Name: 形态分析果蝇幼虫外周感觉神经元树突和轴突使用遗传马赛克 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 了解利用遗传马赛克和GFP标记克隆技术对果蝇幼虫外周感觉神经元树突与轴突进行形态分析的方法。该方案通过热激诱导、激光共聚焦免疫荧光显微成像，为神经发育研究提供可靠的实验指南。

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作者感谢理化学研究所（RIKEN）提供的经费支持。我们还感谢Cagri Yalgin、Caroline Delandre和Jay Parrish在遗传学与免疫组织化学实验方案方面的有益讨论。

1. 试剂的准备
<ol>
 <li>制备无 Ca++ 的 HL3.1 生理盐水28。
 <ol>
 <li>单位为 mM：70 NaCl、5 KCl、20 MgCl2、10 NaHCO3、5 HEPES、115 蔗糖和 5 海藻糖；pH 值调至 7.2。过滤除菌后于 4°C 保存。 
 注意：无 Ca++ 溶液可防止解剖过程中肌肉收缩。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>制备多聚-L-赖氨酸（PLL）包被的盖玻片。
 <ol>
 <li>将 100 mg PLL 溶解于 4.2 ml 水中，分装为每管 300 μl 至离心管中，于 -20°C 冻存。</li>
 <li>在包被盖玻片前，先取出一管解冻，用 ddH2O 定容至 10 ml，再加入 20 μl Kodak Photo-Flo；最终 PLL 浓度为 0.7 mg/ml。</li>
 <li>将盖玻片浸入 PLL 溶液中 30 分钟，取出后干燥，再用清水快速漂洗并再次干燥。重复此步骤两次。处理后的盖玻片可保存约一个月。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
2. 遗传杂交
<ol>
 <li>生成MARCM克隆。以下是一个使用泛DA驱动子的例子11,27： 
 FRT2A x hsFLP; Gal4109(2)80, UAS-mCD8::GFP; tub-Gal80 FRT2A/SM5-TM6B</li>
 <li>生成Flp-out克隆。以下是一个使用IV类特异性驱动子的例子8： 
 ppk-Gal4 x yw, hsFLP;UAS-FRT-CD2,y+-stop-FRT-mCD8::GFP</li>
</ol>
3. 胚胎的收集
<ol>
 <li>保持 果蝇 在25°C下将果蝇转移至收集瓶中，并在苹果汁琼脂平板上收集胚胎29 用一层薄薄的酵母糊涂抹均匀30,31.</li>
</ol>
4. 胚胎的热激处理
<ol>
 <li>将一个空培养皿与已放置胚胎的苹果汁琼脂培养皿相对放置，用Parafilm密封两个培养皿的周围（图2）。</li>
 <li>热激过程中，将培养皿浸入水浴，并用金属重物压住使其保持在水下。</li>
 <li>对于MARCM胚胎
 <ol>
 <li>收集胚胎2小时，随后在直径10 cm的培养皿中于25°C条件下继续孵育2小时，培养皿周围需放置湿润的吸水纸。 
 注意：调整热激程序会改变克隆产生的频率。</li>
 <li>若希望获得较少数量的克隆，以实现单个孤立神经元为目标，将培养皿在38°C水浴中热激1小时。</li>
 <li>若希望获得较多数量的克隆，先在38°C水浴中热激45分钟，室温恢复30分钟，再进行额外30分钟的热激。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>收集Flp-out胚胎24小时，并在38°C条件下热激1小时。</li>
</ol>
5. 克隆筛选
<ol>
 <li>热激后，取下防水装置的盖子，将苹果汁琼脂平板放入直径10 cm的培养皿中，并用湿润的纸巾包围。在25°C下培养胚胎及后续幼虫，直至进入游走型3rd龄幼虫阶段。 
 注意：培养条件，尤其是营养状况，已被证明会影响DA树突分支形态32,33。确保幼虫在整个发育过程中始终可接触到酵母糊；根据需要进行观察并及时补充酵母糊。</li>
