用于复杂样本中特定蛋白质糖基化多重高通量分析的化学封闭抗体微阵列

本视频文章介绍了一种利用化学封闭抗体微阵列获取肝细胞癌患者血清样本中20种不同糖蛋白糖基化谱的实验方法。首先，将特异性抗体直接点样于微阵列载片上，并对抗体的糖链进行化学封闭，以防止凝集素结合。当加入患者血清样本后，样本中的糖蛋白被抗体捕获。随后加入生物素标记的糖结合蛋白以检测糖链，再加入双标记的链霉亲和素对生物素化凝集素进行标记。

随后对微阵列玻片进行扫描，以检测荧光信号，对所得数据的分析可揭示样品蛋白质的糖基化谱型。该技术相较于现有的高效液相色谱（HPLC）等方法具有多项优势。此方法能够在蛋白质天然状态下检测单个糖蛋白。

同时筛选多种蛋白质的糖基化改变速度更快、也更简便。我们发现，疾病（尤其是癌症和肝癌，我们已对此进行了最深入的研究）的生物标志物通常都存在糖基化修饰。而检测特定糖型的能力，能够显著提高生物标志物在敏感性和特异性方面的表现。

因此，该方法可揭示肝细胞癌患者多种血清蛋白的糖基化改变，还可应用于其他癌症和疾病（如胰腺癌、糖尿病和阿尔茨海默病）的病理学研究及生物标志物发现。本实验操作将由我实验室的技术员 Chen Lu 进行演示。

首先在冰上准备抗体微阵列，将用于微阵列打印的所有抗体在0.8毫升微量离心管中用PBS稀释至浓度为0.5毫克/毫升，总体积不少于40毫升。此处将使用26种不同的抗体作为阳性对照。同时准备等量的0.5毫克/毫升生物素化BSA的PBS溶液。使用移液器将每种抗体各40毫升分装至冰上的384孔源板中。

然后在微阵列控制软件中，指定每种抗体的位置。接下来，将板作为源加载到微阵列上。然后将20张路径微阵列载玻片作为目标加载到微阵列上。

设置微阵列以打印48个相同的子阵列，其中27种抗体和对照蛋白以九乘九的模式三份重复点样。启动微阵列以打印抗体微阵列载玻片。收集抗体微阵列载玻片，并将其存放在装有干燥剂的载玻片盒中。

将玻片盒密封于塑料袋中，以防止储存过程中蛋白质变性及玻片受潮。将密封的微阵列玻片置于4°C保存，直至使用。该实验步骤中最困难且最关键的环节是化学封闭步骤。

为了确保成功，关键在于微阵列芯片上必须印迹足够量的抗体。实验前应始终 freshly 配制亚硝酸钠和硝酸银溶液，并在避光条件下于 4 °C 进行氧化反应。

从冰箱中取出微阵列载玻片，于室温下平衡30分钟。从储存盒中取出一张载玻片，将其短暂浸入含有0.1%吐温20的磷酸盐缓冲液（PBS）的洗涤盆中。

然后将切片浸入含0.1%吐温的15毫摩尔醋酸钠缓冲液中，孵育10分钟。接着，配制新鲜的150毫摩尔高碘酸钠溶于15毫摩尔醋酸钠缓冲液中，并转移至切片洗涤槽中，避光保存于冰箱中，待用。将切片从醋酸钠缓冲液中取出，放入盛有新鲜高碘酸钠溶液的切片洗涤槽中，确保抗体面朝上。

用铝箔覆盖孵育盒以避光。随后将载玻片孵育盒置于4°C、轻轻振荡孵育2小时。从孵育盒中取出载玻片，用乙酸钠缓冲液短暂漂洗三次，每次5分钟。

将载玻片放入含有300毫升新配制的10毫摩尔谷氨酸阻断溶液的孵育盒中，在室温下轻轻振荡孵育2小时。从孵育盒中取出载玻片，用含0.1%吐温的PBS洗涤3分钟。接着，在载玻片洗涤槽中，将微阵列载玻片放入300毫升含1% BSA和0.5%吐温的PBS溶液中，在室温下轻轻振荡孵育1小时。

用含 0.1% Tween 的 PBS 冲洗载玻片，每次三分钟，共冲洗三次。将载玻片置于载玻片架上，以 1,200 ×g 离心两分钟，使微阵列载玻片干燥。为分隔每个子阵列，需在载玻片上压印石蜡网格。

