Name: 破译和成像发病机制与盘带脓肿分枝杆菌斑马鱼胚胎 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 了解脓肿分枝杆菌毒力比较与宿主先天免疫系统相互作用的研究方法，使用荧光和共聚焦显微镜在透明斑马鱼胚胎中进行实时成像观察。该技术可揭示巨噬细胞与病原体的动态关系。

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作者感谢 K. Kissa 提供有益的讨论以及脂质体包裹的氯膦酸盐，感谢 L. Ramakrishnan 慷慨赠送可用于表达 tdTomato 和 Wasabi 的质粒 pTEC27 与 pTEC15。本研究工作是法国国家科研署（ZebraFlam 项目 ANR-10-MIDI-009 和 DIMYVIR 项目 ANR-13-BSV3-007-01）以及欧洲共同体第七框架计划（FP7-PEOPLE-2011-ITN）资助项目（编号：PITN-GA-2011-289209）“Marie-Curie 初始培训网络 FishForPharma”的组成部分。我们还感谢 Association Gregory Lemarchal 和 Vaincre La Mucoviscidose（项目编号 RF20130500835）对 C.M. Dupont 的经费支持。

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作者无任何利益冲突需要披露。

斑马鱼最近已成为利用宽场和共聚焦成像实时研究细菌感染动态的优良脊椎动物模型系统36将分散的分枝杆菌悬液（方案2.2）与显微注射方法（方案4）相结合，可实现可重复的系统性感染，并能够后续监测和可视化感染进展过程，特别关注细菌与宿主巨噬细胞之间的相互作用。毒力 M. abscessus&#160;体内 可借助野生型的使用进行研究 金色 斑马鱼37研究相互作用 M. abscessus 以及宿主髓系细胞，可使用多种转基因斑马鱼品系，例如 Tg(mpeg1:mCherry) 以观察巨噬细胞19. 其他转基因报告基因品系，例如 as Tg(mpx:GFP)38 或 Tg(lyz:DsRed)39 分别使用绿色或红色的中性粒细胞，也可用于研究这些粒细胞在应对感染时的特定作用。
M. abscessus，尤其是粗糙型（R型）变异株，具有自然形成大...

