Name: 微RNA循环使用定量DNA结合染料化学和液滴的数字PCR (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 学习使用液滴数字PCR技术定量检测血浆或血清中的循环微RNA。该方法具有高灵敏度，无需内参基因即可检测低丰度微RNA，为癌症早期诊断和生物标志物研究提供可靠工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

由意大利癌症研究协会（AIRC）为 MF（项目编号 MFAG 11676）和 MN（特别项目“分子临床肿瘤学——5 per mille”编号 9980，2010/15）提供的资助，以及意大利教育、大学与研究部 FIRB 2011 项目（项目编号 RBAPIIBYNP）为 MN 提供的资助支持。

血浆或血清中微小RNA的分离
注意：血浆和血清的制备是循环miRNA定量中的关键步骤。目前尚无首选的血浆和血清制备方法。唯一需要考虑的重要因素是，同一实验中的所有样本必须使用完全相同的操作流程进行处理。起始样本量为200 µl血清或血浆。可使用市售试剂盒从血清或血浆中提取总RNA。
1. 总RNA（包括miRNA）提取方案
<ol>
	<li>将血清/血浆样本在冰上解冻。</li>
	<li>向 200 µl 血清/血浆中加入 1 ml 裂解试剂（例如，QIAzol）。</li>
	<li>涡旋混匀，并将含有匀浆的离心管置于室温下静置 5 分钟。</li>
	<li>加入 3 µl 来自 C. elegans 的合成 miRNA cel-miR-39-3p（4.16 nM 溶液）。</li>
	<li>加入 200 µl 氯仿，剧烈振荡 15 秒。将离心管置于室温下静置 2 分钟。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 12,000 x g 离心 15 分钟，使相分离：上层水相含有 RNA。</li>
	<li>将水相（约 700 µl）转移至新离心管中，避免转移任何白色中间层物质。</li>
	<li>加入 1 ml 100% 乙醇，通过倒置混匀。</li>
	<li>用移液器吸取 700 µl 样品至置于 2 ml 收集管上的小型离心柱中。盖紧管盖，在 12,000 x g 条件下离心 15 秒。弃去穿流液。</li>
	<li>使用剩余样品重复此步骤。</li>
	<li>向小型离心柱中加入 700 µl RWT 缓冲液，盖紧管盖，在 12,000 x g 条件下离心 15 秒以洗涤离心柱。弃去穿流液。</li>
	<li>向小型离心柱中加入 500 µl RPE 缓冲液。盖紧管盖，在 12,000 rpm 条件下离心 15 秒。弃去穿流液。再次重复此步骤。</li>
	<li>将小型离心柱在最大转速下离心 2 分钟，以去除离心柱膜上残留的乙醇。</li>
	<li>将小型离心柱转移至新的 1.5 ml&#160;收集管中，并在离心柱膜上加入 35 µl 无 RNase 水。</li>
	<li>在 12,000 x g 条件下离心 1 分钟，以洗脱 RNA。</li>
	<li>将 RNA 储存于 -80 °C。
	 
