形态分析果蝇幼虫外周感觉神经元树突和轴突使用遗传马赛克

该程序的总体目标是可视化果蝇、幼虫、树突状、树枝化神经元的详细形态。这是通过首先收集胚胎、老化并通过热休克诱导的脂肪酶表达生成 GFP 标记的基因克隆来实现的。第二步是选择具有荧光神经元克隆的幼虫，并拍摄其树突状 ABA 的图像。

对熔岩成像后，对它们进行解剖、固定和免疫染色，以便可以安装，并且可以通过共聚焦免疫荧光显微镜观察它们的树突状港和轴突末端形态。今天，我将演示一种使用遗传 mos 对 sula 下外周传感器 OID 和外显子进行形态学分析的方案。这种方法可以帮助回答神经发育领域的关键问题，例如控制神经身份、树突状口腔形状和外部布线的遗传程序是什么？

通过在苹果汁板上收集胚胎来开始此协议。热休克在 38 摄氏度的水浴中进行，持续时间根据胚胎遗传学和所需的克隆大小而变化。对于该协议，使用 pand 树突状树枝化神经元驱动器从胚胎中生成 markum 克隆 在热休克之前，将标记胚胎保持在 25 摄氏度，被湿润和组织包围两个小时。

通过使用空板和 para fill 使收集板可放入水中，为热休克做好准备。然后将标记胚胎热休克一小时，以产生小克隆或单个神经元标记。为了增加克隆的数量，使用延长热休克，在浴中孵育 45 分钟，然后在室温下孵育 30 分钟，然后在浴中再孵育 30 分钟。

要生成翻转克隆，请连续 24 小时收集胚胎。此协议使用特定于 4 类的驱动程序。热休克后一小时对翻转的胚胎进行热休克。

将收集板放入 10 厘米的培养皿中，周围环绕着湿润物和纸巾和培养物。胚胎培养期间，胚胎温度为 25 摄氏度，并根据需要补充酵母糊。因为营养对神经元发育有严重影响。

保持培养物，直到可以短暂收集星形熔岩中的第三龄幼虫，并在自来水中轻轻冲洗第三龄幼虫并将它们转移到琼脂平板上。现在使用强大的荧光解剖显微镜和昆虫镊子检查幼虫。识别体壁中具有 GFP 阳性神经元的幼虫，并将它们转移到滴 80% 甘油的凹陷载玻片上。

在载玻片上放置盖玻片以固定熔岩。确保熔岩和盖玻片之间没有空气残留。使用标准共聚焦显微镜通过熔岩角质层观察感兴趣的神经元。

要改变熔岩的位置以改善视角，请轻轻推动盖玻片以滚动熔岩。通过使用昆虫镊子将熔岩转移到 SIL 护板来开始此协议。然后将其固定在前端和后端。

然后加入无钙 HL 3.1 缓冲液。现在切开垂直于前后轴的熔岩两端的一半。然后沿两个气管之间的中线切开。

在轻轻移除肠道之前，小心地切断每个单独的气管与体壁的连接。这使 PNS 和 CNS 之间的节段神经保持完整。将幼虫仍然固定在细胞保护板上，将其固定在 PBS 中的 4% 对甲醛溶液中，在室温下轻轻旋转的摇床上放置 20 分钟，在不到 5 分钟的时间内进行每次解剖。

否则，树突状授权神经元的虱卵将开始降解。固定后，去除多余的幼虫组织。然后用 PBST 清洗鱼片 3 次，每次清洗 10 分钟。

洗涤后，将幼虫在封闭溶液中室温孵育 20 分钟，轻轻摇动。封闭完成后，用一抗溶液替换封闭溶液。将样品放入被湿润物和组织包围的小塑料容器中，并在 4 摄氏度下孵育过夜 第二天，在室温下继续孵育一小时。

然后在 PBST 中清洗熔岩片 6 次，每次 10 分钟。现在加入二抗，将鱼片放入深色容器中，以防止 Fluor 发生光漂白。将鱼片在室温下孵育数小时或在 4 摄氏度下孵育过夜，然后在室温下孵育 1 小时。

最后，在 PBST 中清洗鱼片 6 次，每次清洗 10 分钟。然后组织就可以封片了。要使轴突末端可视化，只需将幼虫圆角质层面朝下安装在凹陷玻片中的 80% 甘油中即可。

为了更清晰地获得树突图像，请使用 PLL 涂层盖玻片制作永久安装。要对盖玻片进行编码，请用 PLL 的等分试样。将其调至 10 毫升双蒸水，并加入 20 微升 Kodak Photo Flow。

将盖玻片浸入 PLL 溶液中 30 分钟，取出后风干。然后用水和空气短暂冲洗。再次擦干它们。

重复此过程两次。从 PLL 浴开始，处理过的盖玻片将持续大约一个月。现在将解剖的幼虫鱼片肌肉面向下安装到 PLL 盖玻片上的一滴 PBS 中。

鱼片将使用一张薄纸快速粘附在盖玻片上。尽可能多地去除液体，但不要让它完全变干。接下来，对幼虫片进行脱水，然后进行一系列 10 分钟的乙醇浴，从 35% 乙醇开始，然后是 50%，然后是 70%，然后是 95%，然后是 100%，最后是第二次 100% 乙醇浴。

乙醇浴之后，在二甲苯中浸泡两到三个 10 分钟。然后将一滴 DPX 滴在干净的载玻片上，小心地将盖玻片放入 DPX 中，将其正面朝下填充。将载玻片置于黑暗中，等待一天让 DPX 凝固。

在使用活体和聚焦显微镜对组织进行成像之前，可以捕获这样的图像。4 类树突状树枝化神经元的整个心轴。这是来自 IHC 标记的 3 类神经元的树突状乔木的特写，该神经元已被正确固定以保持形态。

插图显示了解剖和固定不成功后可能发生的降解。此叠加图显示了 CNS 中的单个 4 类轴突末端。轴突用绿色的抗 GFP 标记，所有 4 类白蚁 a 与洋红色的抗 CD 2 共染色。

在尝试此过程时，重要的是要记住通过追踪从外周到 CNS 的轴突来快速解剖和固定样本。请记住，每个身体中的 PNS 神经元会将投射分割到发泄神经代码的认知段。此外，如果您只想可视化树突，请在解剖过程中去除 CNA，并且可以在试管附加而不是平板上进行染色。

安装这些切片进行树枝状成像时，首先用口钩切掉头部，然后用火花切掉后部。为了一个愉快的准备。