Mycobacterium abscessus 是一种新发的病原体，可在人类中引起多种临床综合征，包括皮肤感染以及严重的慢性肺部感染，后者多见于免疫功能低下者和囊性纤维化患者1,2,3,4。M. abscessus 还被认为是导致人类医院内感染和医源性感染的主要快速生长分枝杆菌之一。此外，近年来多项报道指出，M. abscessus 可能穿越血脑屏障，并在中枢神经系统（CNS）中引发严重病变5,6。尽管属于快速生长型分枝杆菌，M. abscessus 仍表现出多种与结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）相似的致病特征，包括可在肉芽肿结构中长期潜伏以及在肺部形成干酪样病变的能力7。更令人担忧的是，M. abscessus 对抗生素的敏感性较低，导致这些&#160;感染极难治疗，治疗失败率显著升高8,9。该菌种构成重大威胁的主要原因在于其对抗生素的固有耐药性，这已成为公共卫生机构高度关注的问题10，并成为肺移植的禁忌证之一11。
M. abscessus 呈现光滑（S）或粗糙（R）的菌落形态型，可导致不同的临床结局。与S型菌株相比，R型细菌倾向于首尾相连生长，形成绳索状或 cords 状结构。12,13多项基于细胞或动物模型的独立研究揭示了R形态型的高毒力表型。14,15来自流行病学研究，最严重的病例 M. abscessus 肺部感染似乎与R变异株相关16 是唯一一种在感染宿主中被观察到可长期持续存在的变异体3形态型差异取决于表面相关糖肽脂质（GPL）的存在（S型）或缺失（R型）。12然而，由于目前用于研究的细胞/动物模型存在固有的局限性 M. abscessus 感染后，我们对R型或S型变异株的病理生理事件仍知之甚少。在免疫功能健全小鼠中的感染研究 通过 静脉或气溶胶途径给药会导致短暂定植，阻碍了&#160;使用小鼠&#160;研究持续性感染以及用于 体内 药物敏感性试验17因此，构建可用于调控宿主反应的动物模型是一项重大挑战。在此背景下，近年来已开发出多种非哺乳类感染模型，包括 黑腹果蝇18 相较于小鼠模型，斑马鱼模型具有成本低、速度快和伦理接受度高等多种优势。斑马鱼（Danio rerio感染的动物模型也已被用于通过非侵入性成像技术，对感染进程和时间顺序进行可视化观察。 M. abscessus 活体动物感染19重要的是，还建立了概念验证，以证明其适用性 体内 抗生素对...的评估 M. abscessus17,20.
在过去的二十年中，斑马鱼被广泛用于研究各种病原体与宿主免疫系统之间的相互作用21。这种替代性脊椎动物模型日益成功，得益于其提供的重大且独特的研究机遇，推动并验证了其在深入理解多种病毒和细菌感染中的应用19,22,23,24,25,26,27,28,29。与其他大多数动物模型不同，斑马鱼胚胎具有光学透明性，可实现无创荧光成像30。 这使得研究人员能够以前所未有的细节研究感染了M. abscessus的斑马鱼胚胎，最终揭示了胞外索状结构（extracellular cording），这是细菌形态可塑性的一个典型例子。索状结构代表了一种逃避免疫系统的新机制，也是促进M. abscessus急性感染致病的关键机制19。
本研究报告利用斑马鱼胚胎，介绍了解析病理生理特征的新工具和新方法 M. abscessus 感染，并研究杆菌与先天免疫系统之间的密切相互作用。首先，提供一份详细的显微注射方案，包括细菌接种物的处理、胚胎制备及感染过程 本身，介绍如下。特别适用于评估的方法 M. abscessus 通过测量宿主存活率和细菌载量等不同参数来评估毒力的方法已被呈现。特别关注如何在时空层面上监测感染的进程与转归以及宿主对感染的免疫应答 M. abscessus 使用视频显微镜。此外，为研究巨噬细胞在期间的贡献与作用 M. abscessus 感染，描述了通过遗传学或化学方法制备巨噬细胞耗竭胚胎的方法。最后，记录了利用固定或活体胚胎可视化巨噬细胞或中性粒细胞特异性相互作用的实验方案。
本报告的目的是促进进一步研究，以揭示脓肿分枝杆菌（M. abscessus）的毒力机制，特别是束状生长在引发急性且不受控制的感染过程中的作用。

<table><tbody><tr><td>BBL MGIT PANTA</td><td>BD 生物科学</td><td>245114</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白&amp;nbsp;</td><td>Euromedex</td><td>04-100-811-E</td><td></td></tr><tr><td>牛肝过氧化氢酶&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>Difco Middlebrook 7H10 琼脂</td><td>BD 生物科学</td><td>262710</td><td></td></tr><tr><td>Difco Middlebrook 7H9 肉汤</td><td>BD 生物科学</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>甲磺酸乙酯间氨基苯甲酸盐（Tricaine）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>油酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1008</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Delta Microscopie</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>酚红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319244</td><td></td></tr><tr><td>吐温 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4780</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Gibco Life Technologie</td><td>30391-023</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean 海水盐&amp;nbsp;</td><td>Aquarium Systems Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instrument Inc</td><td>BF100-78-10</td><td>1 mm 外径 × 0.78 mm 内径</td></tr><tr><td>微量移液管拉制仪&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instrument Inc</td><td></td><td>Flamming/Brown 微量移液管拉制仪 p-87</td></tr><tr><td>显微注射仪</td><td>Tritech Research&amp;nbsp;</td><td></td><td>数字显微注射仪，MINJ-D</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Sciences Tools Inc</td><td></td><td>Dumont # M5S&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>微量加样器吸头</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

