用于高通量检测低亲和力受体-配体相互作用的细胞外蛋白微阵列技术

该方法能够通过高通量且高灵敏度地检测细胞外蛋白的新型结合伴侣，帮助解答蛋白质-蛋白质相互作用领域的关键科学问题。该方法的主要优势在于，仅需几微克蛋白即可利用微阵列打印机生成数百张芯片。请使用标准的微阵列点样仪进行芯片打印。

该仪器每次运行可处理57张载玻片，使用带有48个点样针的打印头，每张载玻片最多可容纳8,000个点样。使用384孔板从储备板中制备工作板，每孔加入10 µL样品。此步骤需在使用微阵列仪进行载玻片打印前手动完成。

然后使用毛细管点样针在60%湿度条件下将蛋白质点样至环氧硅烷玻片上，以防止蛋白质斑点脱水。可在每份蛋白质样品之间重复点样Cy3标记的牛血清白蛋白，用于可视化芯片以进行掩模配准。打印完成后，将蛋白质微阵列玻片从加湿环境中取出。

接下来，使用超声波雾化器产生阻断溶液的细雾，使其沉降在载玻片表面。然后，在 PBST 中用 5% 脱脂奶粉于 4°C 过夜封闭载玻片，以钝化表面。将载玻片置于含 50% 甘油的溶液中，于 -20°C 保存，防止冻结。

细胞外蛋白之间的相互作用通常具有较低的亲和力。为了通过提高结合亲合力来检测这些相互作用，我们开发了一种多价方法，该方法基于将表达为Fc标签细胞外结构域的目标蛋白捕获在涂有蛋白A的微珠上。按照文本方案中所述，使用Cy5单反应性染料标记载体IgG并进行离心。

为计算目标蛋白与Cy5标记IgG的摩尔比，将目标蛋白的分子量除以IgG的分子量，再乘以40 微克/毫升，以确定所需Cy5 IgG的浓度。在确定所有比例后，通过将FC标签的目标蛋白和Cy5 IgG与蛋白A微珠混合，形成微珠-蛋白复合物。将悬浮液置于PBS中，在室温下避光，使用管式旋转仪孵育30分钟。

开始筛选前，将制备好的载玻片在室温下预热，然后放入杂交仪中。进行筛选时，首先用PBST洗涤微阵列1分钟，以去除残留的甘油。加入200微升含5%脱脂奶粉的PBS缓冲液，其中含有1毫克/毫升的蛋白A，孵育30分钟，以防止未结合的蛋白A微珠与微阵列中可能存在的FC标签蛋白发生非特异性结合。

在杂交仪用PBST洗涤载玻片后，加入200微升待测微珠复合物，同时加入1毫克/毫升的蛋白A，孵育30分钟。杂交仪完成杂交及洗涤步骤后，用清水冲洗载玻片，并将其放入各自的50毫升锥形管中。以900 × g离心5分钟，干燥管壁。

最后，使用适用于检测Cy3和Cy5荧光的微阵列扫描仪对玻片进行扫描，分别以532和635纳米波长激发。此处显示的是一个打印玻片的代表性图像。Cy3标记的牛血清白蛋白点呈绿色。

这些点样重复打印了两次，以作为打印过程的质量控制。此处展示的是利用细胞外蛋白微阵列技术筛选孤儿蛋白结合伴侣的代表性结果。重复出现的红色点样被鉴定为筛选查询蛋白的阳性信号。

本方法具有高度通用性，可用于打印各种蛋白质文库，无论是特定的蛋白质家族，还是像我们这样的大量蛋白质集合。任何感兴趣的蛋白质均可通过此方法进行评估。在操作过程中，务必小心处理载玻片，并确保其保持湿润，以防止所打印蛋白质的活性丧失。

在筛选出目标蛋白后，强烈建议使用正交技术（如表面等离子共振）进一步验证所观察到的阳性结果。该技术自开发以来，为研究人员研究人类细胞外蛋白相互作用开辟了道路。