	注意：由于无法准确测定 RNA 浓度，应使用固定的体积作为上样量的衡量标准。</li>
</ol>
2. 微小RNA逆转录
<ol>
	<li>解冻逆转录（RT）试剂混合物的组分：5倍反应缓冲液、无核酸酶水。轻轻颠倒混匀各管，置于冰上。使用前立即从冷冻箱中取出酶混合液，置于冰上。将所有试剂短暂离心。</li>
	<li>在冰上配制RT试剂混合液，具体步骤如下所述 表1准备至少超出10%的混合液。</li>
	<li>用移液器吹打混匀反应液，然后离心沉淀。</li>
	<li>在 42 ˚C 下孵育 60 分钟。</li>
	<li>95 ˚C 加热 5 分钟以灭活逆转录酶。</li>
	<li>立即冷却至 4 °C。</li>
	<li>将 cDNA 储存于 -20 °C。</li>
</ol>
3. cDNA 稀释
<ol>
	<li>根据计划进行的数字微滴PCR（ddPCR）反应所需量，用无核酸酶水稀释cDNA模板。根据靶标miRNA的丰度，将cDNA反应液在水中稀释1:50至1:500倍。将稀释后的cDNA储存于-20 °C。稀释后的cDNA在-20 °C下至少可稳定保存3个月。</li>
</ol>
4. 液滴生成与PCR
注意：应每次对8个样品进行液滴生成。由于该技术具有高度可重复性12,15，无需设置技术重复样本。每个反应板以及每种不同的数字微滴PCR（ddPCR）条件均应设置无模板对照（NTC）样本。
<ol>
	<li>在室温下解冻并平衡主混合液（例如，EvaGreen 主混合液）、microRNA 引物组和 cDNA。</li>
	<li>通过反复倒置管子数次彻底混匀主混合液。离心收集所有试剂。</li>
	<li>按照表 2所述配制 ddPCR 混合液。当进行多个 ddPCR 反应时，应配制 ddPCR 混合液的工作液，并额外多准备至少 10% 的量。</li>
	<li>混合液配制完成后，充分混匀并短暂离心。</li>
	<li>将 12 µl ddPCR 混合液分装至 96 孔 PCR 板或 PCR 管中。</li>
	<li>向每根管或每个孔中加入 8 µl 稀释后的 cDNA 模板。</li>
	<li>将微滴生成器卡盒插入卡盒架中。</li>
	<li>小心地将每份已制备样品 20 µl 转移至微滴生成器卡盒的样品孔（中间一排），避免孔底产生气泡。</li>
	<li>向每个油相孔（底部一排）加入 70 µl 微滴生成器油。</li>
	<li>将密封垫圈钩在卡盒架上，并将整体插入微滴生成器中。</li>
	<li>关闭盖子，按照制造商的操作说明启动微滴生成。微滴生成完成后，打开盖子，取下一次性密封垫圈。此时卡盒顶部各孔中含有生成的微滴。</li>
	<li>缓慢而平稳地用移液器吸取顶部八个孔中的内容物（即微滴），共 40 µl，转移至 96 孔 PCR 板的同一列中。</li>
	<li>转移微滴后立即用铝箔密封 PCR 板，防止蒸发。应使用可穿刺的铝箔封板膜，确保与微滴读取仪中的针头兼容。</li>
	<li>封板后 30 分钟内开始热循环（PCR）。</li>
	<li>按照表 3设定的程序进行扩增循环。</li>
</ol>
5. 液滴读取
<ol>
	<li>打开液滴读取仪电源。</li>
	<li>将反应板从热循环仪转移至液滴读取仪。</li>
	<li>将含有扩增后液滴的96孔PCR板放入板架底座中。</li>
	<li>将板架上盖盖在PCR板上，用力按下两侧释放按钮，以固定PCR板。</li>
	<li>从系统计算机启动软件。
	<ol>
		<li>点击“Setup”以设定实验（绝对定量），然后点击“Run”开始读取液滴。</li>
		<li>液滴读取完成后，点击 &#34;“Analyze”&#34; 按钮以打开并分析数据。</li>
		<li>在分析软件中使用二维振幅图，利用套索工具选择阳性液滴（图1B）。</li>
		<li>通过“Events”标签页检查阳性液滴和总液滴数量。在无探针的ddPCR中，通常可获得18,000至21,000个液滴。</li>
		<li>选定阳性液滴后，通过“Concentration”标签页中的导出.csv选项导出miRNA浓度值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Arroyo, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argonaute2+complexes+carry+a+population+of+circulating+microRNAs+independent+of+vesicles+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5003-5008 (2011).</li>
<li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).</li>
<li>Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+are+transported+in+plasma+and+delivered+to+recipient+cells+by+high-density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins.</a> Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).</li>
<li>Braicu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+divine+messengers%3A+are+they+the+Hermes+of+modern+molecular+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Exosomes as divine messengers: are they the Hermes of modern molecular oncology.</a> Cell Death Differ. 22, 34-45 (2015).</li>
<li>Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+novel+biomarkers+and+extracellular+communicators+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease.</a> Circ Res. 110, 483-495 (2012).</li>
<li>Guay, C., Regazzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+novel+biomarkers+for+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as novel biomarkers for diabetes mellitus.</a> Nat Rev Endocrinol. 9, 513-521 (2013).</li>
<li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nat Rev Clin Oncol. 11, 145-156 (2014).</li>
<li>Moldovan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+challenges+in+utilizing+miRNAs+as+circulating+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers.</a> J Cell Mol Med. 18, 371-390 (2014).</li>
<li>Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+Using+Circulating+miRNAs+as+Cancer+Biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Challenges in Using Circulating miRNAs as Cancer Biomarkers.</a> Biomed Res Int. 2015, 731479(2015).</li>
<li>Jarry, J., Schadendorf, D., Greenwood, C., Spatz, A., van Kempen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+validity+of+circulating+microRNAs+in+oncology%3A+five+years+of+challenges+and+contradictions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">The validity of circulating microRNAs in oncology: five years of challenges and contradictions.</a> Mol Oncol. 8, 819-829 (2014).</li>
<li>Witwer, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+MicroRNA+Biomarker+Studies%3A+Pitfalls+and+Potential+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Circulating MicroRNA Biomarker Studies: Pitfalls and Potential Solutions.</a> Clin Chem. 61, 56-63 (2015).</li>
<li>Miotto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Circulating+miRNAs+by+Droplet+Digital+PCR%3A+Comparison+of+EvaGreen-+and+TaqMan-Based+Chemistries%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Quantification of Circulating miRNAs by Droplet Digital PCR: Comparison of EvaGreen- and TaqMan-Based Chemistries.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23, 2638-2642 (2014).</li>
<li>Ferracin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+of+cell-free+microRNAs+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification of cell-free microRNAs in cancer patients.</a> Oncotarget. , (2015).</li>
<li>Mangolini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+prognostic+microRNAs+in+the+serum+of+breast+cancer+patients+measured+by+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarker+Research%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR.</a> Biomarker Research. , (2015).</li>
<li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nat Methods. 10, 1003-1005 (2013).</li>
<li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+%28miRQC%29+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nat Methods. 11, 809-815 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