解析与成像mycobacterium abscessus在斑马鱼胚胎中的致病机制及索状结构

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

斑马鱼（Danio rerio胚胎越来越多地被用作感染模型，以研究脊椎动物先天免疫系统在宿主-病原体相互作用中的功能。&#160;获得大量胚胎的便捷性、胚胎因体外发育而易于操作、其光学透明性，以及丰富的遗传学/免疫学工具和转基因报告基因品系资源，共同赋予了该模型系统的多功能性。&#160;在这方面，本文描述了斑马鱼的使用作为一种&#160;体内&#160;研究时间顺序的模型系统 脓肿分枝杆菌 感染。该人类病原体可根据细胞壁组成呈现光滑型（S）或粗糙型（R）变异体，其相应的毒力可在斑马鱼胚胎和幼鱼中进行成像与比较。将S型或R型荧光标记的变异体直接显微注射至血液循环中 通过 尾静脉注射则分别导致慢性或急性/致死性感染。该生物系统可实现对分枝杆菌索状结构在促进脓肿形成中作用的高分辨率可视化与分析。此外，结合使用荧光标记的细菌与携带荧光标记巨噬细胞的转基因斑马鱼品系，为宿主-病原体相互作用的多色成像提供了独特机会。本文详细描述了制备均一 M. abscessus 接种物制备以及用于斑马鱼胚胎的静脉注射，以便后续对与巨噬细胞相互作用进行荧光成像。这些技术为未来研究涉及索状结构形成缺陷的突变体开辟了途径，并致力于阐明其对 M. abscessus 在完整脊椎动物中的致病性

尽管可注射多种解剖位点32，尾静脉注射常用于建立全身性感染，以便后续进行生存实验、细菌负荷测定、吞噬活性分析或类绳索结构形成等研究。尾部肌肉注射则用于评估巨噬细胞在注射部位的募集情况（图3A）。为研究和比较M. abscessus粗糙型（R）与光滑型（S）变异株的毒力，可将荧光标记的细菌悬液注射至30 hpf胚胎的尾静脉中（图3A）19。与S型变异株相比，R形态型在斑马鱼胚胎中引发更强烈且致死性的感染（图3B），其特征是在中枢神经系统（CNS）内迅速形成细菌性脓肿（图3C）。R型和S型变异株的全身注射均可导致中枢神经系统感染，其病理学差异和毒力表型可通过荧光显微镜观察（图3C）、每尾鱼的菌落形成单位（CFU）计数（图3D）或图像的荧光像素计数（FPC）定量分析（图3E）进行量化。重要的是，CFU与FPC的测定结果具有相关性，均表明在感染后3天...

光学透明的斑马鱼胚胎被广泛用于实时研究和观察病原微生物与先天免疫细胞之间的相互作用。通过将脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus）显微注射结合荧光成像技术，可在斑马鱼胚胎中深入分析其关键致病特征，例如索状结构的形成。

