破译和成像发病机制与盘带脓肿分枝杆菌斑马鱼胚胎

该程序的总体目标是研究和比较脓肿分枝杆菌菌株的毒力，并使用透明斑马鱼胚胎在体内描述这些细菌与宿主先天免疫系统之间的相互作用。这是通过首先制备均质细菌 Inocular 来实现的。接下来，在受精后 30 小时向胚胎静脉注射细菌悬浮液。

此外，为了更准确地研究巨噬细胞在感染控制中的作用，使用基于 lipo choate 的注射程序来产生巨噬细胞耗尽的胚胎。最后，使用荧光和共聚焦显微镜制备和成像受感染的胚胎，以监测感染的进展。最终，可以获得的结果显示了荧光吞噬细胞和脓肿分枝杆菌之间的特异性相互作用，无论是作为单个底胞还是透明胚胎内的蛇形索。

与小鼠等其他动物模型相比，使用斑马鱼的主要优点是它可以专门实时研究感染过程，并研究微细菌脓肿与微噬细胞或中性粒细胞之间的特定相互作用的图像。此步骤是斑马鱼后续注射压力的关键问题。由于粗大的脓肿分枝杆菌极易形成大聚集体并产生代码，因此需要进行特异性处理以在显微注射之前制备均质且定量受控的接种物。

为了制备脓肿分枝杆菌，将 150 平方厘米组织培养瓶中呈指数增长的培养物收集到 50 毫升无菌塑料管中，并在 4， 000 倍 G 和室温下离心 15 分钟。使用一毫升 Middlebrook 七 H 九，补充有 OADC 富集，加上吐温 80，以下简称七 H 九培养基，以重悬沉淀和 Eloqua。将 200 微升细菌悬浮液放入 1.5 毫升试管中，用 26 号针头将每个 ALI 四方细菌悬浮液匀浆 15 次。

然后，使用水浴对 3 次进行超声处理，每次 10 秒，每次休息 10 秒。在此期间，加入 1 毫升 7 H 9 培养基并短暂涡旋，然后以 100 倍 G 离心 3 分钟。小心收集含有上清液的分枝杆菌以避免结块，并将均质悬浮液拉入 50 毫升无菌塑料管中。

悬浮液以 4， 000 倍 G 离心 5 分钟，并使用 200 微升 7 H 9 培养基重悬沉淀，评估最终细菌接种物。根据文本协议，这种方法的视觉演示至关重要，因为这些步骤很难学习，因为在显微镜下对斑马鱼胚胎注射的精确温和作以及显微注射技术的获得需要时间才能在大约 24 小时内进行脓肿分枝杆菌的显微注射。受精后或 HPF，使用镊子将胚胎涂在 100 毫米培养皿中，并保持在 28.5 摄氏度。

将 30 个 48 HPF 胚胎转移到一个 V 形定位室中，该定位室装满了 25 毫升鱼水，每升含有 270 毫克的 trica，并带有一个夹住的微型装载器尖端。将胚胎正确放置在通道中，以便于作。使用 0.05% 的 PBST 在 80 之间，将微细菌接种物稀释至所需的 CFU 以输送，并加入 10% 酚红，以检查使用微型加载器尖端的正确注射。

在显微注射针头中加入 5 至 10 微升细菌接种物。将显微注射针连接到与注射器相连的微型纵器的支架上，用细镊子折断注射针的顶部。获得 5 至 10 微米的开口直径。

通过调整显微注射压力和时间来校准注射体积。然后，为了获得所需的注射量，测量喷入一个胚胎蛋黄的液滴的直径，以显微注射到小静脉中。将胚胎置于腹侧朝向针头的位置，并将针尖靠近泌尿生殖道开口。

