，高变性温度将双链 DNA 变性为单链 DNA 并激活聚合酶。反应温度降低，允许引物和探针的位点特异性退火。

当聚合酶结合并延伸 DNA 引物双链体时，尿嘧啶扩增为胸腺嘧啶，而甲基化胞嘧啶扩增为胞嘧啶，从而可以区分甲基化和未甲基化区域。聚合酶进一步裂解并释放报告基因，引起荧光发射。

PCR 后，在显微镜下观察液滴。荧光颜色表示存在特定的甲基化 DNA 靶标。

对于液滴生成，将 1 微升亚硫酸氢盐转化的 DNA 与新鲜制备的探针预混液混合在 PCR 管中，并通过短暂离心收集样品。使用 PEEK 接头将一次性流体管连接到两个 250 微升容量的精密玻璃注射器，并在一个精密玻璃注射器中预填充含有 5% 氟表面活性剂的 250 微升载体油，以及一个装有 50 微升载体油的精密玻璃注射器。

两个注射器都装好后，将 100 微升 PCR 混合物装入载体油注射器中，并将液滴微流控装置放在配备高速相机的正置光学显微镜的载物台上。

为了实时观察和记录液滴形成，将预装注射器放在可编程注射泵上，并使用带有配件的PEEK接头将注射器的管道连接到液滴微流体装置的各个入口通道的管道。

管子从液滴发生器的出口放置到 0.5 毫升 PCR 管的内部，并将注射泵流速调整为每分钟 2 微升。在收集所得乳液之前，请让液滴大小稳定。缓慢而小心地从管顶部收集乳液，并将 75 微升溶液转移到 200 微升 PCR 管中进行热循环。

然后，确认PCR管中的含油量与分散相的体积紧密匹配，以防止液滴在热循环过程中聚结，并将200微升管放入热循环仪中。