解析与成像Mycobacterium abscessus在斑马鱼胚胎中的致病机制及索状结构

斑马鱼（Danio rerio）胚胎作为一种感染模型的应用日益广泛，可用于研究脊椎动物先天免疫系统在宿主-病原体相互作用中的功能……

本实验的总体目标是研究并比较脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus）菌株的毒力，并利用透明斑马鱼胚胎在体内描述这些细菌与宿主先天免疫系统之间的相互作用。首先制备均一的细菌接种物，随后在受精后30小时将细菌悬液通过静脉注射注入胚胎中。此外，为了更精确地研究巨噬细胞在感染控制中的作用，采用基于脂质体的注射方法以获得巨噬细胞耗竭的胚胎。最后，对感染后的胚胎进行制备，并利用荧光显微镜和共聚焦显微镜成像，以监测感染的进展过程。最终可获得的结果展示了荧光吞噬细胞与脓肿分枝杆菌（M. abscessus）之间的特异性相互作用，这些相互作用可表现为单个杆菌形态，或在透明胚胎内呈现为蛇形索状结构。与小鼠等其他动物模型相比，使用斑马鱼的主要优势在于能够实时特异性地观察感染过程，并对脓肿分枝杆菌与巨噬细胞或中性粒细胞之间的特异性相互作用进行成像研究。此步骤对于后续斑马鱼注射压力的控制至关重要。由于粗糙型脓肿分枝杆菌极易形成大团聚体并产生生物膜，因此在显微注射前，必须经过特定处理以制备均一且定量可控的菌液接种物。为了制备脓肿分枝杆菌，将150平方厘米组织培养瓶中处于对数生长期的培养物接种至50毫升无菌塑料管中，在4,000 × g、室温条件下离心15分钟。使用1毫升添加OADC增补剂并含吐温80的Middlebrook 7H9培养基（下文简称7H9培养基）重悬菌体沉淀并混匀。取200微升细菌悬液加入1.5毫升离心管中，用26号针头将每份ALI四联细菌悬液反复吹打15次以实现均质化。然后使用水浴超声仪，每次超声10秒，共超声3次，每次间隔10秒。超声之间，加入1毫升7H9培养基，短暂涡旋混匀，然后以100 × g离心3分钟。小心收集含有分枝杆菌的上清液，避免混入菌团，并将均一的悬液转移至50毫升无菌塑料管中。在4,000 × g条件下离心悬浮液5分钟，并用200 µL的7H9培养基重悬菌体沉淀，以评估最终的细菌接种量。根据文本方案，该方法的可视化演示至关重要，因为这些步骤较难掌握，需要在显微镜下对斑马鱼胚胎进行精确而轻柔的注射操作，且微注射技术的掌握需要一定时间。在受精后约24小时（hpf）进行脓肿分枝杆菌（M. abscessus）的微注射操作时，使用镊子将胚胎转移至100 mm的培养皿中，并在28.5 °C条件下培养。用剪去尖端的微量移液器吸头，将30至48小时受精龄（HPF）的胚胎转移至装有25毫升含有270毫克/升三卡（trica）鱼水的V型定位腔室中。将胚胎正确放置于通道内，以便于后续操作。使用含0.05% PBST，在80至之间稀释微生物接种物至所需CFU浓度，并加入10%酚红，以便通过微量移液器吸头观察注射是否到位。用5到10微升的细菌接种液填充一支显微注射针。将显微注射针插入与注射仪相连的显微操作器持针器中，并使用精细镊子折断针尖顶端，以获得5至10微米的开口直径。通过调整显微注射压力和时间来校准注射体积。为获得所需的注射体积，测量注入一个胚胎卵黄中液滴的直径，以进行绒毛尿囊静脉注射。将胚胎腹侧朝向针头放置，并将针尖靠近泄殖腔 opening。轻轻将针尖推入胚胎，直至刚好刺破卵黄静脉区域。随后注入所需体积的细菌悬液，通常为1至3纳升，每纳升约含100个菌落形成单位（CFU）。根据文本方案孵育并监测胚胎，以进行脂多糖（lipo Choate）处理、巨噬细胞耗竭，并在受精后24小时（24 HPF）时将胚胎转移至含有三卡因（trica）的鱼水中注射皿中。然后将它们背侧朝下放置。在涡旋混匀脂质体包封的氯膦酸盐溶液后，装填微毛细管针头并校准注射体积。按照之前演示的方法穿刺尾静脉区域，并注射两到三升溶液。重复注射三次。将胚胎在28.5摄氏度下孵育，并在感染前使用荧光显微镜检测巨噬细胞是否被有效耗竭。如本视频前面所示，在预定时间点通过计数菌落形成单位（CFUs）来进行分析。每种感染条件下收集五个胚胎，将每个胚胎转移至一个1.5毫升的微量离心管中。在用300至500毫克/升Trica处死胚胎后，将其置于冰上孵育10分钟进行低温麻醉。使用无菌水在新管中清洗胚胎两次。接下来，向每个胚胎中加入含2% Triton X-100的1×PBS以去除水分，并使用26号针头充分匀浆组织以实现完全裂解。离心悬浮液后，用1×PBS-T重悬沉淀。随后将均质液进行系列稀释，并接种于Middlebrook 7H10 OADC培养基上。加入B-B-L-M-G-I-T Panta后，将平板在30摄氏度下培养四天，然后计数菌落。为进行M abscessus感染的活体成像，将三卡麻醉的胚胎置于含1%低熔点琼脂糖的35毫米玻璃底培养皿中，用于倒置显微镜观察，或置于单腔凹玻片中用于正置共聚焦显微镜观察。将胚胎调整至所需位置，并在凝固的琼脂糖上覆盖含有三卡的养鱼用水。为进行M abscessus感染的固定成像，在处死胚胎后，将其转移至1.5毫升微量离心管中，并用含4%多聚甲醛的1×PBS-T溶液固定两小时。在室温下，用 1×PBS-T 溶液洗涤胚胎两次，每次 10 分钟，以去除多聚甲醛，从而依次保护组织完整性和荧光信号。将胚胎在浓度递增的甘油溶液中孵育，每种条件孵育 10 分钟。将包埋在 50% 甘油中的胚胎置于观察室中。最后，使用配备10倍物镜的荧光显微镜或配备40倍或63倍物镜的荧光共聚焦显微镜，对胚胎进行荧光信号的逐层采集及透射成像。为了研究并比较粗糙型与光滑型脓肿分枝杆菌（M. abscessus）变异株的毒力，将荧光标记的细菌通过静脉注射至30个具有HPFC功能的胚胎中。与光滑型变异株相比，粗糙型变异株会引发更强烈且致死性的感染，并在中枢神经系统内形成脓肿。毒力差异通过计数菌落形成单位（CFU）或测定与之相关的荧光像素值进行量化。这表明粗糙变异株具有更高的细菌载量。如本图所示，通过视频显微镜可以以非侵入性方式监测和成像索状结构形成的动力学过程，显示出粗糙变异株在此处所示条件下倾向于进行胞外复制。用粗糙型脓肿分枝杆菌感染巨噬细胞耗竭的胚胎，会导致细菌载量和索状结构产生显著增加，并引起幼虫快速死亡。这明确表明，巨噬细胞对于控制脓肿分枝杆菌（M. abscessus）感染是必需的，以便实时观察巨噬细胞与脓肿分枝杆菌之间的相互作用。可使用表达红色荧光巨噬细胞的EGFP-M-Cherry转基因品系。感染会显著募集巨噬细胞，并有效吞噬单个细菌，而分枝杆菌索状结构则是脓肿分枝杆菌为逃避被吞噬而进化出的一种策略，该策略在其发育完成后出现。该技术为探索编码作为免疫逃逸新机制的重要作用奠定了基础。得益于斑马鱼感染模型，现在已有可能在体内观察并描述编码在脓肿分枝杆菌致病过程中的贡献。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

