Name: 化学阻断抗体芯片复用高通量的复杂样品中特定蛋白糖基化的剖析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: 学习化学阻断抗体芯片技术用于高通量糖基化分析，该方法可同时检测血清中20种糖蛋白的糖基化谱。此技术比传统HPLC方法更快速、经济，适用于肝癌等疾病的生物标志物发现研究。

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本工作由肝炎与病毒学研究所资助。

<ol><li>Fang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ER+UDPase+ENTPD5+promotes+protein+N-glycosylation%2C+the+Warburg+effect%2C+and+proliferation+in+the+PTEN+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The ER UDPase ENTPD5 promotes protein N-glycosylation, the Warburg effect, and proliferation in the PTEN pathway.</a> Cell. 143, 711-724 (2010).</li>
<li>Marino, K., Bones, J., Kattla, J. J., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+approach+to+protein+glycosylation+analysis%3A+a+path+through+the+maze%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A systematic approach to protein glycosylation analysis: a path through the maze.</a> Nat. Chem. Biol. 6, 713-723 (2010).</li>
<li>Shental-Bechor, D., Levy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+glycosylation+on+protein+folding%3A+a+close+look+at+thermodynamic+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Effect of glycosylation on protein folding: a close look at thermodynamic stabilization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 8256-8261 (2008).</li>
<li>Hossler, P., Khattak, S. F., Li, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+and+consistent+protein+glycosylation+in+mammalian+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture.</a> Glycobiology. 19, 936-949 (2009).</li>
<li>Nothaft, H., Szymanski, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+glycosylation+in+bacteria%3A+sweeter+than+ever%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever.</a> Nat. Rev. Microbiol. 8, 765-778 (2011).</li>
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<li>Dwek, M. V., Jenks, A., Leathem, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+assay+to+measure+biomarker+glycosylation+demonstrates+increased+fucosylation+of+prostate+specific+antigen+%28PSA%29+in+patients+with+prostate+cancer+compared+with+benign+prostatic+hyperplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">A sensitive assay to measure biomarker glycosylation demonstrates increased fucosylation of prostate specific antigen (PSA) in patients with prostate cancer compared with benign prostatic hyperplasia.</a> Clin. Chim. Acta. 411, 1935-1939 (2010).</li>
<li>Drake, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sweetening+the+pot%3A+adding+glycosylation+to+the+biomarker+discovery+equation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Sweetening the pot: adding glycosylation to the biomarker discovery equation.</a> Clin. Chem. 56, 223-236 (2010).</li>