循环miRNA在血液中的浓度极低，从血浆和血清样本中提取的RNA量也很少。因此，使用其他技术（如微阵列和RNA测序）对其进行定量非常困难。此外，目前在数据归一化方面普遍缺乏共识，且血液中是否存在内源性&#34;参考&#34;miRNA仍不明确。在此背景下，像微滴数字PCR这样能够精确计数每毫升&#160;血清或血浆中miRNA拷贝数（即使拷贝数极低）的高灵敏度技术显得极具吸引力。我们将该技术与一种通用cDNA系统相结合，可在单个反应中对所有循环miRNA进行逆转录，从而节省时间，更重要的是节约了RNA样本。在我们的方法中，特异性源于LNA引物的使用，与其他方案相比，LNA引物在miRNA定量中表现优异16。
微滴数字PCR是一种终点检测方法，可用来计算目标基因的绝对浓度。与定量PCR不同，扩增效率不足不会影响最终的微滴数字PCR定量结果。因此，考虑到血液样本等样本中可能存在的PCR抑制物含量，微滴数字PCR为循环核酸的检测提供了一种可靠的工具。
由于其高灵敏度，该技术即使在起始材料有限的情况下，也能对丰度...

微小RNA（miRNA）可由生物体几乎所有细胞通过主动释放或坏死及凋亡过程释放进入血液循环。游离miRNA已在血液中被检测到，它们以游离稳定分子形式存在，或与脂蛋白结合，或包裹于外泌体和微囊泡内1-3。人们认为这些miRNA在细胞间通讯中发挥作用4，并且在癌症、心脏疾病或自身免疫性疾病存在时其含量会发生变化5-7。对miRNA进行准确且可重复的定量是将其评估为疾病生物标志物的基础。然而，由于其他文献中已描述的多种原因8,9，在血清或血浆以及其他体液中对miRNA进行定量可能极具挑战性10,11。我们近期开发了一种基于miRNA特异性锁核酸（LNA）引物和DNA结合染料的液滴数字PCR（ddPCR）技术，用于循环miRNA的绝对定量12。该方法已应用于miRNA乳腺癌生物标志物的验证13,14。
在每个反向转录的miRNA分子被分配到纳升级液滴中后，即可对每个样本中每种miRNA的拷贝数进行计数，其基本原理是统计呈绿色、即具有阳性信号的荧光液滴数量。一旦发生PCR扩增反应，即可获得一个阳性计数，无需建立标准曲线，也无需在目标物定量计算中考虑PCR扩增效率，而定量逆转录PCR（RT-qPCR）则必须进行这些步骤。此外，已有研究表明，数字滴定PCR（ddPCR）在循环miRNA定量方面比RT-qPCR具有更高的灵敏度和准确性15。本文将详细介绍该方法的具体实验流程，讨论其中最关键的步骤，并特别针对血清和血浆等临床样本进行说明。

