低亲和力受体-配体相互作用的细胞外蛋白微阵列技术
January 7th, 2019
在这里, 我们提出了一个方案来筛选细胞外蛋白微阵列, 以识别新的受体配体相互作用在高通量。我们还描述了一种利用蛋白质微珠复合物来增强瞬态蛋白相互作用的检测方法。
这种方法有助于回答蛋白质相互作用领域的关键问题，使细胞外蛋白质的检测具有新的结合性，既具有高通量，又具有高灵敏度。这种方法的主要优点是，只需几微克的蛋白质，就可以使用微阵列打印机生成数百张幻灯片。使用标准微型阵列进行幻灯片打印。
该仪器的容量为每次运行 57 张幻灯片，使用包含 48 个斑点引脚的打印头，每张幻灯片最多可容纳 8，000 个点。使用 384 个井板生成工作板，每孔从库存板中收集 10 微升样品。在使用微阵列进行幻灯片打印之前手动执行此步骤。
然后在60%湿度下将带毛刺型斑点针的蛋白质发现到环氧硅烷上滑动，以防止蛋白质斑点脱水。Cy3标记牛血清白蛋白可以在每个蛋白质样本之间重复发现，以可视化掩码拟合阵列。打印后，从加湿环境中取出蛋白质微阵列幻灯片。
接下来，使用超声波雾器生成沉淀到滑动表面的阻塞溶液的细雾。然后，用 PBST 中的 5% 牛奶在一夜之间阻塞幻灯片，以对表面进行测量。将幻灯片存放在零下 20 摄氏度的 50%甘油中，以防止结冰。
细胞外蛋白之间的相互作用通常以低亲和力为特征。为了能够检测这些相互作用，通过增加结合的狂热性，我们开发了一种基于捕获查询蛋白的多价方法，这些蛋白表示为蛋白质 A 涂层微珠上的 FC 标记细胞外域。旋转带的载波IgG，该载波已标有Cy5单一反应染料，如文本协议中所述。
要计算查询蛋白和Cy5 IgG的摩尔比，将查询蛋白的分子量除以IgG的分子量，乘以每毫升40微克，以确定所需的Cy5 IgG的浓度。一旦确定所有比率形成微珠蛋白复合物，结合FC标记查询和Cy5 IgG与蛋白质 A 微珠。在室温下将 PBS 中的悬架混合在管旋转器上 30 分钟，防止光线。
要开始筛选，请先在室温下加热准备好的幻灯片，然后再装载到杂交站。要执行筛选，请先用 PBST 清洗微阵列一分钟，以去除残留的甘油。在PBS 5%牛奶中加载200微升1毫克每毫升蛋白质 A，孵育30分钟，以防止未合成的蛋白质微珠与微阵列中可能存在的FC标记蛋白结合。
杂交站用PBST清洗幻灯片后，加载200微升的查询微珠复合物，每毫升蛋白质 A 含量为1毫克，孵育30分钟。杂交站对滑梯进行杂交和清洗后，用水冲洗滑梯，并将它们放在单独的 50 毫升锥形管中。在 900 次 G 下旋转 5 分钟，将管材干燥。
最后，使用适合检测 Cy3 和 Cy5 荧光的微型阵列扫描仪扫描幻灯片，分别以 532 和 635 纳米的速度检测 Cy3 和 Cy5 荧光。此处显示的是打印幻灯片的代表性图像。Cy3 标记的牛血清白蛋白斑为绿色。
这些斑点是重复打印的，作为印刷过程的质量控制。此处显示了一种孤立的蛋白质的代表性结果，该结果经过筛选，用于识别使用细胞外蛋白微阵列技术进行结合伙伴的识别。重复的红色斑点被识别为筛选查询蛋白的命中。
这种方法是高度通用的，可用于打印各种蛋白质库，他们特定的蛋白质系列或蛋白质的大型汇编，如我们的。任何感兴趣的蛋白质都可以被评估。在尝试此过程时，必须小心处理幻灯片，并确保它们不会干涸，以防止打印的蛋白质的活动损失。
在感兴趣的蛋白质的屏幕之后，强烈建议进一步验证使用正交技术（如表面质感共振）观察到的任何命中。这项技术在开发之后，为研究人员研究细胞外蛋白质在人类中的相互作用铺平了道路。
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概览
本文介绍了一种用于筛选胞外蛋白质微阵列的协议，以高通量识别新型受体-配体相互作用。它还描述了一种使用蛋白质-微珠复合物来增强瞬时蛋白-蛋白相互作用检测的方法。
关键研究组成部分
科学领域
- 蛋白质-蛋白质相互作用
- 胞外蛋白质
- 高通量筛选
背景
- 理解受体-配体相互作用在生物学中至关重要。
- 瞬时蛋白-蛋白相互作用通常难以检测。
- 微阵列为高通量分析提供了平台。
- 蛋白质-微珠复合物可以提高检测灵敏度。
研究目的
- 识别胞外蛋白质的新型结合伴侣。
- 提高瞬时相互作用检测的灵敏度。
- 利用微阵列技术进行高效筛选。
使用的方法
- 使用微阵列打印机生成幻灯片。
- 使用384孔板制备工作板。
- 在幻灯片印刷前手动准备样本。
- 每次运行高容量打印，每次运行多个幻灯片。
主要结果
- 成功识别新型受体-配体相互作用。
- 在检测瞬时相互作用方面表现出高灵敏度。
- 高效地使用最少的蛋白质量进行广泛筛选。
- 仅使用几微克的蛋白质就能生成数百张幻灯片。
结论
- 该协议增强了研究蛋白质相互作用的能力。
- 微阵列技术适用于高通量分析。
- 这种方法可以显著推进蛋白质生物学研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-throughput extracellular protein microarray technology addresses a critical bottleneck in mapping low-affinity receptor-ligand interactions, which are central to target validation and therapeutic discovery. By enabling robust detection of transient extracellular protein interactions with minimal sample requirements, this approach enhances predictive confidence at the earliest stages of biopharma R&D. Its scalability and sensitivity support portfolio-wide interrogation of novel targets and de-risking of biological hypotheses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic identification of novel extracellular binding partners for target validation.