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<li>Boland, M., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+related+glycosylation+changes+and+biomarker+discovery%3A+challenges+and+possibilities+in+an+emerging+field%5BTitle%5D)+AND+%22Editorial.+Dis.+Markers%22%5BJournal%5D)">Disease related glycosylation changes and biomarker discovery: challenges and possibilities in an emerging field.</a> Editorial. Dis. Markers. 25, 189-192 (2008).</li>
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<li>Kobayashi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fucosylated+fraction+of+alpha-fetoprotein%2C+L3%2C+as+a+useful+prognostic+factor+in+patients+with+hepatocellular+carcinoma+with+special+reference+to+low+concentrations+of+serum+alpha-fetoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatol.+Res%22%5BJournal%5D)">Fucosylated fraction of alpha-fetoprotein, L3, as a useful prognostic factor in patients with hepatocellular carcinoma with special reference to low concentrations of serum alpha-fetoprotein.</a> Hepatol. Res. 37, 914-922 (2007).</li>
<li>Maisey, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CA19-9+as+a+prognostic+factor+in+inoperable+pancreatic+cancer%3A+the+implication+for+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">CA19-9 as a prognostic factor in inoperable pancreatic cancer: the implication for clinical trials.</a> Br. J. Cancer. 93, 740-743 (2005).</li>
<li>Talar-Wojnarowska, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+value+of+serum+neopterin%2C+tissue+polypeptide-specific+antigen+and+CA19-9+levels+in+differential+diagnosis+between+pancreatic+cancer+and+chronic+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreatology%22%5BJournal%5D)">Clinical value of serum neopterin, tissue polypeptide-specific antigen and CA19-9 levels in differential diagnosis between pancreatic cancer and chronic pancreatitis.</a> Pancreatology. 10, 689-694 (2010).</li>
<li>Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+analysis+of+glycan+variation+on+native+proteins+captured+by+antibody+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed analysis of glycan variation on native proteins captured by antibody microarrays.</a> Nat. Methods. 4, 437-444 (2007).</li>
<li>Shao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+microarray+analysis+of+serum+glycans+in+esophageal+spuamous+cell+carcinoma+cases+and+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Antibody microarray analysis of serum glycans in esophageal spuamous cell carcinoma cases and controls.</a> Proteomics Clinical Applications. 3, 923-931 (2009).</li>
<li>Chen, S., Haab, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+glycans+on+serum+proteins+using+antibody+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of glycans on serum proteins using antibody microarrays.</a> Methods Mol. Biol. 520, 39-58 (2009).</li>
