微RNA循环使用定量DNA结合染料化学和液滴的数字PCR

该程序的总体目标是使用液滴数字 PCR 技术定量循环的 microRNA 和生物体液，例如血浆或血清。该方法可以帮助回答生物市场领域的问题。通过识别诊断和预后、生物营销癌症。

该技术的主要优点是灵敏度高。它还可用于定量丰度较低的 microRNA，而无需雌雄同体参考基因。这种方法的意义延伸到癌症诊断，因为它有可能识别早期癌症患者。

它也可以应用于其他疾病，例如神经系统或心脏疾病。一般来说，个体在热循环步骤之前需要注意液滴的处理，以避免它们被破坏。因此，液滴生成的可视化演示至关重要，因为液滴可能会因粗心作或过快的移液而被破坏。

通过分离血浆或血清 microRNA 开始此过程。然后按照随附文件中的说明反向转录和稀释它们。从冰箱中取出 EvaGreen 预混液、microRNA 引物组和 cDNA，让它们在室温下解冻。

解冻后，将预混管倒置数次。然后离心所有试剂。根据随附文件中的说明制备液滴、数字或 ddPCR 混合工作溶液。

准备足够容纳多达 8 个样品的样品，每种条件使用无模板对照加上过量的 10%组装后，彻底混合并离心 ddPCR 混合物。请注意，由于该技术的高重现性，因此不需要技术复制。离心后，将 12 μL ddPCR 混合物分配到 96 孔 PCR 板的每个孔中。

向每个孔中加入 8 微升稀释的 cDNA 模板。然后将液滴发生器小柱插入小柱支架中。将每个制备好的样品小心地转移到微滴发生柱的中间行 20 μL。

避免将气泡引入孔底。用 70 微升液滴发生器油填充底行的每个油井。将垫圈钩在墨盒支架上。

插入液滴发生器并盖上盖子以开始液滴生成。液滴生成完成后，打开盖子，从液滴发生器中取出液滴发生器，然后取下一次性垫圈。小柱的顶部孔包含液滴。

将 40 μL 从 8 个顶部孔中的每一个缓慢平稳地转移到 96 孔 PCR 板的单柱中。立即用箔纸密封板以避免蒸发。在密封板后 30 分钟内，使用随附文件表 3 中描述的 PCR 方案开始热循环。

打开微滴检测仪的电源。然后将板从热循环仪移动到微滴读数仪。将含有 PCR 后液滴的 96 孔 PCR 板放入微滴读数仪的板支架底部。

将板支架的顶部放在 PCR 板上。用力按下两个释放卡舌，将 PCR 板固定在支架中。从系统 PC 启动 QuantaLife 软件。单击 Setup 并打开模板数据文件，其中包含有关样品、靶基因和检测的信息。

在左侧导航栏中，选择 Run （运行）。将出现 Run Options 窗口。从 Dye Set（染料组）菜单中，选择 EVA，然后单击 OK（确定）开始液滴读取。

运行完成后，使用分析软件中的 2D 振幅图选择正液滴。要选择正向快捷批处理，请使用左侧导航栏中的套索工具。接下来，单击 Events（事件）选项卡以检查阳性和总 Droplet 的数量。

通常使用无探针 ddPCR 获得 18， 000 个液滴的总数。然后单击 Concentration（浓度）选项卡以可视化最终的浓度样品。最后，使用 Export.

CSV 导出 microRNA 浓度值。在 58 和 60 摄氏度的退火温度下，使用 0.5 和 1 微升引物浓度对两个血浆样品 S1 和 S2 中的 mRNA miR-181a-5p 进行定量。该图显示了每种条件下扩增反应中每微升 microRNA 的拷贝数。

每个样品的 PCR 阳性液滴以蓝色显示，阴性液滴以黑色显示。从这里可以看出，对照样品没有预期的阳性液滴。在 60 摄氏度下使用 0.5 或 1 μL 引物进行 PCR 可更好地分离阳性和阴性液滴。

在此图中，误差线表示泊松 95% 置信区间。在这里，将蓝色显示的阳性液滴数与绿色显示的液滴总数进行比较。综上所述，这些数据表明，液滴式数字 PCR 可用于确定每微升生物体液中 microRNA 拷贝数的绝对数量。

观看此视频后，您应该对如何使用微滴式数字 PCR 进行 mRNA 定量有很好的了解。一旦掌握，就可以在短短几个小时内分析 96 个样品，这是临床环境的最佳输出。每次开发后，该技术都为液体活检领域铺平了道路，以探索 microRNA 和其他核酸作为疾病生物标志物。