- Supports biological de-risking by revealing previously undetectable low-affinity interactions.
- Facilitates rapid triage of candidate targets based on interaction profiles.
Screening & Assay Development
- Prepares validated protein microarrays for downstream screening workflows.
- Standardizes detection of weak protein-protein interactions for reproducible assay development.
- Enables high-throughput, quantitative evaluation of extracellular protein libraries.
Translational & Preclinical Research
- Aligns discovery findings with disease-relevant extracellular signaling pathways.
- Provides continuity from target identification to preclinical validation of interaction networks.
- De-risks translational progression by confirming functional extracellular interactions.
Pipeline & Workflow Integration
This technology integrates at the interface of early discovery and lead identification, supporting hypothesis-driven screening and mechanistic de-risking of extracellular targets.
- Discovery Biology: Enables high-sensitivity mapping of receptor-ligand networks for hypothesis testing.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative microarray outputs for comparative analysis.
- Analytics: Provides fluorescence-based readouts to support statistical evaluation of binding events.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by confirming extracellular protein interactions relevant to disease.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable platform for repeated interrogation of diverse protein libraries across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target selection.
- Operational Value: Standardizes high-throughput workflows with minimal protein consumption and robust reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital allocation by clarifying extracellular interaction landscapes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and pathways for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein expression, labeling, and microarray handling.
- Needs access to microarray printers, hybridization stations, and fluorescence scanners.
- Demands rigorous cross-team standardization for slide preparation and data analysis.
- Adaptable to various protein families and library sizes with careful protocol adherence.
- Dependent on orthogonal validation (e.g., surface plasmon resonance) for hit confirmation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:28
Extracellular Protein Microarray Printing
1:55
Preparation of Multivalent Bait Complexes
3:09
Extracellular Protein Microarray Screening
4:36
Results: Evaluation of Extracellular Protein Microarray Slide Printing and Screen of an Orphan Query Protein
5:11
Conclusion