<li>Yue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Prevalence+and+Nature+of+Glycan+Alterations+on+Specific+Proteins+in+Pancreatic+Cancer+Patients+Revealed+Using+Antibody-Lectin+Sandwich+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The Prevalence and Nature of Glycan Alterations on Specific Proteins in Pancreatic Cancer Patients Revealed Using Antibody-Lectin Sandwich Arrays.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 8, 1697-1707 (2009).</li>
<li>Wolf-Yadlin, A., Sevecka, M., MacBeath, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+protein+function+and+signaling+using+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Dissecting protein function and signaling using protein microarrays.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 13, 398-405 (2009).</li>
<li>Richard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+as+Applied+to+Inherited+Metabolic+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomics as Applied to Inherited Metabolic Diseases.</a> Current Proteomics. 6, 140-153 (2009).</li>
<li>Nolen, B., Winans, M., Marrangoni, A., Lokshin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+tumor-associated+antigen+autoantibody+profiles+in+healthy+controls+detected+by+multiplex+bead-based+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Aberrant tumor-associated antigen autoantibody profiles in healthy controls detected by multiplex bead-based immunoassay.</a> Journal of Immunological Methods. 344, 116-120 (2009).</li>
<li>Kuno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+Differential+Glycan+Analysis+with+the+Platform+Antibody-assisted+Lectin+Profiling+for+Glycan-related+Biomarker+Verification%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Focused Differential Glycan Analysis with the Platform Antibody-assisted Lectin Profiling for Glycan-related Biomarker Verification.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 8, 99-108 (2009).</li>
<li>Hsu, K. -L., Mahal, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sweet+tasting+chips%3A+microarray-based+analysis+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Sweet tasting chips: microarray-based analysis of glycans.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 13, 427-432 (2009).</li>
<li>Borrebaeck, C. A. K., Wingren, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+proteomics+using+antibody+microarrays%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">High-throughput proteomics using antibody microarrays: an update.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 7, 673-686 (2007).</li>
<li>Sanchez-Carbayo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+array-based+technologies+for+cancer+protein+profiling+and+functional+proteomic+analyses+using+serum+and+tissue+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Tumor+Biology%22%5BJournal%5D)">Antibody array-based technologies for cancer protein profiling and functional proteomic analyses using serum and tissue specimens.</a> Tumor Biology. 31, 103-112 (2010).</li>
