化学阻断抗体芯片复用高通量的复杂样品中特定蛋白糖基化的剖析
May 4th, 2012
在这项研究中，我们描述了一个复用高通量抗体芯片与外源凝集素的检测方法，可以在特定的蛋白质糖基化分析改进协议。该协议提供了新的可靠的试剂和显着降低，相比以前的程序的时间，成本和实验室设备的要求。
本视频文章介绍了使用化学封闭抗体微阵列获取肝细胞癌患者血清样品中 20 种不同糖蛋白的糖基化谱的程序：首先将糖蛋白特异性抗体直接打印到微阵列载玻片上，并封闭抗体聚糖以防止凝集素结合。当应用患者血清样品时，样品中的糖蛋白被抗体捕获。然后加入生物素化的聚糖结合蛋白以检测聚糖，并加入二偶联的 neu travain 以标记生物素化的凝集素。
然后扫描微阵列玻片以检测荧光，结果数据的分析揭示了样品蛋白质的糖基化谱。与 HPLC 等现有方法相比，该技术具有几个优点。该方法允许检测处于天然状态的单个糖蛋白。
同时筛选多种蛋白质的糖基化改变更快、更容易。好的，我们发现疾病的生物标志物，特别是癌症和肝癌的生物标志物，我们最仔细地研究了这些生物标志物，通常是糖基化的。我们发现检测特定糖形式的能力大大提高了生物标志物的敏感性和特异性。
因此，该测量可以深入了解 HCC 中多种血清蛋白的糖基化改变。它还可以应用于其他癌症和疾病（如胰腺癌、糖尿病和阿尔茨海默病）的病理学研究和生物标志物发现。演示该程序的是我实验室的技术人员 Chen Lu。
首先在冰上的 0.8 毫升微量离心管中制备抗体微阵列，在至少 40 毫升 PBS 中将用于微阵列打印的所有抗体稀释至每毫升 0.5 毫克/毫升的浓度，这里，26 种不同的抗体将用作阳性对照。还可以在 PBS 中制备等量的每毫升 0.5 毫克生物素化 BSA。使用移液器将 40 mL 每种抗体分装到冰上的 384 孔源板中。
然后在微阵列控制软件中，指定每个抗体位置。接下来，将板加载到微阵列上作为源。然后将 20 个路径微阵列玻片加载到微阵列上作为靶标。
将微阵列设置为打印 48 个相同的 subar 阵列，其中 27 种抗体和对照蛋白以 9 x 9 的模式一式三份点样。启动微阵列以打印抗体微阵列玻片。收集抗体微阵列载玻片并将其储存在装有干燥剂的载玻片盒中。
将盒密封在塑料袋中，以防止储存过程中蛋白质变性和载玻片受潮。将密封的微阵列载玻片储存在 4 摄氏度下，直至使用。该程序最困难和最重要的一个方面是化学封闭步骤。
为确保成功，在微阵列灯上打印足够数量的抗体至关重要。始终在实验前立即准备新鲜的 IDE 钠和抗原酸水细胞。并确保在 4 度避光下进行氧化程序。
从冰箱中取出微阵列玻片，将其平衡至室温 30 分钟。从存储盒中取出载玻片。将载玻片短暂浸入含有 0.1% 吐温 20 的 PBS 的洗涤盆中。
然后将玻片浸入含 0.1% 吐温的 15 毫摩尔乙酸钠缓冲液中 10 分钟。接下来，在 15 毫摩尔乙酸钠缓冲液中制备新鲜的 150 毫摩尔钠/碘酸盐，并将其转移到载玻片洗涤盆中，存放在冰箱中，避免光照直至使用。从乙酸钠缓冲液中取出玻片，将其放入装有新鲜硫酸钠的盆中，抗体面朝上。
用铝箔盖住盆以避免光线。然后将载玻片盆置于 4 摄氏度下，轻轻摇晃 2 小时。从盆中取出玻片，在乙酸钠缓冲液中短暂冲洗 3 次，持续 5 分钟。
将玻片放入 300 mL 新鲜制备的 10 毫摩尔氢谷氨酸封闭溶液中，在室温下孵育 2 小时，同时轻轻摇动。从腔室中取出载玻片，用含 0.1% 吐温的 PBS 洗涤 3 分钟。接下来，在玻片清洗池中，将微阵列玻片放入 300 毫升 1% BSA 的 PBS 溶液中，含 0.5% 补间，在室温下轻轻摇动 1 小时。
用含 0.1% 吐温的 PBS 冲洗玻片 3 次，持续 3 分钟。将玻片放在载玻片架上，以 1， 200 倍 G 的速度旋转 2 分钟，然后干燥微阵列玻片。为了分离每个 subar 阵列，在载玻片上印上蜡质网格。
将蜡印迹机在 70 摄氏度下预热 5 分钟后，将堵塞的微阵列切片装入蜡印迹机中，使抗体面朝向蜡。轻轻拉动手柄，将蜡均匀地压印在载玻片上。该方法可用于对单个样品进行糖分析，或用于测量多个样品中的单个糖表位。
在这里，我们将演示糖分析分析。首先将 40 微升血清稀释到 360 微升含有 0.1% 吐温 0.1% 桥 35 和 100 微克/毫升的 PBS 中，小鼠、大鼠、兔子、山羊和驴 IgG。该体积足以将 6 μL 稀释的血清溶液施加到每个子阵列上。
小心地将 6 微升稀释的样品或对照品涂抹到载玻片的每个子阵列中。将玻片在加湿盒中用湿纸巾在室温下孵育 1 小时。用含 0.1% 吐温的 PBS 冲洗玻片 3 次，持续 3 分钟。
然后以 1200 倍 G 旋转 2 分钟来干燥玻片。在 0.8 mL微量离心管中，在冰上的 PBS 吐温中以 10 mg/mL 的浓度制备 20 μL 生物素化聚糖结合蛋白。将 6 微升稀释的生物素化凝集素涂在载玻片的每个子阵列中，并在加湿载玻片盒中用湿纸巾在室温下孵育 1 小时。
像以前一样用含 0.1% 吐温的 PBS 冲洗载玻片 3 次后，在离心机中以 1200 倍 G 旋转 2 分钟来干燥载玻片。在冰上的 0.8 毫升微量离心管中，在 PBS 0.1% 吐温中制备 400 微升 10 毫克/毫升 DITE 5 49 标记的中性流氓。使用重复移液器将 6 微升 DITE 5 49 标记的 neut travain 涂在每个亚阵列上，并在孵育后在加湿载玻片盒中将载玻片在室温下孵育 1 小时。
用 PBS 0.1%吐温冲洗玻片 3 次，持续 3 分钟。在离心机中以 1200 倍 G 旋转 2 分钟，使其干燥。使用 10 毫米分辨率的荧光微阵列扫描仪扫描载玻片。
激光和 PMT 设置应尽可能强，同时确保未观察到饱和度。在阵列 Pro 3.2 中打开图像。根据显示抗体点位置的阵列图设置阵列模板。
小心地将每个模板圆圈与图像中的相应点对齐，将每个点的强度提取到 Excel 文件中以供进一步分析。一种抗体微阵列芯片，包含 48 个相同的 subar 阵列芯片，其中 26 种抗体抗 20 种血清糖蛋白和生物素。BSA 的设计和制造如本视频所述，以检验封闭程序的重要性。
在糖蛋白分析分析中，生成了两个相同的微阵列载玻片。一种未化学封闭，另一种是对照样品，上样到第 1 列和第 3 列的 subar 阵列上，混合的 HCC 血清样品上样到 subar 阵列上。在第 2 列和第 4 列中，有 22 个。