 <li>从本实验方案的此步骤开始，使用昆虫镊子轻柔地操作幼虫。</li>
 <li>用自来水短暂而轻柔地冲洗幼虫，然后将其转移至琼脂平板上。 
 注意：此步骤可减少幼虫体表食物或污物引起的背景自发荧光。</li>
 <li>在高倍荧光解剖显微镜下观察幼虫，筛选出体壁中具有GFP阳性神经元/细胞的幼虫。</li>
</ol>
6. 体内 树突成像
<ol>
 <li>将幼虫放入凹面载玻片中，加入少量80%甘油。盖上盖玻片以固定幼虫，确保幼虫与盖玻片之间无气泡残留。</li>
 <li>轻轻推动盖玻片，使幼虫缓慢滚动，以便观察目标神经元。通过共聚焦显微镜对mCD8::GFP标记的树突分支进行成像。</li>
</ol>
7. 幼虫解剖
开始前注意事项： 多巴胺能神经元树突在解剖开始后会迅速退化。每只幼虫的解剖操作应在5分钟内完成，以确保树突形态良好。
<ol>
 <li>在Sylgard培养皿上解剖游走期3rd龄幼虫，方法如前所述34，但作如下修改：
 <ol>
 <li>若需成像多巴胺能神经元轴突末端，应确保中枢神经系统（CNS）完整，节间神经未断裂。打开幼虫体壁后，首先小心剪断气管与体壁之间的连接，然后轻柔地移除整个肠道。</li>
 <li>若仅对树突进行成像，可移除中枢神经系统，以便获得更平整的样本封片。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
8. 幼虫肌片的固定与封闭
<ol>
 <li>将幼虫仍固定在Sylgard板上，于室温下在含4% PFA的PBS中，在轻轻旋转的摇床上固定20分钟。</li>
 <li>固定后去除幼虫组织残留（如脂肪体、气管等）。</li>
 <li>在Sylgard板和摇床上用PBST（含0.1% Triton X-100的PBS）洗涤3次，每次10分钟。若观察轴突末端，保持肌肉展开样本留在Sylgard板上。（若染色树突，可在本步骤将幼虫展开样本转移至0.5 ml离心管中34）</li>
 <li>在摇床上，于室温下用含5%正常驴血清（NDS）的PBST封闭幼虫20分钟。</li>
</ol>
9. 幼虫肌片染色
<ol>
 <li>移除封闭液，加入一抗（溶于5%NDS/PBST中），于4°C过夜孵育，将样品管置于小型密闭容器内，并用湿润的纸巾包裹以保持湿度。</li>
 <li>将样品管从4°C取出，在室温下继续孵育1小时。</li>
 <li>用PBST洗涤6次，每次10分钟。加入二抗（溶于5%NDS/PBST中），避光孵育以防止荧光染料发生光漂白34。</li>
 <li>可在室温下孵育2小时，或在4°C过夜孵育后，再于室温孵育1小时。</li>
 <li>用PBST洗涤幼虫6次，每次10分钟，随后进行封片处理。</li>
</ol>
10. 幼虫肌瓣用于树突分支观察的制片
<ol>
 <li>使用解剖剪或解剖刀将每条幼虫肌片尽可能平展地固定，切去头部（包括口钩）和尾部（包括气门）34。</li>
 <li>将幼虫肌片置于载玻片上，表皮面朝下，用80%甘油封片，并用指甲油密封盖玻片边缘，制成“快速”封片标本34。</li>
 <li>如需永久封片并获得更清晰的图像
 <ol>
 <li>将解剖好的幼虫肌片肌肉面朝下放置在经多聚赖氨酸（PLL）处理的盖玻片上的一滴PBS液滴中，肌片会迅速黏附于盖玻片。</li>
 <li>封片后尽可能吸除多余液体，但切勿使其完全干燥。</li>
 <li>将带有肌片的盖玻片依次浸入乙醇系列溶液中：35%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇，最后两次分别置于100%乙醇中，每次10分钟（第二次100%乙醇需频繁更换）；最后用二甲苯洗涤2–3次，每次10分钟。</li>
 <li>在洁净的载玻片上滴一滴DPX封片剂（Distyrene Plasticizer Xylene），小心将盖玻片肌片面朝下覆盖其上。置于避光处，待DPX固化一天后再进行成像。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
