用于抗体特异性分析的肽微阵列技术

取含有具有靶标和非靶标翻译后修饰或PTM的组蛋白肽的微阵列载玻片。

通过偶联生物素固定在链霉亲和素功能化载玻片上的特定点。

这些斑点还含有固定化的生物素偶联的绿色荧光团，有助于识别斑点。

引入封闭缓冲液，防止非特异性抗体相互作用。

取出缓冲液并离心以干燥载玻片。

蜡压印机内，用蜡镶边阵列。

用杂交缓冲液平衡阵列。

与靶 PTM 特异性一抗一起孵育。

引入与一抗结合的红色荧光团偶联二抗。

取出未结合的抗体并离心以干燥载玻片。

使用微阵列扫描仪对载玻片进行成像。绿色荧光有助于识别斑点，而红色荧光表示 PTM-抗体相互作用，显示抗体特异性。

靶标 PTM 的识别表明抗体特异性，而非靶标 PTM 的识别表明抗体交叉反应。

源板图的指导下，将 1 至 2 微升每种肽特征加载到一个或多个 384 孔小体积板的指定孔中。用 1x 蛋白质微阵列打印缓冲液稀释每个特征 10 倍，补充 1% 牛血清白蛋白和每微升荧光素标记的生物素 5 微克。然后，在室温下以500倍g离心板2分钟。接下来，清空微阵列打印机的废物容器。用无菌蒸馏水将洗涤液装入加湿器容器中。在微阵列打印机软件中输入阵列载玻片参数。

洗涤程序设置为单次浸泡 1 秒洗涤，后洗涤将针重新洗五次，湿度设置为 60%。然后，将链霉亲和素涂层载玻片插入基材板中。将压板装入压板升降机。将源板插入板支架，然后将支架装入源板升降机。运行打印过程。

然后，从仪器上取下基板压板。用 1x 蛋白质微阵列封闭缓冲液封闭打印的载玻片 30 分钟，同时摇动。然后，在室温 pH 7.6 磷酸盐缓冲盐水中洗涤载玻片 10 分钟。用一批新鲜的PBS重复洗涤。在室温下通过离心干燥载玻片 30 秒。

接下来，将微阵列蜡压印机在 85 摄氏度下预热 30 分钟，或直到蜡融化。然后，将载玻片（打印面朝下）插入支架，并将支架与压印模具对齐。使模具与载玻片接触，并保持两秒钟。然后，快速从支架上取下载玻片并检查蜡边以验证阵列是否正确封闭。将分区的载玻片存放在 4 摄氏度的干燥、黑暗的地方。

要开始杂交程序，请将分区阵列载玻片放入塑料培养皿中，并用杂交缓冲液覆盖载玻片。在 4 摄氏度下平衡载玻片 30 分钟，同时低速摇动。通过在室温下在微阵列载玻片离心机中旋转来干燥载玻片。然后，将 5 微升每种组蛋白 PTM 抗体溶液添加到阵列的至少两个孔中，并在 4 摄氏度下孵育一小时。

孵育后，除去抗体溶液，并在 4 摄氏度下用冷 PBS 洗涤阵列 3 次，每次 5 分钟。接下来，在无光的情况下，将阵列在荧光染料偶联二抗溶液中在4摄氏度下孵育30分钟。像以前一样用冷PBS清洗载玻片三次。

将阵列浸入室温 0.1x PBS 中以去除多余的盐，并在室温下短暂离心干燥载玻片。使用微阵列扫描仪以至少 25 微米的分辨率对载玻片进行成像。