然后将对不同聚糖具有特异性的生物素化凝集素施加到每个子阵列上，如这些 subar 阵列图像所示。凝集素与对照柱中的捕获抗体结合，产生高背景，与非封闭微阵列中的血清负载柱无法区分。然而，当在化学封闭的抗体微阵列玻片上进行相同的实验时，对照柱中没有或非常低的与捕获抗体的结合，而血清负载柱中的抗原结合很高。
这些结果表明，化学封闭程序是测量抗体捕获的糖蛋白上的聚糖的关键步骤，通过遵循方案，一旦掌握，就可以获得 HCC 血清中 22 种糖蛋白的糖基化谱。如果执行得当，这项技术可以在 8 小时内完成。抗体在修饰后可能会失去对其抗原和其他特性的亲和力。
因此，重要的是要牢记这一点，并按照此程序在不同的抗体来源中使用几种不同的抗体。可以进行其他措施，例如使用相同的微射线载玻片检测每种蛋白质浓度，以回答其他问题，例如糖基化的改变是由于蛋白质表达水平的变化，还是仅仅由于每个蛋白质的糖基化改变。不要忘记，处理含有病原体的血清样品可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如防护手套。
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概述
本研究提出了一种增强型多重高通量抗体微阵列的协议，该协议具有凝集素检测功能，旨在对特定蛋白质的糖基化分析。与之前的技术相比，该新方法提供了可靠的试剂，并显著减少了时间、成本和设备需求。
关键研究组成部分
科学领域
- 糖基化分析
- 抗体微阵列技术
- 生物标志物发现
背景
- 糖基化是影响蛋白质功能的关键翻译后修饰。
- 目前的糖基化分析方法可能耗时且成本高昂。
- 需要改进的方法来进行有效分析。
- 本研究通过一种新方法解决了这些挑战。
研究目的
- 开发一种更高效的糖基化分析协议。
- 利用多重高通量抗体微阵列。
- 通过凝集素结合来增强检测能力。
使用的方法
- 在微阵列载玻片上印刷特定抗体。
- 阻断抗体糖链以防止凝集素结合。
- 应用患者血清样本捕获糖蛋白。
- 使用生物素化的糖链结合蛋白进行检测。
主要结果
- 成功从血清样本中捕获糖蛋白。
- 使用荧光分析检测糖基化谱。
- 展示了相对于现有方法（如HPLC）的优势。
- 能够分析单个糖蛋白的原始状态。
结论
- 新协议显著提高了糖基化分析的效率。
- 它为传统方法提供了一种可靠且经济的替代方案。
- 该技术可以促进糖蛋白分析的进一步研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables multiplexed, high-throughput profiling of protein glycosylation in complex biological samples, addressing a critical bottleneck in biomarker discovery and target validation. By reducing time, cost, and equipment requirements, it supports scalable analysis of glycosylation alterations linked to disease progression, particularly in oncology and metabolic disorders. The approach enhances predictive confidence in early-stage R&D by providing quantitative, reproducible glycan profiles that inform mechanistic de-risking and portfolio prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking specific glycoprotein glycosylation patterns to disease states such as hepatocellular carcinoma.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking through multiplexed capture and detection of 20+ glycoproteins from serum samples using a single microarray platform.
- Predictive Value: Supports target confidence by distinguishing glycosylation-driven biomarker alterations from changes in protein expression levels.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by enabling standardized, quantitative glycan profiling across multiple protein targets.
- Operational Value: Enhances assay reproducibility and throughput through chemical blocking of antibody glycans, minimizing background noise in lectin-based detection.
- Scalability: Enables platform reuse across sample sets via wax-grid subarray separation, allowing parallel profiling of single glycoepitopes in multiple samples.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase glycan profiling to preclinical validation by detecting disease-associated glycosylation shifts in HCC serum samples.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in biomarker interpretation by isolating glycan-specific signals from total protein abundance.