<li>Porter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+motif-based+analysis+of+glycan+array+data+to+determine+the+specificities+of+glycan-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">A motif-based analysis of glycan array data to determine the specificities of glycan-binding proteins.</a> Glycobiology. 20, 369-380 (2010).</li>
<li>Maupin, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogene+Expression+Alterations+Associated+with+Pancreatic+Cancer+Epithelial-Mesenchymal+Transition+in+Complementary+Model+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Glycogene Expression Alterations Associated with Pancreatic Cancer Epithelial-Mesenchymal Transition in Complementary Model Systems.</a> Plos One. 5, (2010).</li>
<li>Sevecka, M., Wolf-Yadlin, A., MacBeath, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysate+Microarrays+Enable+High-throughput%2C+Quantitative+Investigations+of+Cellular+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Lysate Microarrays Enable High-throughput, Quantitative Investigations of Cellular Signaling.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 10, (2011).</li>
<li>Wang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+fucosylated+biomarkers+for+the+early+detection+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol.+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Novel fucosylated biomarkers for the early detection of hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 18, 1914-1921 (2009).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

1. 目标蛋白与捕获抗体的选择
在进行抗体微阵列实验之前，需要考虑并准备一些试剂和材料。为了设计用于聚糖分析或聚糖生物标志物筛选的抗体微阵列，应根据文献报道或先前的研究结果确定一组针对糖蛋白候选分子的特异性抗体。这些抗体通常从不同的供应商（如 R&amp;D Systems 等）购买。优先选择 IgG 作为捕获抗体，因为此前的实验结果表明，某些 IgM 和 IgE 在化学修饰后可能会完全丧失其抗原结合亲和力。
2. 抗体微阵列的设计与制备
抗体微阵列的制备是一个可选步骤，需要专业的昂贵微阵列点样仪以及经过良好培训的操作人员。然而，定制的抗体微阵列制备可方便地通过服务提供商完成，例如 Serome Biosciences Inc.。为了获得可靠的结果，我们推荐使用非接触式微阵列点样仪，例如在本研究中用于抗体微阵列制备的 Scienion sciFLEXARRAYER 超低体积非接触式微阵列点样仪。建议使用高结合容量的微阵列载玻片，例如 PATH（Gentel Bio Inc. WI）或...

<table><tbody><tr><td>生物素化刀豆球蛋白A</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-1000</td><td>ConA</td></tr><tr><td>生物素标记的欧洲接骨木凝集素</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1305</td><td>SNA</td></tr><tr><td>生物素标记的扁豆凝集素</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-2000</td><td>LCA</td></tr><tr><td>生物素标记的蓖麻凝集素 I</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-1000</td><td>RCA</td></tr><tr><td>生物素标记的橙黄假脐菇凝集素</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1395</td><td>AAL</td></tr><tr><td>生物素标记的刺槐凝集素</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-3000</td><td>ECL</td></tr><tr><td>生物素标记的扁豆凝集素II</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-3000</td><td>GSL