无菌实验室技术：电镀方法

[旁白]该协议将无菌技术纳入用于分离、繁殖或枚举细菌和噬菌体等微生物的电镀方法中。程序包括条纹铺板细菌培养物以分离单个菌落。倒入电镀以确定细菌的浓度。并铺平电镀以枚举活菌落。软琼脂覆盖层用于分离噬菌体并枚举斑块，同时复制电镀以相同的空间模式将细胞从一个板转移到另一个板。最终，这些技术在培养微生物方面的实际应用范围从环境中细菌的鉴定到分子遗传学和高通量生物测定的技术进步。

- 一般来说，刚接触这些电镀方法的人可能会遇到困难，因为作需要仔细和协调的动作，避免接触非无菌表面。学习这些常规程序需要培训和实践。我的实验室协调员 Kris Reddi 博士将演示这些程序。

- [旁白] 通过了解实验室规则和安全预防措施（包括生物危害分类、废物净化和处置）开始与微生物打交道。确认用于电镀程序的所有仪器、溶液和介质都是无菌的。还要建立一个清晰的工作空间。用消毒剂清洁。设置一个本生灯，将一根管子连接到燃气管道上，用正确标记的材料安排必要的用品。继续用消毒肥皂和温水彻底洗手。首先，用温水弄湿双手，然后涂抹并彻底涂抹肥皂。用力揉搓手，使所有表面产生摩擦，包括拇指、指背、手背和指甲下方。然后彻底冲洗以去除残留的肥皂，并使用从支架上分配的纸巾擦干。最后，用干净的纸巾关上水龙头。条纹板程序旨在通过简单的机械分离从混合种群中分离细菌或菌落的纯培养物。从四摄氏度的冷箱中取出琼脂板，预热至室温。从一系列仪器中选择一种工具，用于划线板。确保盘子干燥，盖子上没有冷凝水。在边缘周围标记琼脂板的底部。熟练后，使用单个板处理多个样品。然后点燃本生灯来点燃金属环。从金属环三到四英寸处开始，将电线放在蓝色锥体的尖端，蓝色锥体是本生灯火焰最热的部分。当金属变红时，移动电线，使火焰接近环。要冷却循环，请触摸琼脂培养基的边缘，以产生嘶嘶声。继续在环上捡起接种物。提起板的下半部分。将环从边缘来回移动到板第一象限的中心。将倒置的板放回盖子上。重新燃烧金属环。将培养皿旋转 90 度。使用来回模式触摸最后一条条纹末尾附近的环，交叉第一象限中条纹的最后一半，然后进入空的第二象限。填满第二象限后，放下盘子。对第三象限和第四象限重复条纹程序，同时避免与第一象限接触。要用无菌扁平牙签划线，请用拇指和无名指与介质成 10 至 20 度角轻轻握住窄端，用宽端划出象限。将板倒置回象限之间的盖子上，并适当处理牙签。继续将条纹板倒置孵育。倒板程序枚举了单个板表面和琼脂内菌落形成单位的总数。将定时器设置为 10 分钟，然后将 18 毫升融化的琼脂培养基从 55 摄氏度的水浴转移到 48 摄氏度的热块中并平衡 10 分钟。在无菌培养皿的底部贴上标签。如果适用，请包括稀释系数。现在将一毫升样品分配到培养皿的中间。盖上盖子。从融化的琼脂管上取下盖子，并将开管的边缘穿过火焰。小心地将琼脂倒入培养皿中。盖上盖子，然后通过轻轻旋转板将样品与琼脂混合。等待 30 分钟，让琼脂凝固。琼脂凝固后，倒置板并将其放在温暖的房间中。铺板旨在分离小样品体积内所含的微生物，将产生的菌落均匀分布在琼脂表面。将板平衡至室温并适当标记。将板放在转盘上。将 0.1 毫升样品移液到琼脂中心并盖上盖子。将吸头弹出到废物容器中。将金属棒浸入 70% 乙醇的烧杯中，覆盖撒布机的整个底部和茎的第一英寸，然后沥干。通过本生灯的火焰点燃多余的乙醇。接下来，打开琼脂板的盖子，通过沿着边缘附近的边缘将撒布机接触琼脂来冷却撒布机。慢慢旋转转盘。将撒布器轻轻地放在琼脂表面，在转盘旋转时，通过来回运动将样品逐渐均匀地铺在整个板上。盖上盖子，让样品彻底吸收至少五分钟。然后，孵育倒置板。首先，在琼脂平板上适当贴上标签。打开琼脂板的盖子。然后打开预先消毒的玻璃珠容器，点燃边缘。小心地将 10 至 12 颗无菌玻璃珠分配到琼脂板上。在盖上盖子之前，盖上板盖并点燃玻璃珠容器的边缘。现在，将样品移液到琼脂的中心。以水平运动，在琼脂表面轻轻摇动珠子七次。如果作得当，该过程听起来像摇晃沙球。将板旋转 60 度，再次水平摇晃七次。再次将板旋转 60 度并重复摇晃。验证样品是否被吸收。然后，将受污染的珠子倒入含有 10% 氯漂白剂的标记收集烧杯中。孵育倒置板。斑块测定通常用于检测和量化细菌噬菌体。将指示菌培养至指数相并储存在冰上。