利用DNA结合染料化学法和液滴数字PCR定量循环微小RNA

本实验的总体目标是利用微滴数字PCR技术，对血浆或血清等生物液体中的循环microRNA进行定量分析。该方法有助于解决生物标志物研究领域中的相关问题，通过鉴定诊断性和预后性生物标志物，应用于癌症研究。

该技术的主要优势在于其高灵敏度。它能够定量检测丰度较低的微小RNA，且无需依赖内参基因。该方法的应用前景涵盖癌症诊断，因为它有望识别出处于癌症早期阶段的患者。

该方法也可应用于其他疾病，如神经或心脏类疾病。通常，个体在热循环步骤前需注意液滴的操作，以避免液滴破裂。因此，液滴生成过程的可视化演示至关重要，因为操作不慎或移液过快均可能导致液滴破坏。

首先进行血浆或血清中 microRNA 的分离，然后按照随附文件所述进行逆转录和稀释。从冷冻柜中取出 EvaGreen 预混液、microRNA 引物组和 cDNA，并在室温下解冻。

解冻后，将主混合液管颠倒数次，然后离心收集所有试剂。根据随附文件中的说明，配制液滴数字PCR（ddPCR）工作溶液。

每种条件准备足够的样本，最多可处理八个样本，并为每种条件设置一个无模板对照，额外增加10%的过量。组装完成后，充分混匀并离心ddPCR反应体系。由于该技术具有高度重复性，无需设置技术重复。离心后，将12 µL ddPCR反应体系加入96孔PCR板的每个孔中。

向每个孔中加入8 µL稀释的cDNA模板。然后将液滴生成仪卡盒插入卡盒架中。向液滴生成仪卡盒的中间一排，小心转移20 µL每种制备好的样品。

避免在孔底部引入气泡。用70微升的液滴生成油填充底行的每个油孔。将垫圈钩在卡盒架上。

将 cartridge 插入液滴生成仪中，合上盖子以开始生成液滴。液滴生成完成后，打开盖子，从液滴生成仪中取出 cartridge，并移除一次性密封垫。cartridge 的上层孔中含有生成的液滴。

从八个顶部孔中每个孔缓慢而平稳地转移40微升至一个96孔PCR板的单列中。立即用铝箔密封该板以防止蒸发。在密封板后的30分钟内，开始使用随附文件中表三所述的PCR程序进行热循环。

打开液滴读取仪电源。然后将反应板从热循环仪转移至液滴读取仪。将含有扩增后液滴的96孔PCR板放入液滴读取仪的板架底座中。

将板架的上部放在PCR板上，用力按下两侧的释放卡扣，以固定PCR板。从系统PC启动QuantaLife软件，点击“Setup”（设置），打开包含样品、目的基因和检测信息的模板数据文件。

从左侧导航栏中选择“运行”。此时将出现“运行选项”窗口。在“染料组”菜单中选择 EVA，然后单击“确定”以开始液滴读取。

运行完成后，使用分析软件中的二维振幅图选择阳性液滴。选择阳性液滴时，使用左侧导航栏中的套索工具。然后，点击“Events”标签以查看阳性液滴和总液滴的数量。

使用无探针的 ddPCR 通常可获得总计 18,000 个液滴。然后单击“浓度”选项卡以查看样品浓度的最终结果。最后使用导出功能。

用于导出微小RNA浓度值的CSV文件。使用0.5和1微升引物浓度，在58和60摄氏度退火温度下，对两个血浆样本S1和S2中的mRNA miR-181a-5p进行了定量。该图展示了每种条件下扩增反应中每微升微小RNA的拷贝数。

每个样本的PCR阳性液滴显示为蓝色，阴性液滴显示为黑色。由此可见，对照样本中无阳性液滴，符合预期。在60摄氏度下进行PCR反应时，无论使用0.5微升还是一微升引物，均可获得更好的阳性和阴性液滴分离效果。

在本图中，误差线代表泊松分布的 95% 置信区间。此处，以蓝色显示的阳性液滴数量与以绿色显示的总液滴数量进行了比较。综合这些数据表明，液滴数字 PCR 可用于确定每微升生物流体中 microRNA 的绝对拷贝数。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何使用微滴数字PCR进行mRNA定量。一旦熟练掌握，仅需数小时即可完成96个样本的分析，这在临床环境中具有理想的检测通量。随着每一次技术进步，该方法为液体活检领域的发展奠定了基础，可用于探索微小RNA及其他核酸作为疾病生物标志物的应用。