解析与成像Mycobacterium abscessus在斑马鱼胚胎中的致病机制及索状结构

本实验的总体目标是研究并比较脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus）菌株的毒力，并利用透明斑马鱼胚胎在体内描述这些细菌与宿主先天免疫系统之间的相互作用。首先制备均一的细菌接种物，随后在受精后30小时将细菌悬液通过静脉注射注入胚胎中。

此外，为了更精确地研究巨噬细胞在感染控制中的作用，采用基于脂质体的注射方法以获得巨噬细胞耗竭的胚胎。最后，对感染后的胚胎进行制备，并利用荧光显微镜和共聚焦显微镜成像，以监测感染的进展过程。最终可获得的结果展示了荧光吞噬性细胞与脓肿分枝杆菌（M. abscessus）之间的特异性相互作用，这些相互作用可表现为单个杆菌形态，或在透明胚胎内呈蛇形索状结构。

与其他动物模型（如小鼠）相比，使用斑马鱼的主要优势在于能够实时观察感染过程，并对脓肿分枝杆菌与巨噬细胞或中性粒细胞之间的特异性相互作用进行成像研究。这一步骤对于后续斑马鱼注射时的压力控制至关重要。由于粗糙型脓肿分枝杆菌极易形成大尺寸聚集体并产生菌膜，因此在显微注射前必须进行特定处理，以制备均一且定量可控的接种物。

为了制备脓肿分枝杆菌，将150平方厘米组织培养瓶中处于对数生长期的培养物接种至50毫升无菌塑料管中，在4,000 × g、室温条件下离心15分钟。使用1毫升添加OADC增补剂并含吐温80的Middlebrook 7H9培养基（下文简称7H9培养基）重悬菌体沉淀并混匀。取200微升细菌悬液加入1.5毫升离心管中，用26号针头将每份ALI四联细菌悬液反复吹打15次以实现均质化。

然后使用水浴超声处理三次，每次10秒，间隔10秒。每次超声后，加入1毫升7H9培养基，短暂涡旋混匀，然后以100 × g离心3分钟。小心收集含有分枝杆菌的上清液，避免混入团块，并将均一的悬液转移至50毫升无菌塑料管中。

将悬浮液在4,000 × g条件下离心5分钟，并用200 µL的7H9培养基重悬沉淀，以评估最终的细菌接种量。根据文本方案，该方法的可视化演示至关重要，因为这些步骤学习起来较为困难，需要在显微镜下对斑马鱼胚胎进行精确而轻柔的注射操作，且掌握显微注射技术需要一定时间。在受精后约24小时（hpf），使用镊子将胚胎转移至直径100 mm的培养皿中，并置于28.5 °C环境下培养。

用剪去尖端的微量移液器吸头，将30至48小时后（HPF）的胚胎转移至装有25毫升含270毫克/升三卡的V型定位腔室中。将胚胎正确放置于通道内，以便于后续操作。使用含0.05% PBST的溶液将微生物接种液稀释至目标CFU浓度，并加入10%酚红，以便通过微量移液器吸头观察注射是否准确。

用5到10微升的细菌接种液填充显微注射针。将显微注射针连接至与注射仪相连的显微操作仪的针夹中，并使用精细镊子折断针尖顶端，以获得5至10微米的开口直径。

通过调整显微注射压力和时间来校准注射体积。然后，为获得所需的注射体积，测量注入一个胚胎卵黄中液滴的直径，以进行绒毛尿囊膜静脉注射。将胚胎腹侧朝向针头放置，并将针尖靠近尿生殖孔。

轻轻将针尖推入胚胎，直至刚好刺破卵黄静脉区域。随后注入所需体积的细菌悬液，通常为1至3纳升，每纳升约含100个菌落形成单位（CFU）。根据文字方案孵育并观察胚胎，以进行脂多糖处理、耗竭巨噬细胞，并在受精后24小时收集胚胎，将其转移至含有三卡因（trica）的鱼水中注射皿中。