II</td></tr><tr><td>生物素标记的小麦胚芽凝集素</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-1000</td><td>WGA</td></tr><tr><td>生物素标记的菜豆红细胞凝集素</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-2000</td><td>PHA-E</td></tr><tr><td>生物素标记的菜豆白细胞凝集素</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-2000</td><td>PHA-L</td></tr><tr><td>生物素标记的花生凝集素</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-1000</td><td>PNA</td></tr><tr><td>生物素标记的豌豆凝集素</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-2000</td><td>PSA</td></tr><tr><td>生物素标记的双花扁豆凝集素</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-1000</td><td>DBA</td></tr><tr><td>生物素标记的曼陀罗凝集素</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-3000</td><td>DSL</td></tr><tr><td>生物素标记的槐凝集素</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-2000</td><td>SJA</td></tr><tr><td>生物素标记的大豆凝集素</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-1000</td><td>SBA</td></tr><tr><td>生物素标记的马铃薯凝集素</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-3000</td><td>STL</td></tr><tr><td>生物素标记的扁豆凝集素 I</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-2000</td><td>GSL I</td></tr><tr><td>生物素标记的绒毛豌豆凝集素</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-2000</td><td>VVL</td></tr><tr><td>生物素标记的番茄凝集素（Biotinylated Lycopersicon esculentum Lectin）</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-3000</td><td>LEL</td></tr><tr><td>生物素标记的荆豆凝集素 I</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-1000</td><td>UEA I</td></tr><tr><td>生物素标记的茉卡凝集素</td><td>Vector Laboratories</td><td>BK-3000</td><td>JACALIN</td></tr><tr><td>山羊F(ab')2片段抗人IgM，Fc5&amp;#956; 抗体</td><td>杰克逊免疫研究公司</td><td>109-006-129</td><td>IgM</td></tr><tr><td>驴F(ab')2片段抗人IgG（H+L）抗体</td><td>杰克逊免疫研究公司</td><td>709-006-149</td><td>AB1</td></tr><tr><td>小鼠抗人IgG F(ab')2单克隆抗体</td><td>杰克逊免疫研究公司</td><td>209-005-097</td><td>AB3</td></tr><tr><td>山羊抗人α2巨球蛋白多克隆抗体</td><td>GeneTex</td><td>GTX62924</td><td>A2M</td></tr><tr><td>兔抗人α1-抗胰蛋白酶多克隆抗体</td><td>Lee Biosiences</td><td>CA1T-80A</td><td>A1AT</td></tr><tr><td>小鼠抗人α1-抗胰蛋白酶单克隆抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4200198</td><td>A1AT</td></tr><tr><td>兔抗人α1-抗胰蛋白酶多克隆抗体</td><td>NeoMarkers</td><td>RB-367-A1</td><td>ACT</td></tr><tr><td>兔抗人α-1-抗糜蛋白酶多克隆抗体</td><td>Fisher Scientific</td><td>RB9213R7</td><td>ACT</td></tr><tr><td>小鼠抗人转铁蛋白单克隆抗体</td><td>GeneTex</td><td>GTX101035</td><td>转铁蛋白</td></tr><tr><td>兔抗人转铁蛋白多克隆抗体</td><td>GeneTex</td><td>GTX77130</td><td>转铁蛋白</td></tr><tr><td>山羊抗人载脂蛋白J多克隆抗体</td><td>Abcam</td><td>ab7610</td><td>ApoJ</td></tr><tr><td>小鼠抗人GP73单克隆抗体</td><td>雅培实验室</td><td>14H4-23</td><td>GP73</td></tr><tr><td>小鼠抗人GP73单克隆抗体</td><td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC</td><td>sc-101275</td><td>GP73</td></tr><tr><td>兔抗人甲胎蛋白多克隆抗体</td><td>GenWay</td><td>GWB-41C966</td><td>AFP</td></tr><tr><td>小鼠抗人甲胎蛋白单克隆抗体</td><td>Fitzgerald</td><td>10-A05A</td><td>AFP</td></tr><tr><td>小鼠抗人血红素结合蛋白单克隆抗体</td><td>Assaypro</td><td>60190-05011</td><td>血红素结合蛋白</td></tr><tr><td>小鼠抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（1G12）单克隆抗体</td><td>Santa