昆虫幼虫体内表达荧光素酶细菌负荷量的活体检测

测量 体内 细菌负荷，从预先感染了卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG）的无菌昆虫幼虫开始 lux BCG lux 是 一种基因改造的 分枝杆菌属 bovis 表达荧光素酶（一种产生生物发光的酶）的卡介苗（BCG）菌株。

将昆虫幼虫转移至含有钢珠的缓冲液裂解基质管中。使用匀浆器匀浆幼虫，使细胞内组分（包括细菌）释放到缓冲液中。

离心试管以收集匀浆，并将其转移至发光仪专用试管中。

用含有去污剂的缓冲液洗涤基质管，以溶解细胞碎片并释放残留的细菌。

将各组分合并至同一发光仪检测管中，并加入荧光素酶底物。底物进入细菌后与荧光素酶相互作用，产生生物发光。将检测管放入发光仪中，测定生物发光信号。

光度计测量发射光的强度，并计算相对光单位（RLU），以指示 体内 昆虫幼虫中卡介苗的负荷量

将稀释后的匀浆悬液涂布于含哌拉西林的琼脂平板上，孵育以选择性培养出清晰可见的卡介苗（BCG）菌落。平板上的菌落代表菌落形成单位（CFU）。RLU与CFU的比值可将生物发光信号与细菌活力相关联。

每隔24小时，随机选取五只感染的幼虫，用浸有70%乙醇的棉签轻轻擦拭幼虫表面进行表面消毒。将幼虫分别放入含有800微升无菌PBS的2毫升裂解基质管中。然后，使用匀浆器以每秒6米的速度匀浆60秒。

将裂解管在 3,500 × g 条件下离心 5 秒，以去除管盖上的匀浆液，并小心地将匀浆液分别转移至 5 支无菌的发光检测管中。保留 100 微升匀浆液于一支无菌的 1.5 毫升反应管中。用 1 毫升 PBST 洗涤裂解基质管，回收残留的匀浆液，并用移液器转移至相应的发光检测管中。

涡旋混合发光仪检测管，然后用发光仪测定匀浆液的生物发光值。接着，在24孔培养板中，用PBST对预留的100微升匀浆液进行10倍系列稀释。取10微升稀释液滴加至每块Middlebrook 7H11琼脂平板，使用无菌涂布棒均匀涂布。在37°C下孵育两周。

之后，计数菌落形成单位。