在昆虫幼虫中表达荧光素酶的细菌体内负荷的测量

要测量体内细菌负荷，请从预先感染卡介苗或卡介苗勒克斯的灭菌昆虫幼虫开始。 卡介苗勒克斯是一种转基因牛分枝杆菌卡介苗菌株，表达荧光素酶（一种产生生物发光的酶）。

昆虫幼虫转移到含有钢球的含有缓冲液的裂解基质管中。使用均质器对幼虫进行均质化，将细胞内成分（包括细菌）释放到缓冲液中。

心管以收集匀浆并将其转移到光度计管中。

用含洗涤剂的缓冲液清洗基质管，以溶解细胞片段并释放残留细菌。

将馏分合并在同一个光度计管中并加入荧光素酶底物。底物进入细菌并与荧光素酶相互作用，产生生物发光。将管子装入光度计并测量生物发光

光度计测量发射光的强度并计算相对光单位或 RLU——指示昆虫幼虫中卡介苗的体内负荷。

稀释的匀浆悬浮液铺在含有哌拉西林的琼脂平板上并孵育以选择性地培养 BCG 作为不同的菌落。板上的菌落代表菌落形成单元或 CFU。RLU 与 CFU 的比率将生物发光与细菌活力相关。

每24小时随机抽取5只受感染的幼虫，用棉签浸泡70%乙醇对幼虫表面进行温和消毒。将幼虫单独放入含有800微升无菌PBS的两毫升裂解基质管中。然后，使用均质机以每秒 6 米的速度将幼虫均质化 60 秒。

裂解管以3,500倍g离心5秒钟，从盖子上取出匀浆，然后小心地将匀浆分别倒出到五个无菌光度计管中。在无菌的 1.5 毫升反应管中保留 100 微升匀浆。通过用一毫升PBST洗涤裂解基质管来回收任何剩余的匀浆，然后移液到相应的光度计管中。

旋光度计管，并在光度计上测量匀浆的生物发光。然后，使用 PBST 在 24 孔培养板中制备保留的 100 微升匀浆的 10 倍连续稀释液。将 10 微升稀释液移液到每个 Middlebrook 7H11 琼脂平板上，并使用无菌平板撒布机进行铺展。在37摄氏度下孵育两周。

之后，计算菌落形成单位。