Cruz Bio</td><td>sc-65443</td><td>GPL3</td></tr><tr><td>小鼠抗人激肽原（低分子量）单克隆抗体</td><td>Assaypro</td><td>20333-05011</td><td>激肽原</td></tr><tr><td>兔抗人MMP-21单克隆抗体</td><td>表位组</td><td>1955-1</td><td>MMP21</td></tr><tr><td>小鼠抗人CEACAM-1单克隆抗体</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>MAB1180</td><td>CEACAM</td></tr><tr><td>抗人DPPIV/CD26单克隆抗体（大鼠源）</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>MAB22441</td><td>DPPIV</td></tr><tr><td>小鼠抗人PIVKA II单克隆抗体</td><td>晶体化学</td><td>8040</td><td>PIVICA</td></tr><tr><td>小鼠抗癌蛋白&amp;#8211;胚胎抗原</td><td>美国生物</td><td>C1300</td><td>癌胚抗原</td></tr><tr><td>小鼠抗CA125癌抗原</td><td>美国生物学</td><td>C0050-01D</td><td>CA125</td></tr><tr><td>小鼠抗-CA19-9 癌抗原</td><td>美国生物学</td><td>C0075-18</td><td>CA19-9</td></tr><tr><td>小鼠抗Lewis x单克隆抗体</td><td>Calbiochem</td><td>434631</td><td>Lewis X</td></tr><tr><td>生物素标记的BSA（阳性对照）</td><td>自制</td><td>N/A</td><td>生物</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;表1.&lt;/strong&gt; 本方案中使用的凝集素和抗体列表</td></tr><tr><td>非接触式微阵列点样仪</td><td>BioDot 公司</td><td>sciFLEXARRAYER</td><td></td></tr><tr><td>384 孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-230-243</td><td></td></tr><tr><td>FoodSaver</td><td>FoodSaver</td><td>V3835</td><td></td></tr><tr><td>超薄硝酸纤维素包被微阵列载玻片</td><td>Gentel</td><td>PATH</td><td></td></tr><tr><td>滑片印迹器（可选）</td><td>The Gel Company</td><td>WSP60-1</td><td></td></tr><tr><td>沙克尔</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-453-211</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>Eppendorf</td><td>5804 000.013</td><td></td></tr><tr><td>带可拆卸架的载玻片清洗槽/载玻片染色皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-812</td><td></td></tr><tr><td>孵育盒/载玻片盒</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-5</td><td></td></tr><tr><td>Brij 35，30 w/v% 水溶液</td><td>Acros Organics</td><td>AC32958-0025</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>P337-100</td><td></td></tr><tr><td>高碘酸钠（NaIO₄）&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311448</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酸 &amp;#947;-肼</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7257</td><td></td></tr><tr><td>无水乙酸钠（CH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;COONa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Lampire Biological Labs</td><td>7500804</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）（10倍浓缩液）</td><td>Denville Scientific</td><td>CP4390-48</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 549 标记的 NeutrAvidin</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>22837</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物片剂</td><td>罗氏集团</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>ChromPure 人 IgG，Fc 