- Disease-relevant Application: Extends beyond hepatocellular carcinoma to pancreatic cancer, diabetes, and Alzheimer’s disease, supporting broad therapeutic area relevance.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling glycan profiling after target identification and before lead optimization, particularly when glycosylation is a known modulator of protein function or biomarker performance.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping glycosylation changes on specific proteins in complex mixtures.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized slide preparation, blocking, and detection steps that yield consistent fluorescence readouts.
- Analytics: Provides quantitative glycan measurements via biotinylated lectin binding and Dylight 549-Streptavidin detection, enabling inter-sample comparison.
- Translational Research: Links to preclinical continuity by profiling glycosylation alterations in serum samples reflective of disease state.
- Enterprise Reuse: Positions the microarray as a reusable platform for glycosylation screening across projects, reducing redundant assay development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in glycosylation-biomarker relationships.
- Operational Value: Improves standardization and reproducibility through simplified chemical blocking using glutamic acid hydrazide, enabling one-day workflow completion.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by lowering per-sample cost and accelerating go/no-go decisions in biomarker programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying glycosylation signatures with strong disease association early in discovery.
Implementation Considerations
- Requires expertise in antibody microarray handling, fluorescence detection, and glycan-binding protein reagents.
- Depends on access to a microarray printer, fluorescence scanner, and incubation chambers with temperature control.
- Necessitates cross-team standardization of antibody panels, lectin selection, and data analysis templates for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending to non-serum sample types such as tissue lysates or cell culture supernatants.
- Includes practical limitations such as antibody stability post-modification and the need for multiple antibody sources to mitigate affinity loss.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:19
Printing the Antibody Microarray
3:58
Chemically Blocking the Antibody Microarray
6:06
Blocking Non-specific Binding with BSA
6:47
Wax Imprinting
7:11
Applying Serum Samples
8:19
Applying Biotinylated Glycan-binding Protein
9:00
Applying Dye-labeled NeutrAvidin and Fluorescence Detection
10:03
Data Extraction and Analysis
12:08
Conclusion