<table><tbody><tr><td>miRNeasy Mini试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>用于从血清/血浆中提取总RNA（包括miRNA）的离心柱</td></tr><tr><td>100 nmole RNA寡核苷酸Cel-miR-39-3p</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Custom</td><td>序列：UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG</td></tr><tr><td>通用cDNA合成试剂盒II，8-64次反应</td><td>Exiqon</td><td>203301</td><td>用于microRNA逆转录的试剂盒</td></tr><tr><td>MicroRNA LNA PCR引物组&amp;nbsp;</td><td>Exiqon</td><td>204000-206xxx 和 2100000-21xxxxx</td><td>用于液滴内miRNA扩增的引物</td></tr><tr><td>QX200液滴生成仪</td><td>BioRad</td><td>186-4002</td><td>用于液滴读取的仪器</td></tr><tr><td>QX200液滴读取仪</td><td>BioRad</td><td>186-4003</td><td>用于液滴生成的仪器</td></tr><tr><td>QuantaSoft软件</td><td>BioRad</td><td>186-3007</td><td>用于数据采集与分析的软件</td></tr><tr><td>PX1 PCR板封膜机</td><td>BioRad</td><td>181-4000</td><td>板封仪</td></tr><tr><td>DG8液滴生成仪 cartridge 和垫圈</td><td>BioRad</td><td>186-4008</td><td>用于混合样品与油相以生成液滴的 cartridge</td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen预混液</td><td>BioRad</td><td>186-4033/36</td><td>PCR预混液</td></tr><tr><td>适用于EvaGreen染料的QX200液滴生成油</td><td>BioRad</td><td>186-4005</td><td>用于液滴生成的油相</td></tr></tbody></table>

利用dna结合染料化学法和液滴数字pcr定量循环微小rna

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

循环游离微小RNA（miRNA）由细胞释放进入血液。循环中特定微小RNA的含量与疾病状态相关，具有作为疾病生物标志物的潜力。近期已开发出一种基于染料化学和微滴数字PCR技术的高灵敏度、高准确性方法，用于定量检测循环微小RNA。具体而言，在兼容的微滴数字PCR系统中，使用基于锁核酸（LNA）的miRNA特异性引物和绿色荧光DNA结合染料，可实现对特定miRNA的绝对定量。本文描述了该技术在血浆和血清等生物液体中检测miRNA含量的可行性和有效性。

可通过绿色荧光DNA结合染料和微滴数字PCR技术测定每毫升血浆或血清中特定miRNA的绝对含量。图1展示了阳性微滴筛选过程，该过程由分析软件计算扩增反应中miRNA的最终浓度（拷贝数/µl）。不同miRNA在血液中的含量差异较大，某些miRNA的丰度显著高于其他种类。在ddPCR反应中使用1:50稀释的cDNA，可获得足够数量的阳性和阴性微滴。若出现阳性微滴饱和（例如，无剩余阴性微滴），则可能需要对cDNA样本进行进一步稀释。
每对LNA引物均需进行优化，以确保在液滴数字PCR系统中正常工作。miR-181a-5p的优化过程如图2所示。具体而言，通过调整引物用量（通常为每ddPCR反应0.25–1 µl）和退火温度（通常为56–60 °C），可筛选出能够实现阳性和阴性液滴更好分离的组合条件。对于miR-181a-5p，退火温度为60 °C，且引物用量为0.5 µl或1...