然后，标记两个无菌微量离心管噬菌体和对照，并分别向每个管添加 50 微升噬菌体样品或缓冲液。接下来，在烧瓶中旋转细菌培养物，然后将等分试样的细菌转移到无菌管中，轻轻涡旋指示细菌，然后向每个吸收管中加入500微升细菌。轻弹试管进行混合。切勿涡旋或用力移液噬菌体样品。将噬菌体细菌混合物在适合指示菌株的温度下孵育20分钟。同时，将两个软琼脂管从 55 摄氏度的水浴转移到 48 摄氏度的加热块中。平衡10分钟。标记两个预平衡至室温的无冷凝营养硬琼脂平板。从加热块上取下一根软琼脂管，检查内容物是否太热而无法触摸。接下来，将混合物从噬菌体吸收管无菌转移到软琼脂管中。然后，在手掌之间快速旋转以混合内容物。一只手拿着管子，另一只手打开硬琼脂板的盖子。立即将管中的全部内容物倒在硬琼脂板的表面上。快速而轻柔地摇晃盘子。盖上盖子，将板放在水平面上 30 分钟，直到软琼脂凝固。接下来，通过将对照混合物转移到软琼脂管中来重复对照吸收管的过程。混合它，将内容物倒在硬琼脂板上，摇晃它，让软琼脂凝固 30 分钟。检查板是否形成斑块。要从异质混合物中分离斑块，请用无菌牙签小心地打孔中心，并将接种物转移到含有 100 微升噬菌体缓冲液的无菌微量离心管中。通过根据需要连续稀释重复斑块测定三到六次来继续纯化该裂解物。复制铺板通过允许将初级板上的细胞生长与次级板上的细胞生长进行比较，从而利用了可选择的表型。在板底部标记一个网格，标记主板，并为生成的方块编号。现在，使用无菌技术从烧杯中取出预先消毒的牙签，用细胞样本轻拍每个方块的中心，然后将牙签丢弃在适当的废物容器中。孵育主板。堆叠主板和所有副板。在板的下半部分的侧面放置一个方向标记。现在从包装纸上取下一块无菌平绒布，将其放在圆柱形块上。接下来，放置支架，将支架上的标记与块上的标记对齐。注意块和支架上的方向标记。接下来，从主板上取下盖子。将板和块上的方向标记对齐。降低板，使琼脂表面接触平绒布。用指尖轻轻但均匀地按下主板的背面，然后小心地将其从块上提起。确认在天鹅绒上可以看到细胞的印记。盖上盘子上的盖子。现在，在平绒布上用每个辅助板依次重复该协议。使用来自主板的细胞的天鹅绒印模接种多达八个次级板，从最不利的底物到最有利的底物排序。最后，作为阳性对照，对于该系列中的最后一个板，使用琼脂培养基，所有测试的菌株都应在其中生长。将倒置的板粘在一起并孵育。检查次级板是否生长。关闭本生灯，然后收起所有用品。将受污染的实验室服装、玻璃器皿和危险废物放入适当的处置容器中。用消毒剂清洁工作区域。最后，用消毒肥皂和温水彻底洗手。粘质沙雷氏菌是一种革兰氏阴性杆状变形杆菌，可产生一种称为蛋白蛋白的红色色素。它常见于浴室和浴帘上。在本例中，条纹板技术在第四象限中生成单个菌落。对从公共饮水机收集的水样中存在的细菌的分析使用倒板技术。注意菌落外观的差异。表面菌落大而呈圆形，而一些表面菌落非常小且形状不规则。展板技术是富集、选择和筛选实验的重要组成部分。例如，古巴卡巴纳法是重组 DNA 技术中经典蓝白屏中的一种差异化工具。噬菌体 T4 是一种毒性双链 DNA 噬菌体，以大肠杆菌的形式感染其宿主以裂解和释放后代噬菌体。这种在EHA琼脂上的斑块测定显示，在直径约为一毫米的清除区中存在噬菌体。在没有感染噬菌体颗粒的情况下，细菌生长导致软琼脂中细胞混浊悬浮，其中不可见离散菌落。在软琼脂覆盖技术中，斑块形态确实有所不同。例如，在这里，相同的分枝杆菌宿主菌株在微生物噬菌体破坏剂与分枝杆菌噬菌体 MSSS 存在下产生不同的斑块形态。复制电镀的力量在于同时筛选大量微生物。在这种情况下，对四种假单胞菌菌株进行了一式两份的测试，以在三种不同的碳源上生长。乙酰胺、乳糖和甘氨酸。在这里，主板是完整的YTA培养基，如图所示接种了四种菌株。这些菌株在补充有单一碳源乙酰胺、乳糖或甘氨酸的最小MSA培养基的复制板上显示出可变的生长模式。所有菌株都在最后一个阳性对照板上生长，确认细胞已转移到该系列中的所有二级板上。这些复制板结果的制表详细说明了对不同野生型菌株的同时筛选，以满足特征生长要求。

- 观看此视频后，您应该对如何在不污染培养基或培养物的情况下执行电镀程序，以及如何在实验室中为任何给定的实验任务使用适当的电镀方法。精通这些技术需要练习。然而，通过适当的培训，本视频中描述的电镀程序将成为在实验室工作台上工作时的第二天性。