片段</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>009-000-008</td><td></td></tr><tr><td>ChromPure 人IgG，完整分子</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>009-000-003</td><td></td></tr><tr><td>ChromPure 小鼠 IgG，全分子</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>015-000-003</td><td></td></tr><tr><td>ChromPure 小鼠 IgG，Fc 片段</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>015-000-008</td><td></td></tr><tr><td>ChromPure 兔 IgG，全分子</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>011-000-003</td><td></td></tr><tr><td>ChromPure 驴IgG，全分子</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>017-000-003</td><td></td></tr><tr><td>微阵列扫描仪</td><td>Tecan集团有限公司</td><td>LS 重新加载</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;表2.&lt;/strong&gt; 本方案中使用的仪器与试剂清单</td></tr></tbody></table>

用于复杂样本中特定蛋白质糖基化多重高通量分析的化学封闭抗体微阵列

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

本研究描述了一种高效的多重高通量抗体微阵列方法，结合凝集素类糖结合蛋白（GBP）检测，用于特异性蛋白质的糖基化谱分析。蛋白质糖基化是蛋白质中最常见的翻译后修饰，可导致蛋白质在物理、化学及生物学特性上的多样化改变。由于糖基化机制极易受到疾病进展和恶性转化的影响，异常糖基化已被公认为癌症及其他疾病的早期检测生物标志物。然而，目前研究蛋白质糖基化的常用方法通常过于复杂或昂贵，难以在大多数常规实验室或临床环境中广泛应用，因此亟需一种更为实用的技术手段。本研究中介绍的新方法采用化学封闭的抗体微阵列并结合糖结合蛋白（GBP）检测，显著降低了研究蛋白质糖基化所需的时间、成本以及对实验设备的要求。该方法将多种针对糖蛋白的特异性抗体直接点样于微阵列芯片上，并对抗体上的N-糖链进行化学封闭。经过封闭处理并固定于芯片上的糖蛋白特异性抗体，能够直接从复杂样本中捕获并分离目标糖蛋白。随后通过向微阵列芯片施加生物素标记的凝集素及其他GBP进行糖链检测，结合Dylight 549标记的链霉亲和素来测定结合水平。利用一组特异性抗体并使用多种生物素化凝集素进行探查，该方法可有效建立特定人源或动物样本中不同蛋白质的糖基化谱型。
引言
蛋白质糖基化是蛋白质最常见的翻译后修饰，能够改变蛋白质的物理、化学和生物学特性，在多种生物学过程中发挥基础性作用1-6由于糖基化机制特别容易受到疾病进展和恶性转化的影响，异常糖基化已被视为癌症及其他疾病的早期检测生物标志物。 7-12事实上，目前大多数癌症生物标志物，例如甲胎蛋白L3组分 &alpha;甲胎蛋白（AFP）用于肝细胞癌 13-15以及胰腺癌的CA199 16, 17 均为糖蛋白上的异常糖链结构。然而，研究蛋白质糖基化的方法一直较为复杂，不适合常规实验室和临床环境。Chen 等 最近发明了一种化学阻断抗体微阵列，结合聚糖结合蛋白（GBP）检测方法，可用于复杂样品中天然糖蛋白糖基化的高通量、多重分析 18在此基于亲和力的微阵列方法中，多种固定化的糖蛋白特异性抗体直接在微阵列芯片上捕获并分离复杂混合物中的糖蛋白，随后通过糖结合蛋白（GBPs）检测每种被捕获蛋白上的糖链。由于所有正常的抗体均含有N-糖链，而这些N-糖链可被大多数GBPs识别，因此该方法的关键步骤是化学封闭抗体上的糖链，以阻止其与GBPs结合。在该实验流程中， cis抗体上糖链的二醇基团首先通过使用NaIO氧化为醛基4 在避光条件下，使用醋酸钠缓冲液进行反应。随后，醛基与交联剂4-(4-N-马来酰亚胺苯基)丁酸肼盐酸盐（MPBH）的肼基发生偶联，接着将二肽Cys-Gly连接至MPBH的马来酰亚胺基团。因此，抗体糖链上的顺式二醇基团被转化为体积较大的非羟基基团，从而阻碍了凝集素及其他糖结合蛋白（GBPs）与捕获抗体的结合。该化学封闭步骤确保GBPs和凝集素仅与被捕获蛋白的糖链结合。完成化学封闭后，将血清样本与抗体微阵列孵育，随后使用不同的生物素标记的凝集素和糖结合蛋白检测糖链，并通过Cy3标记的链霉亲和素进行可视化。联合使用抗体阵列与多种凝集素探针，可获得特定样本中多种蛋白质的特异性糖基化谱型

抗体微阵列, 凝集素, 糖基化, 糖结合蛋白, 化学封闭, 顺式二醇, MPBH, Cys-Gly, 醋酸钠缓冲液, Cy3-链霉亲和素 18-20该方法已在多个不同的实验室中成功应用 1, 7, 13, 19-31然而，该方法中MPBH和Cys-Gly的稳定性较差，且操作步骤复杂、耗时较长，影响了方法的可重复性、有效性和效率。在本新方案中，我们用一种更为稳定的试剂谷氨酸酰肼（Glu-hydrazide）替代了MPBH和Cys-Gly，显著提高了方法的可重复性，并简化和缩短了整个操作流程，使其可在一天工作时间内完成。在本新方案中，我们详细描述了该方法的具体操作步骤，可被普通实验室常规用于蛋白质糖基化研究，并介绍了获得可重复和可再现结果所必需的技术要点。

本研究中，我们描述了一种改进的多重高通量抗体微阵列结合凝集素检测方法的实验方案，可用于特定蛋白质的糖基化谱分析。该方案采用了新的可靠试剂，与先前方法相比，显著缩短了实验时间，降低了成本，并减少了对实验室设备的需求。

在本研究中，我们描述了一种高效的多重高通量抗体微阵列实验方案，该方案结合糖结合蛋白检测，可用于……

