0 次观看 • 4:28 分钟 • July 8th, 2025
DNA 胞嘧啶残基甲基化是白细胞或白血球的特征性特征。
多重液滴聚合酶链式反应（mdPCR）可实现对白细胞内多个甲基化DNA区域的同时鉴定。
配制含有反应缓冲液、DNA 聚合酶和无核酸酶水的混合液。加入针对每个目标区域的特异性正向和反向引物以及荧光水解探针。这些探针包含不同颜色的荧光报告基团，其与淬灭剂结合以抑制荧光信号的释放。
加入经亚硫酸氢盐转化的DNA，其中未甲基化的胞嘧啶被脱氨为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。混匀。
用载油-表面活性剂混合液填充一支玻璃注射器，用载油-PCR 混合液填充另一支玻璃注射器，并将它们连接至微流控液滴生成装置。载油-水相 PCR 混合液会乳化形成亚纳升级别的微小液滴。表面活性剂可稳定乳化液并防止液滴合并。
收集液滴，并进行 PCR。每个液滴内的高温变性步骤可将双链 DNA 变性为单链 DNA，并激活聚合酶。随后降低反应温度，使引物和探针在特定位点发生退火。
当聚合酶结合并延伸DNA-引物双链时，尿嘧啶以胸腺嘧啶的形式扩增，而甲基化的胞嘧啶则以胞嘧啶的形式扩增，从而能够区分甲基化与非甲基化区域。聚合酶进一步切割探针，释放报告分子，引发荧光信号的发射。
PCR 反应后，在显微镜下观察液滴。荧光颜色指示特异性甲基化 DNA 目标片段的存在。
进行液滴生成时，将1微升亚硫酸氢盐转化的DNA与新配制的探针预混液在PCR管中混合，并通过短暂离心收集样品。使用PEEK接头将一次性流体管路连接至两个250微升容积的精密玻璃注射器，其中一个精密玻璃注射器预先装入含5%氟化表面活性剂的250微升载油，另一个精密玻璃注射器预先装入50微升载油。
当两个注射器均装载完毕后，将100微升PCR混合液注入载油注射器中，并将液滴微流控装置放置在配备高速相机的直立光学显微镜载物台上。
为了实时观察和记录液滴的形成，将预装填的注射器放置在可编程的注射泵上，并使用带接头的聚醚醚酮（PEEK）连接管，将注射器的管路与液滴微流控装置各入口通道的管路连接起来。
将液滴发生器出口端的管路放入0.5毫升PCR管内，调节注射泵流速为2微升每分钟。在收集生成的乳液前，需等待液滴大小稳定。缓慢而小心地从管子顶部收集乳液，并将75微升溶液转移至200微升PCR管中进行热循环。
然后，确认PCR管中的油相体积与分散相体积相近，以防止热循环过程中液滴发生融合，并将200微升的PCR管放入热循环仪中。