然后将它们背侧朝下放置。在涡旋混匀脂质体包封的氯膦酸盐溶液后，装填微毛细管针头并校准注射体积。按照之前演示的方法穿刺卵黄静脉区域，并注射两到三微升溶液。

重复注射三次。将胚胎在28.5摄氏度下孵育，并在感染前使用荧光显微镜检测巨噬细胞是否被有效耗竭。如本视频前面所示，在预定时间点通过计数菌落形成单位（CFUs）来进行分析。

每种感染条件下收集五个胚胎，将每个胚胎转移至一个1.5毫升的微量离心管中。在用300至500毫克/升Trica处死胚胎后，将其置于冰上孵育10分钟以进行低温麻醉。使用无菌水在新管中清洗胚胎两次。

接下来，用含2% Triton X-100的一倍浓度XPBS处理每个胚胎以去除水分，然后使用26号针头充分匀浆组织，实现完全裂解。将裂解后的悬液离心后，用一倍浓度的X-P-B-S-T重悬沉淀。随后将均质裂解液进行系列稀释，并接种于Middlebrook 7H10 OADC培养基上。

加入B-B-L-M-G-I-T Panta后，将平板在30摄氏度下培养四天，然后计数菌落。为进行M abscessus感染的活体成像，将三卡麻醉的胚胎置于含1%低熔点琼脂糖的35毫米玻璃底培养皿中，用于倒置显微镜观察，或置于单腔凹面载玻片上用于正置共聚焦显微镜观察。将胚胎调整至所需位置，并在凝固的琼脂糖上覆盖含有三卡的养鱼用水。为进行M abscessus感染的固定成像，在处死胚胎后，将其转移至1.5毫升微量离心管中，并用含4%多聚甲醛的1×PBS-T溶液固定两小时。

在室温下，用 1×P-B-S-T 缓冲液洗涤胚胎两次，每次 10 分钟，以去除多聚甲醛，从而依次保护组织完整性和荧光信号。将胚胎在浓度递增的甘油溶液中孵育，每种条件孵育 10 分钟。将包埋在 50% 甘油中的胚胎置于观察室中。

最后，使用配备10倍物镜的荧光显微镜或配备40倍或63倍物镜的荧光共聚焦显微镜，对胚胎进行荧光信号的逐层采集及透射成像。为了研究并比较粗糙型与光滑型脓肿分枝杆菌（M. abscessus）变异株的毒力，将荧光标记的细菌通过静脉注射至30个具有HPFC功能的胚胎中。与光滑型变异株相比，粗糙型变异株会引发更强烈且致死性的感染，并在中枢神经系统内形成脓肿。

毒力差异通过计数菌落形成单位（CFU）或测定与之相关的荧光像素值进行量化。这表明粗糙变异株具有更高的细菌载量。如本图所示，通过视频显微镜可以以非侵入性方式监测和成像索状结构形成的动力学过程，显示出粗糙变异株在此处表现出的胞外复制倾向。用粗糙型脓肿分枝杆菌感染巨噬细胞耗竭的胚胎会导致细菌载量和索状结构产生显著增加，并引起幼体快速死亡。

这明确表明，巨噬细胞对于控制脓肿分枝杆菌（M. abscessus）感染是必需的，以便实时观察巨噬细胞与脓肿分枝杆菌之间的相互作用。可使用 EGFP;M-Cherry 转基因品系，该品系可产生红色荧光的巨噬细胞。感染会显著募集巨噬细胞，并对单个细菌实现高效的吞噬作用，而分枝杆菌菌索则是脓肿分枝杆菌为逃避被吞噬而进化出的一种策略，在其发育完成后尤为明显。

该技术为探索编码作为免疫逃逸新机制的重要作用奠定了基础。得益于斑马鱼感染模型，现在已有可能在体内观察并描述编码在脓肿分枝杆菌致病过程中的贡献。