破译和成像发病机制与盘带<em&gt;脓肿分枝杆菌</em&gt;斑马鱼胚胎

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斑马鱼胚胎感染后宿主-病原体相互作用的活体成像 脓肿分枝杆菌

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成像细胞器及其他亚细胞结构的动态行为 体内 可以揭示它们在生理和疾病状态下的功能。本文介绍了对两种细胞器——中心体和线粒体——进行遗传标记的方法，并利用宽场显微镜和共聚焦显微镜对活体斑马鱼胚胎中这些细胞器的动态行为进行成像。...

活体斑马鱼胚胎中亚细胞结构的成像

本研究描述了一种基于荧光显微镜技术的斑马鱼胚胎模型，可用于活体可视化及随时间动态进行生物材料相关感染的活体分析。该模型是一种有前景的研究体系，可作为小鼠等哺乳动物模型的补充，用于体内研究生物材料相关感染。...

一种用于活体可视化及活体分析生物材料相关反应的斑马鱼胚胎模型 金黄色葡萄球菌 感染

本方案描述了一种在Mycobacterium...

通过活体显微镜观察斑马鱼胚胎中分枝杆菌感染期间巨噬细胞的裂解性细胞死亡

了解脓肿分枝杆菌毒力比较与宿主先天免疫系统相互作用的研究方法，使用荧光和共聚焦显微镜在透明斑马鱼胚胎中进行实时成像观察。该技术可揭示巨噬细胞与病原体的动态关系。

解析与成像Mycobacterium abscessus在斑马鱼胚胎中的致病机制及索状结构

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