11. 幼虫肌片的制备以观察轴突末端
<ol>
 <li>在解剖、固定和染色过程中，保持周围神经系统（PNS）与中枢神经系统（CNS）之间的节段神经完整，以便追踪从外周感觉神经元胞体至腹神经索（VNC）的轴突。</li>
 <li>将每条幼虫的剥离体壁样本以角质层朝下的方向置于含80%甘油的凹面载玻片中。在共聚焦显微镜下追踪从DA神经元胞体至腹神经索（VNC）的轴突。注意：每个体节的体壁中的PNS神经元投射至腹神经索（VNC）的对应节段。</li>
</ol>
12. 代表性结果：
代表性结果如图3-5所示。图3展示了一个IV类da神经元的完整树突形态，已捕获 体内 在共聚焦显微镜下观察。图4显示了经免疫组织化学标记的III类神经元树突分支部分的放大图像，该样本经过正确固定以保持形态结构；插图则显示了在解剖和固定不成功时可能出现的降解现象（均使用抗GFP抗体染色）。图5显示了中枢神经系统中单个IV类轴突末端（抗GFP，绿色）；所有IV类末端均与抗CD2抗体共染（品红色）。
<img alt="从细胞培养到荧光显微镜的实验流程，展示放大倍数和成像序列示意图。" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 1"> 
图 1 实验方案概览。a) 收集胚胎并进行热激处理。b) 选取具有GFP阳性DA神经元克隆的幼虫，对活体幼虫中GFP标记的树突分支进行成像。c) 解剖幼虫，随后对肌肉组织进行免疫组织化学染色。d) 将染色后的肌肉组织装片，然后对DA神经元克隆的树突分支及轴突投射进行成像。
<img alt="培养皿细菌培养、抗生素测试、实验结果比较、抑菌圈。" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 2"> 
图 2 为热激准备苹果汁琼脂平板。取该平板（白色箭头，a-b），在其上方叠加第二个培养皿（红色箭头，b），并用封口膜（Parafilm）在周围密封（蓝色箭头，b）。
<img alt="Fluorescence microscopy image of retinal neuron network structure; visualization of branching morphology." src="/files/ftp_upload/3111/3111fig3.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Figure 3"> 
图3 体内 表达 mCD8::GFP 标记的 MARCM 克隆（基因型同 2.1）的树突分支图像，代表一只 3 龄幼虫的 IV 类（v'ada）神经元rd 龄期幼虫。比例尺为50μm。
<img alt="带有荧光标记的神经元树突示意图；用于神经生物学研究的显微图像。" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig4.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 4"> 
图 4 经抗 GFP 抗体染色的 class III 神经元（ddaA）mCD8::GFP 标记的 MARCM 克隆，显示成功解剖和固定后具有良好的形态（绿色）。插图显示解剖和固定失败后出现的树突降解现象（白色箭头，品红色）。比例尺为 25μm。
<img alt="Fluorescence microscopy image of neuronal structure; nerve pathways highlighted in magenta and green." src="/files/ftp_upload/3111/3111fig5.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Figure 5"> 
图5 3rd 三龄幼虫腹神经索。使用抗GFP抗体（绿色）检测到单个Flp-out克隆的VI类（vdaB）轴突末端（基因型同2.2）。抗CD2抗体标记所有IV类轴突末端（紫红色）。比例尺为25μm。