然后轻轻地将针尖推入胚胎，直到它刚好刺穿 coddle 静脉区域。然后输送所需体积的细菌悬浮液，通常为 1 到 3 纳升，每升含有约 100 个 CFU。根据文本方案孵育和监测胚胎，以在 24 HP 下进行 lipo Choate，耗竭巨噬细胞和胚胎。命运，胚胎，并将它们转移到装满鱼水和 trica 的注射皿中。

然后将它们的背侧朝下。涡旋脂质体包埋的氯膦酸盐溶液后，加载微毛细管针头并校准注射体积。如前所述，刺穿 coddle 静脉区域，并注入 2 到 3 升溶液。

重复注射 3 次。在 28.5 摄氏度下孵育胚胎，并在感染前使用荧光显微镜控制巨噬细胞的适当消耗。如本视频前面所示，在所需时间点列举集落形成单位或 CFU。

根据感染情况收集 5 个胚胎，并将每个胚胎转移到 1.5 毫升微量离心管中。在以每升 300 至 500 毫克的浓度对胚胎实施安乐死后，通过在冰上孵育 10 分钟来冷冻麻醉胚胎。特里卡。使用无菌水在新试管中清洗胚胎两次。

接下来，在一个 XPBS 中去除 2%Triton X 100 的水到每个胚胎中，并使用 26 号针头匀浆组织以完全裂解。离心悬浮液后，使用一个 X-P-B-S-T 重悬沉淀。然后将均质在 Middlebrook 7 H 10 OADC 上进行板连续稀释。

补充有 B-B-L-M-G-I-T Panta 在 30 摄氏度下孵育板四天，然后计数菌落以进行脓肿分枝杆菌感染的实时成像，将 trica 麻醉胚胎置于 1% 低熔点的 aros 中，置于 35 毫米玻璃底培养皿中，用于倒置显微镜或用于正置共聚焦显微镜的单腔凹陷载玻片。将胚胎定向到所需位置，并用含有 trica 的鱼水覆盖凝固的 aros，用于脓肿分枝杆菌感染的固定成像。对胚胎实施安乐死后，将它们转移到 1.5 毫升微量离心管中，并将胚胎固定在 4% 多聚醛中一个 X-P-B-S-T 中两个小时。

在室温下，用一个 X-P-B-S-T 洗涤胚胎两次 10 分钟，以去除多聚醛，以依次保持组织的完整性和荧光。根据每种条件，将胚胎在浓度递增的甘油溶液中孵育 10 分钟。将胚胎嵌入 50% 甘油中，置于观察室中。

最后，使用带有 10 倍物镜的荧光显微镜或带有 40 倍或 63 倍物镜的荧光共聚焦显微镜进行胚胎的连续荧光采集和透射成像。为了研究和比较粗糙和光滑的 M 脓肿变体的毒力，在 30 个 HPFC 熟练的胚胎中静脉注射荧光细菌。与光滑的变体相比，粗糙的变体会诱导更强烈和致命的感染，并在中枢神经系统内形成脓肿。

通过列举 CFU 或确定相关的荧光像素计数来量化毒力的差异。这表明粗略变异的细菌负荷更高 如图所示，可以通过视频显微镜以无创方式监测和成像脊髓形成的动力学，证明了粗略变异在细胞外复制的倾向，如图所示。巨噬细胞耗尽的胚胎感染粗大的 M 脓肿导致细菌负荷和脐带产生大幅增加，并导致幼虫迅速死亡。

这清楚地表明，需要巨噬细胞来控制脓肿分枝杆菌感染，以实时观察巨噬细胞与脓肿分枝杆菌之间的相互作用。可以使用产生红色荧光巨噬细胞的 EG one M cherry 转基因系。感染诱导巨噬细胞的显着募集，对单个细菌进行有效吞噬作用，而分枝杆菌索代表了 am 脓肿进化的一种策略，以避免在发育后被吞噬。

这项技术为探索编码作为免疫逃避新机制的重要作用铺平了道路。多亏了斑马鱼感染的痣，现在可以观察和描述代码在分枝杆菌脓肿发病机制中的体内贡献。