将石蜡印迹仪在 70 摄氏度预热五分钟后，将已封闭的微阵列芯片载玻片放入石蜡印迹仪中，使抗体面朝向石蜡。轻轻拉动把手，使石蜡均匀地印迹在载玻片上。该方法可用于对单个样本进行糖组学分析，或对多个样本中的单一糖表位进行检测。

在此我们将演示糖基化谱型分析实验。首先将40微升血清加入360微升含0.1%吐温、0.1%BRIDGE 35以及每毫升各100微克的小鼠、大鼠、兔、山羊和驴IgG的PBS溶液中进行稀释。该体积足以将6微升稀释后的血清溶液分别点样至每个子阵列上。

将六微升稀释后的样本或对照品小心地加至载玻片的每个亚阵列上。将载玻片置于加有湿润纸巾的湿化盒中，室温孵育一小时。用含0.1%吐温的PBS冲洗载玻片三次，每次三分钟。

然后以1200 ×g离心两分钟，干燥载玻片。在冰上，于0.8毫升微量离心管中，用含吐温的磷酸盐缓冲液（PBS tween）将生物素标记的糖结合蛋白配制成20微升、浓度为每毫升10毫克的溶液。将6微升稀释后的生物素化凝集素分别加至载玻片的每个子阵列上，随后将载玻片置于加湿的孵育盒中（盒内放置湿润的纸巾），室温孵育一小时。

用含0.1%吐温的PBS冲洗载玻片三次后，将载玻片在离心机中以1200 × g离心两分钟以干燥。在冰上，于0.8毫升微量离心管中制备400微升含10毫克/毫升DITE 549标记的NeutrAvidin（溶于含0.1%吐温的PBS）溶液。使用重复移液器将6微升DITE 549标记的NeutrAvidin加至每个子阵列上，随后将载玻片置于加湿的载玻片盒中，于室温孵育一小时。

用含0.1%吐温的PBS缓冲液冲洗载玻片，每次3分钟，共冲洗三次。将载玻片置于离心机中，在1200 × g条件下离心2分钟以干燥。使用荧光微阵列扫描仪以10毫米分辨率扫描载玻片。

激光和PMT设置应尽可能强，同时确保未观察到饱和现象。在Array Pro 3.2中打开图像。根据显示抗体点位位置的阵列图设置阵列模板。

将每个模板圆圈仔细对齐至图像中的相应位置，提取每个点的信号强度并导入 Excel 文件以进行后续分析。该抗体微阵列包含 48 个相同的子阵列，每个子阵列含有针对 20 种血清糖蛋白和生物素的 26 种抗体。BSA 的设计与制备方法如本视频所述，用于评估封闭步骤的重要性。

在糖蛋白谱型分析中，制备了两张相同的微阵列玻片。其中一张未进行化学封闭处理，另一张作为对照样本被施加到第一列和第三列的亚阵列上，而 pooled HCC 血清样本则被施加到第二列和第四列的亚阵列上。

然后将针对不同聚糖的生物素化凝集素分别施加到每个子阵列上，如这些子阵列图像所示。在未进行化学封闭的微阵列中，凝集素会结合至对照列中的捕获抗体，产生较高的背景信号，该信号与血清加样列的信号无法区分。然而，当在同一实验中使用化学封闭的抗体微阵列载玻片时，对照列中捕获抗体的结合几乎不存在或极低，而血清加样列则显示出强烈的抗原结合信号。

这些结果表明，化学封闭步骤是检测抗体捕获的糖蛋白上糖链的关键环节。通过遵循本方案，可获得肝细胞癌（HCC）血清中22种糖蛋白的糖基化谱型。一旦掌握，若操作得当，该技术可在八小时内完成。抗体在修饰后可能会失去对相应抗原的亲和力及其他特性。

因此，在进行此操作时，务必牢记这一点，并使用来自不同来源的多种抗体。按照本方案，还可采取其他措施，例如利用相同的微阵列芯片检测每种蛋白质的浓度，以回答进一步的问题，例如糖基化的改变是源于蛋白质表达水平的变化，还是仅仅由于各单个蛋白质糖基化修饰本身的改变所致。切记，处理含有病原体的血清样本可能极为危险，在进行本操作时，必须始终采取防护措施，例如佩戴防护手套。