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<li>Medina, P. M., Swick, L. L., Andersen, R., Blalock, Z., Brenman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+forward+genetic+screen+for+identifying+mutations+affecting+larval+neuronal+dendrite+development+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel forward genetic screen for identifying mutations affecting larval neuronal dendrite development in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 172, 2325-2335 (2006).</li>
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<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Sugimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+developmental+modes+and+lesion-induced+reactions+of+dendrites+of+two+classes+of+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons.</a> J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).</li>
<li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Watching+a+synapse+grow%3A+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li>
<li>Landgraf, M., Sanchez-Soriano, N., Technau, G. M., Urban, J., Prokop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+the+Drosophila+neuropile%3A+a+strategy+for+the+standardised+characterisation+of+genetically+amenable+neurites%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Charting the Drosophila neuropile: a strategy for the standardised characterisation of genetically amenable neurites.</a> Dev Biol. 260, 207-225 (2003).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

Drosophila 幼虫的 DA 神经元模型为研究控制神经元形态和神经环路形成的机制提供了一个优良的遗传系统。通常使用 MARCM 技术对 DA 神经元克隆进行标记和产生。在 MARCM 实验中，我们可使用泛神经元特异性驱动子（例如 Gal4c155）或 DA 神经元特异性驱动子。使用泛神经元驱动子时，可直接利用公共品系保藏中心广泛提供的多种果蝇品系。然而，使用 DA 神经元特异性驱动子可能更具优势，因为标记的克隆不会在中枢神经系统（CNS）中产生，而这些克隆可能会干扰对 DA 轴突末端的分析。常用的 DA 神经元特异性 Gal4 品系列表可参见 Shimono 等人（2009）27。当研究人员希望同时利用 Gal4-UAS 双元系统35异位表达某个基因，并在单个标记神经元中测量其形态时，Flp-out 技术可能特别有用。此外，本文所介绍的成像方案也可单独用于使用 Gal4-UAS 系统35标记 DA 神经元的情况。
如果缺乏性能良好的荧光解...

<table><tbody><tr><td>SZX16 荧光解剖显微镜（配备 GFPHQ 滤光片）</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>活体昆虫镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>26030-10</td><td></td></tr><tr><td>26 mm × 76 mm 凹面载玻片</td><td>Toshinriko Co.</td><td>T8-R004</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184（或 Silpot 184）</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-1524</td><td>该产品已被证明效果最佳</td></tr><tr><td>DPX 封片介质</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44581</td><td></td></tr><tr><td>兔抗 GFP 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A-11122</td><td>稀释比例 1:500</td></tr><tr><td>大鼠抗 CD8 抗体</td><td>Caltag</td><td>5H10</td><td>稀释比例 1:200</td></tr><tr><td>小鼠抗 CD2 抗体</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA443R</td><td>稀释比例 1:700</td></tr><tr><td>小鼠抗 Fasciclin2 抗体</td><td>DSHB</td><td>1D4</td><td>稀释比例 1:10</td></tr></tbody></table>

形态学分析 果蝇 利用遗传镶嵌体研究幼虫外周感觉神经元的树突和轴突

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

神经系统发育需要精确指定神经元的位置和身份，随后进行准确的神经元类别特异性树突发育和轴突连接。近年来，果蝇幼虫外周神经系统中的树突状分支（DA）感觉神经元已成为研究树突发育和轴突投射机制的重要模型。 果蝇 幼虫外周神经系统（PNS）已成为研究神经元分化普遍机制及类别特异性机制的有力遗传模型。 
DA神经元主要分为四类（I-IV）。1根据树突分支复杂性递增的顺序命名，其分化过程的遗传调控具有类别特异性的差异2-10. 多巴胺能（DA）感觉系统是研究控制树突形态分子机制的实用模型11-13 因为：1）可以利用果蝇中强大的遗传学工具，2）多巴胺能神经元的树突分支仅在光学透明的幼虫表皮下方以二维方式延展，便于高分辨率成像观察 体内3）不同类别神经元树突形态的多样性有助于进行比较分析，以发现调控简单型与高度分支型树突结构形成的关键因素；4）不同多巴胺能神经元具有典型且可辨识的树突分支形态，有利于开展形态计量学的统计分析。
多巴胺能神经元的活动可调节幼虫运动中枢模式发生器的输出14-16。不同类型的多巴胺能神经元具有不同的感觉模态，其激活可引发不同的行为反应14,16-20。此外，不同类型神经元的轴突在黑腹果蝇（Drosophila）幼虫腹神经索（VNC）中枢神经系统中的投射具有典型的模式21。这些轴突投射以拓扑方式表征了多巴胺能神经元的感觉模态及其树突区域在体壁上的位置7,22,23。因此，研究多巴胺能神经元轴突投射可用于阐明拓扑映射机制7,22,23，以及调控幼虫运动的简单神经环路的连接方式14-17。
本文提供了一种实用指南，用于通过MARCM（利用可抑制细胞标记物的嵌合体分析）24和Flp-out22,26,27技术（如图1所示）标记多巴胺能神经元，从而生成并分析遗传嵌合体1,10,25。

Drosophila 幼虫外周神经系统中的树突分支感觉神经元是研究神经元分化普遍机制及神经元类型特异性机制的有用模型。本文提供了一种实用指南，用于构建和分析树突分支感觉神经元的遗传嵌合体。