本文介绍了一种利用染料化学法和液滴数字PCR技术对无细胞microRNA进行高灵敏度和高准确度定量的检测方法。

利用DNA结合染料化学法和液滴数字PCR定量循环微小RNA

循环（无细胞）微小RNA（miRNAs）由细胞释放进入血液。循环中特定微小RNA的含量已被……

本实验的总体目标是利用微滴数字PCR技术，对血浆或血清等生物液体中的循环microRNA进行定量分析。该方法有助于解决生物标志物研究领域中的相关问题，通过鉴定诊断性和预后性生物标志物，用于癌症的检测与评估。该技术的主要优势在于其高灵敏度。它可用于定量丰度较低的微小RNA，且无需依赖内参基因。该方法的应用前景涉及癌症诊断，因为它有可能识别出处于癌症早期阶段的患者。它也可应用于其他疾病，如神经或心脏类疾病。通常，个体在热循环步骤前需注意液滴的操作，以避免液滴破裂。因此，液滴生成过程的可视化演示至关重要，因为操作不慎或移液过快均可能导致液滴破坏。首先进行血浆或血清中 microRNA 的分离，然后按照随附文件所述进行逆转录和稀释。从冷冻保存状态取出 EvaGreen 预混液、microRNA 引物组和 cDNA，并在室温下解冻。解冻后，将主混合液管颠倒数次，然后将所有试剂离心沉降。根据随附文件中的说明，配制液滴数字PCR（ddPCR）工作溶液。每种条件准备足够的量用于最多八个样本，并为每种条件设置一个无模板对照，额外增加10%的过量。组装完成后，充分混匀并离心ddPCR反应液。由于该技术具有高度重复性，无需设置技术重复。离心后，将12 µL ddPCR反应液分装至96孔PCR板的每个孔中。向每个孔中加入8微升稀释的cDNA模板。然后将液滴生成器 cartridge 插入 cartridge 持架中。向液滴生成器 cartridge 的中间一排，小心转移已准备好的每个样品20微升。避免在孔底部引入气泡。向底部一排的每个油孔中加入70微升液滴生成油。将垫圈钩在芯片架上。将 cartridge 插入液滴生成仪中，合上盖子以开始生成液滴。液滴生成完成后，打开盖子，从液滴生成仪中取出 cartridge，并移除一次性垫圈。cartridge 的上层孔中含有生成的液滴。从八个顶部孔中每个孔缓慢而平稳地转移40微升至一个96孔PCR板的单列中。立即用铝箔密封该板以防止蒸发。在密封板后的30分钟内，开始使用随附文件中表三所述的PCR程序进行热循环。 打开液滴读取仪电源。然后将反应板从热循环仪转移至液滴读取仪。将含有扩增后液滴的96孔PCR板放入液滴读取仪的板架底座中。将板架的上部放在PCR板上，用力按下两侧的释放卡扣，以固定PCR板。从系统PC启动QuantaLife软件，点击“Setup”（设置），打开包含样品、目的基因和检测信息的模板数据文件。从左侧导航栏中选择“运行”。此时将出现“运行选项”窗口。在“染料组”菜单中选择 EVA，然后单击“确定”以开始液滴读取。运行结束后，使用分析软件中的二维振幅图选择阳性液滴。选择阳性液滴时，使用左侧导航栏中的套索工具。然后，点击“Events”标签以查看阳性液滴和总液滴的数量。使用无探针的数字液滴PCR通常可获得总计18,000个液滴。然后单击浓度标签页以查看最终样品的浓度结果。最后使用导出功能。用于导出微小RNA浓度值的CSV文件。使用0.5和1微升引物浓度，在58和60摄氏度退火温度下，对两个血浆样本S1和S2中的mRNA miR-181a-5p进行了定量。该图展示了每种条件下扩增反应中每微升微小RNA的拷贝数。每个样本的PCR阳性液滴显示为蓝色，阴性液滴显示为黑色。如图所示，对照样本中无阳性液滴，符合预期。在60摄氏度下进行PCR反应，并使用0.5或1微升引物时，阳性与阴性液滴的分离效果更佳。在本图中，误差线代表泊松分布的95%置信区间。此处，以蓝色显示的阳性液滴数量与以绿色显示的液滴总数进行比较。综合来看，这些数据表明，液滴数字PCR可用于确定每微升生物液体中microRNA的绝对拷贝数。观看本视频后，您应能充分掌握如何使用微滴数字PCR进行mRNA定量。一旦熟练掌握，仅需数小时即可完成96个样本的分析，非常适合临床环境下的高通量需求。随着该技术的不断发展，它为液体活检领域开辟了道路，可用于探索微小RNA及其他核酸作为疾病生物标志物的应用。