本视频文章介绍了一种利用化学封闭抗体微阵列获取肝细胞癌患者血清样本中20种不同糖蛋白糖基化谱的实验方法。首先，将特异性抗体直接点样于微阵列载片上，并对抗体的糖链进行化学封闭，以防止凝集素结合。当加入患者血清样本后，样本中的糖蛋白被抗体捕获。随后加入生物素标记的糖结合蛋白以检测糖链，再加入双标记的链霉亲和素对生物素化凝集素进行标记。随后对微阵列玻片进行扫描，以检测荧光信号，对所得数据的分析可揭示样品蛋白质的糖基化谱型。该技术相较于现有的高效液相色谱（HPLC）等方法具有多项优势。此方法能够在蛋白质天然状态下检测单个糖蛋白。同时筛选多种蛋白质的糖基化改变速度更快、也更简便。我们发现，疾病（尤其是癌症和肝癌，我们已对此进行了最深入的研究）的生物标志物通常都存在糖基化修饰。而检测特定糖型的能力，能够显著提高生物标志物在敏感性和特异性方面的表现。因此，该方法可揭示肝细胞癌患者多种血清蛋白的糖基化改变，还可应用于其他癌症和疾病（如胰腺癌、糖尿病和阿尔茨海默病）的病理学研究及生物标志物发现。本实验操作将由我实验室的技术员 Chen Lu 进行演示。首先在冰上准备抗体微阵列，将用于微阵列打印的所有抗体在0.8毫升微量离心管中用PBS稀释至浓度为0.5毫克/毫升，总体积不少于40毫升。此处将使用26种不同的抗体作为阳性对照。同时准备等量的0.5毫克/毫升生物素化BSA的PBS溶液。使用移液器将每种抗体各40毫升分装至冰上的384孔源板中。然后在微阵列控制软件中，指定每种抗体的位置。接下来，将板作为源加载到微阵列上。然后将20张路径微阵列载玻片作为目标加载到微阵列上。设置微阵列以打印48个相同的子阵列，其中27种抗体和对照蛋白以九乘九的模式三份重复点样。启动微阵列以打印抗体微阵列载玻片。收集抗体微阵列载玻片，并将其存放在装有干燥剂的载玻片盒中。将玻片盒密封于塑料袋中，以防止储存过程中蛋白质变性及玻片受潮。将密封的微阵列玻片置于4°C保存，直至使用。该实验步骤中最困难且最关键的环节是化学封闭步骤。为了确保成功，关键在于微阵列芯片上必须印迹足够量的抗体。实验前应始终 freshly 配制亚硝酸钠和硝酸银溶液，并在避光条件下于 4 °C 进行氧化反应。从冰箱中取出微阵列载玻片，于室温下平衡30分钟。从储存盒中取出一张载玻片，将其短暂浸入含有0.1%吐温20的磷酸盐缓冲液（PBS）的洗涤盆中。然后将切片浸入含0.1%吐温的15毫摩尔醋酸钠缓冲液中，孵育10分钟。接着，配制新鲜的150毫摩尔高碘酸钠溶于15毫摩尔醋酸钠缓冲液中，并转移至切片洗涤槽中，避光保存于冰箱中，待用。将切片从醋酸钠缓冲液中取出，放入盛有新鲜高碘酸钠溶液的切片洗涤槽中，确保抗体面朝上。用铝箔覆盖孵育盒以避光。随后将载玻片孵育盒置于4°C、轻轻振荡孵育2小时。从孵育盒中取出载玻片，用乙酸钠缓冲液短暂漂洗三次，每次5分钟。将载玻片放入含有300毫升新配制的10毫摩尔谷氨酸阻断溶液的孵育盒中，在室温下轻轻振荡孵育2小时。从孵育盒中取出载玻片，用含0.1%吐温的PBS洗涤3分钟。接着，在载玻片洗涤槽中，将微阵列载玻片放入300毫升含1% BSA和0.5%吐温的PBS溶液中，在室温下轻轻振荡孵育1小时。用含 0.1% Tween 的 PBS 冲洗载玻片，每次三分钟，共冲洗三次。将载玻片置于载玻片架上，以 1,200 ×g 离心两分钟，使微阵列载玻片干燥。为分隔每个子阵列，需在载玻片上压印石蜡网格。将石蜡印迹仪在 70 摄氏度预热五分钟后，将已封闭的微阵列芯片载玻片放入石蜡印迹仪中，使抗体面朝向石蜡。轻轻拉动把手，使石蜡均匀地印迹在载玻片上。该方法可用于对单个样本进行糖组学分析，或对多个样本中的单一糖表位进行检测。在此我们将演示糖基化谱型分析实验。首先将40微升血清加入360微升含0.1%吐温、0.1%BRIDGE 35以及每毫升各100微克的小鼠、大鼠、兔、山羊和驴IgG的PBS溶液中进行稀释。该体积足以将6微升稀释后的血清溶液分别点样至每个子阵列上。将六微升稀释后的样本或对照品小心地加至载玻片的每个亚阵列上。将载玻片置于加有湿润纸巾的湿化盒中，室温孵育一小时。用含0.1%吐温的PBS冲洗载玻片三次，每次三分钟。然后以1200 ×g离心两分钟，干燥载玻片。在冰上，于0.8毫升微量离心管中，用含吐温的磷酸盐缓冲液（PBS tween）将生物素标记的糖结合蛋白配制成20微升、浓度为每毫升10毫克的溶液。将6微升稀释后的生物素化凝集素分别加至载玻片的每个子阵列上，随后将载玻片置于加湿的孵育盒中（盒内放置湿润的纸巾），室温孵育一小时。用含0.1%吐温的PBS冲洗载玻片三次后，将载玻片在离心机中以1200 × g离心两分钟以干燥。在冰上，于0.8毫升微量离心管中制备400微升含10毫克/毫升DITE 549标记的NeutrAvidin（溶于含0.1%吐温的PBS）溶液。使用重复移液器将6微升DITE 549标记的NeutrAvidin加至每个子阵列上，随后将载玻片置于加湿的载玻片盒中，于室温孵育一小时。用含0.1%吐温的PBS缓冲液冲洗载玻片，每次3分钟，共冲洗三次。将载玻片置于离心机中，在1200 × g条件下离心2分钟以干燥。使用荧光微阵列扫描仪以10毫米分辨率扫描载玻片。激光和PMT设置应尽可能强，同时确保未观察到饱和现象。在Array Pro 3.2中打开图像。根据显示抗体点位位置的阵列图设置阵列模板。将每个模板圆圈仔细对齐至图像中的相应位置，提取每个点的信号强度并导入 Excel 文件以进行后续分析。该抗体微阵列包含 48 个相同的子阵列，每个子阵列含有针对 20 种血清糖蛋白和生物素的 26 种抗体。BSA 的设计与制备方法如本视频所述，用于评估封闭步骤的重要性。在糖蛋白谱型分析中，制备了两张相同的微阵列玻片。其中一张未进行化学封闭处理，另一张作为对照样本被施加到第一列和第三列的亚阵列上，而 pooled HCC 血清样本则被施加到第二列和第四列的亚阵列上。然后将针对不同聚糖的生物素化凝集素分别施加到每个子阵列上，如这些子阵列图像所示。在未进行化学封闭的微阵列中，凝集素会结合至对照列中的捕获抗体，产生较高的背景信号，该信号与血清加样列的信号无法区分。然而，当在同一实验中使用化学封闭的抗体微阵列载玻片时，对照列中捕获抗体的结合几乎不存在或极低，而血清加样列则显示出强烈的抗原结合信号。这些结果表明，化学封闭步骤是检测抗体捕获的糖蛋白上糖链的关键环节。通过遵循本方案，可获得肝细胞癌（HCC）血清中22种糖蛋白的糖基化谱型。一旦掌握，若操作得当，该技术可在八小时内完成。抗体在修饰后可能会失去对相应抗原的亲和力及其他特性。因此，在进行此操作时，务必牢记这一点，并使用来自不同来源的多种抗体。按照本方案，还可采取其他措施，例如利用相同的微阵列芯片检测每种蛋白质的浓度，以回答进一步的问题，例如糖基化的改变是源于蛋白质表达水平的变化，还是仅仅由于各单个蛋白质糖基化修饰本身的改变所致。切记，处理含有病原体的血清样本可能极为危险，在进行本操作时，必须始终采取防护措施，例如佩戴防护手套。

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