神经系统发育需要精确指定神经元的位置和身份，随后是准确的神经元类别特异性树突……

本实验的总体目标是观察果蝇幼虫树突状分支神经元的精细形态。首先通过收集胚胎并培养至相应发育阶段，利用热激诱导脂酶表达，产生GFP标记的遗传克隆，从而实现这一目标。第二步是筛选出具有荧光神经元克隆的幼虫，并对其树突ABAs进行成像。成像后，将幼虫解剖、固定并进行免疫染色，以便将其封片，并通过共聚焦免疫荧光显微镜观察其树突分支和轴突末端的形态。今天我将演示一种利用遗传镶嵌技术对梭状下部外周感觉神经元及其轴突进行形态学分析的实验方案。该方法有助于回答神经发育领域中的一些关键问题，例如：调控神经元身份、树突形态以及外部连接方式的遗传程序是什么？首先在苹果汁培养基平板上收集胚胎。热激处理在38摄氏度的水浴中进行，持续时间根据胚胎的遗传背景和期望的克隆大小而定。本实验方案中，使用带有 pan 型树突状分支神经元驱动子的胚胎来产生 markum 克隆。热激前，将标记胚胎置于25摄氏度环境中，并用湿润的组织包裹，保持两小时。通过使用空板和封口膜将收集板处理为可浸入式，以准备用于热激的培养板。然后对标记胚胎进行一小时的热激处理，以产生少量克隆或单个神经元标记。为增加克隆数量，可采用延长的热激程序：先在水浴中孵育45分钟，随后在室温下放置30分钟，再放入水浴中继续孵育30分钟。为了产生flipout克隆，需连续收集24小时的胚胎。本方案使用一种特异于class four的驱动子。在热激后，对flipout胚胎进行一小时的热激处理。将收集板放入直径10厘米的培养皿中，周围放置湿润的组织并进行培养。胚胎培养过程中需在25摄氏度条件下监测，并根据需要补充酵母糊。因为营养对神经元发育具有关键影响。继续培养至可收集游走期三龄幼虫，小心轻柔地用自来水冲洗三龄幼虫，然后转移至琼脂平板上。现在使用高倍荧光解剖显微镜和昆虫镊子观察幼虫。鉴定体壁中具有GFP阳性神经元的幼虫，并将其转移至含有1滴80%甘油的凹面载玻片中。将盖玻片置于载玻片上以固定幼虫，确保幼虫与盖玻片之间无气泡残留。采用标准共聚焦显微镜透过幼虫角质层观察目标神经元。为了调整熔岩的位置以获得更佳的观察角度，可轻轻推动盖玻片使熔岩滚动。本方案首先使用昆虫镊子将熔岩转移至SIL防护板上，然后在其前端和后端将其固定。然后加入无钙 HL 3.1 缓冲液。现在沿背腹轴垂直方向，将气管两端各切开一半。接着沿两条气管之间的中线切开。在轻轻移除肠道之前，仔细切断每个气管与体壁的连接。这可以保持周围神经系统（PNS）与中枢神经系统（CNS）之间的节段神经完整。将仍固定在细胞防护板上的幼虫置于含4%多聚甲醛的PBS溶液中，在室温下轻轻摇动固定20分钟，每次解剖操作应在五分钟内完成。否则，树突授权神经元的神经末梢将开始退化。固定后，去除多余的幼虫组织，然后用PBST清洗肌片三次，每次10分钟。洗涤后，在室温下用封闭液轻柔振荡孵育幼虫20分钟。封闭完成后，弃去封闭液，加入一抗溶液。将样品置于被湿润纸巾包围的小型塑料容器中，于4°C过夜孵育。次日，在室温下继续孵育额外1小时。然后用PBST对组织样本清洗六次，每次清洗10分钟。加入二抗后，将样本置于避光容器中，以防止荧光染料发生光漂白。将样本在室温下孵育数小时，或在4°C下孵育过夜，随后在室温下继续孵育1小时。最后用PBST清洗6次，每次10分钟。组织即可进行封片。为观察轴突末端，只需将幼虫肌膜切片以表皮面朝下置于凹玻片中的80%甘油中封片即可。为了获得更清晰的树突图像，使用PLL包被的盖玻片制作永久装片。对盖玻片进行编码后，取适量PLL，加入双蒸水至总体积10毫升，并添加20微升Kodak Photo-Flo。将盖玻片浸入PLL溶液中30分钟，取出后自然晾干。随后用清水短暂冲洗，并再次晾干。重复此过程两次。从PLL溶液开始，处理后的盖玻片可保存约一个月。现在将解剖好的幼虫肌片组织切面朝下置于PLL盖玻片上的PBS液滴中。使用一张滤纸可使肌片迅速粘附到盖玻片上。尽可能去除多余的液体，但切勿使其完全干燥。接下来对幼虫肌片进行脱水处理，依次用35%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇、100%乙醇各浸泡10分钟，最后再用100%乙醇浸泡一次，每次10分钟。用二甲苯浸泡2到3次，每次10分钟。然后在干净的载玻片上滴一滴DPX，小心地将盖玻片盖在DPX上，使盖玻片朝下完全覆盖。将载玻片置于避光处，静置一天使DPX固化。在使用活体成像和聚焦显微镜观察组织之前，可以采集此类图像。图中显示的是四型树突分支神经元的完整树突形态。此图为经免疫组织化学标记的三型神经元树突分支的放大图像，该样本已正确固定，以保持其形态结构。插图显示了在解剖和固定不成功后可能发生的降解现象。该叠加图像显示了中枢神经系统（CNS）中单个IV类轴突末端。轴突以绿色的抗GFP标记，所有IV类轴突末端共染色了紫红色的抗CD2。进行该操作时，重要的是要记住，应通过从外周向中枢神经系统追踪轴突，快速解剖并固定样品。需要注意的是，每个体节中的外周神经系统神经元会投射至腹神经索的相应体节区域。此外，如果仅希望观察树突结构，可在解剖过程中去除中枢神经节（CNAs），染色步骤也可在离心管中进行，而无需使用培养板。在为树突成像制备这些组织切片时，首先用口钩切除头部，用闪光物切除后端。以获得满意的制备效果。