circulating-microrna-quantification-using-dna-binding-dye-chemistry

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

微RNA循环使用定量DNA结合染料化学和液滴的数字PCR

本文介绍了一种优化的多重逆转录定量PCR（qRT-PCR）方案，结合微流控平台，作为检测microRNA（miRNA）表达水平的高通量筛选工具，具有成本低、耗时短的优点，尤其适用于样本量有限的情况。...

高通量 microRNA 表达谱分析：在 Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs 上进行纳升级优化多重 qRT-PCR

在本视频中，我们介绍了一种逐步生成乳化纳米液滴的实验方法，用于通过数字聚合酶链式反应（dPCR）检测目标核酸。...

微滴数字聚合酶链式反应：一种生成纳米微滴PCR反应以检测稀有肿瘤突变的方法

在本视频中，我们演示双通道数字PCR（ddPCR）技术——这是传统PCR技术的一种改进方法，可用于同时检测两种不同的遗传标志物。单个PCR反应被分割成纳升级大小的乳化液滴，每个液滴独立进行扩增，通过检测部分液滴中不同颜色的荧光扩增信号，计算出目标序列的初始浓度。...

双重数字PCR同时定量双基因标志物

microRNA（miRNA）是一类广泛保守的调控分子。本文介绍一种miRNA克隆方法，该方法依赖于两个高效的连接步骤，随后进行高通量测序。本方法可实现miRNA的全基因组范围内精确量化。...

小RNA分子的高效连接用于基于高通量测序的微小RNA定量

循环microRNA最近已成为多种癌症及其他疾病的有前景的新型生物标志物。本文旨在讨论三种不同的基于探针的实时PCR平台和方法，这些平台和方法可用于定量并确定循环microRNA的丰度。...

基于探针的实时PCR方法用于microRNA的定量检测

我们描述了一种具有简化（模拟）读出方式的终点数字检测方法，用于定量核酸。我们使用标准的qPCR仪对基于液滴的数字检测进行整体荧光测量，并通过显微镜确认结果。...

数字核酸定量检测的简易批量读取方法

本报告描述了一种利用定量实时逆转录PCR（可选是否进行预扩增）测定血浆miRNA绝对水平的实验方案。该方案有助于更准确地理解血浆miRNA的数量，并允许对来自不同研究或实验室的相应数据进行定性评估。...

使用定量实时逆转录PCR对中国猕猴血浆中微小RNA水平进行绝对定量

循环microRNA作为心血管疾病和急性心肌梗死的生物标志物已展现出良好的应用前景。在本研究中，我们描述了一种用于从心血管疾病患者血清中提取miRNA、逆转录及数字PCR的实验方案，以实现对miRNA的绝对定量。...

数字PCR用于急性心肌梗死和心血管疾病中循环微小RNA的定量分析

本文介绍了一种检测患者生物流体（生物液体）中循环DNA内肿瘤体细胞突变的实验方案。我们基于微滴数字聚合酶链式反应（dPCR）的方法可定量检测肿瘤突变的等位基因频率（MAF），为肿瘤的诊断以及对肿瘤治疗反应的时序性监测提供一种微创的补充手段。...

患者生物流体中肿瘤相关循环DNA的检测与监测

本文介绍了一种用于测定单个细胞中线粒体（mt）DNA绝对拷贝数及mtDNA缺失异质性水平的实验方案。...

使用数字微滴聚合酶链式反应测量单细胞线粒体DNA拷贝数与异质性

本方案详细描述了使用反向引物通过数字液滴PCR（dd-PCR）精确定量细胞中环状RNA（circRNA）水平的方法。...

利用数字滴定PCR定量环状RNA

学习使用液滴数字PCR技术定量检测血浆或血清中的循环微RNA。该方法具有高灵敏度，无需内参基因即可检测低丰度微RNA，为癌症早期诊断和生物标志物研究提供可靠工具。

利用DNA结合染料化学法和液滴数字PCR定量循环微小RNA

探索更多视频