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形态分析果蝇幼虫外周感觉神经元树突和轴突使用遗传马赛克

我们描述了制备不同发育阶段的 黑腹果蝇...

整体胚胎神经系统的可视化 果蝇 胚胎

来源：Ting, C., 等, 分析柱状与层状结构中的树突形态学。J. Vis. Exp. (2017)本视频演示了制备 果蝇...

分析跨越 Drosophila 腹髓各层与各列的树突形态

我们介绍一种用于标记黑腹果蝇（Drosophila）胚胎中枢神经系统（CNS）中单个神经元的技术，该技术可通过透射光显微镜或共聚焦显微镜对神经元形态进行分析。...

果蝇（Drosophila melanogaster）中枢神经系统中单个细胞的标记

使用神经元形态发生研究 黑腹果蝇 幼虫树突状分支（da）神经元获益于 原位...

去除 果蝇 用于感觉神经元和表皮细胞免疫荧光分析的幼虫肌组织切片

两种图像分析算法，果蝇 神经肌肉接头形态计量学”和“果蝇 神经肌肉接头突触小结形态计量 已创建，以自动量化九种形态学特征 果蝇 神经肌肉接头（NMJ）...

高通量多参数定量分析的两种算法 果蝇 神经肌肉接头形态学

本研究详细介绍了一种标准的免疫组织化学方法，用于观察晚期16阶段黑腹果蝇（Drosophila...

在 Drosophila 胚胎运动神经元轴突投射模式的可视化

本方案描述了成年个体的解剖与免疫染色方法 黑腹果蝇 脑组织。具体而言，本方案重点介绍了使用 果蝇...

成年黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）大脑中蘑菇体与光感受器神经元的解剖及免疫荧光染色

本方案重点介绍果蝇（Drosophila）神经元树突分支复杂性（NDAC）的定量分析，可用于树突形态发生相关研究。...

神经元树突分支复杂性的定量分析 果蝇

本文介绍一种通过固定、封片、成像及成像后处理等步骤，在成年黑腹果蝇（Drosophila）腿部中利用荧光蛋白可视化轴突投射的实验方案。...

可视化 果蝇 成年果蝇角质层中的腿部运动神经元轴突

我们描述了一种逆行示踪的方法 果蝇...

逆行示踪 果蝇 使用亲脂性荧光染料标记胚胎运动神经元

本文提供了在黑腹果蝇（Drosophila...

在Drosophila melanogaster轴突死亡过程中对轴突及其突触的形态学与功能评估

了解利用遗传马赛克和GFP标记克隆技术对果蝇幼虫外周感觉神经元树突与轴突进行形态分析的方法。该方案通过热激诱导、激光共聚焦免疫荧光显微成像，为神经发育研究提供可靠的实验指南。

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