形态学分析 果蝇 利用遗传镶嵌体研究幼虫外周感觉神经元的树突和轴突

本实验的总体目标是观察果蝇幼虫树突状分支神经元的精细形态。首先通过收集胚胎并培养至相应发育阶段，利用热激诱导脂酶表达，产生GFP标记的遗传克隆，从而实现这一目标。第二步是筛选出具有荧光神经元克隆的幼虫，并对其树突ABAs进行成像。

成像后，将幼虫解剖、固定并进行免疫染色，以便将其封片，并通过共聚焦免疫荧光显微镜观察其树突分支和轴突末端的形态。今天我将演示一种利用遗传镶嵌技术对梭状下部外周感觉神经元及其轴突进行形态学分析的实验方案。该方法有助于回答神经发育领域中的一些关键问题，例如：调控神经元身份、树突形态以及外部连接方式的遗传程序是什么？

首先在苹果汁培养基平板上收集胚胎。热激处理在38摄氏度的水浴中进行，持续时间根据胚胎的遗传背景和期望的克隆大小而定。本实验方案中，使用带有 pan 型树突状分支神经元驱动子的胚胎来产生 markum 克隆。热激前，将标记胚胎置于25摄氏度环境中，并用湿润的组织包裹，保持两小时。

通过使用空板和封口膜将收集板处理为可浸入式，以准备用于热激的培养板。然后对标记胚胎进行一小时的热激处理，以产生少量克隆或单个神经元标记。为增加克隆数量，可采用延长的热激程序：先在水浴中孵育45分钟，随后在室温下放置30分钟，再放入水浴中继续孵育30分钟。

为了产生flipout克隆，需连续收集24小时的胚胎。本方案使用一种特异于class four的驱动子。在热激后，对flipout胚胎进行一小时的热激处理。

将收集板放入直径10厘米的培养皿中，周围放置湿润的组织并进行培养。胚胎培养过程中需在25摄氏度条件下监测，并根据需要补充酵母糊。因为营养对神经元发育具有关键影响。

继续培养至可收集游走期三龄幼虫，小心轻柔地用自来水冲洗三龄幼虫，然后转移至琼脂平板上。现在使用高倍荧光解剖显微镜和昆虫镊子观察幼虫。鉴定体壁中具有GFP阳性神经元的幼虫，并将其转移至含有1滴80%甘油的凹面载玻片中。

将盖玻片置于载玻片上以固定幼虫，确保幼虫与盖玻片之间无气泡残留。采用标准共聚焦显微镜透过幼虫角质层观察目标神经元。

为了调整熔岩的位置以获得更佳的观察角度，可轻轻推动盖玻片使熔岩滚动。本方案首先使用昆虫镊子将熔岩转移至SIL防护板上，然后在其前端和后端将其固定。

然后加入无钙 HL 3.1 缓冲液。现在沿背腹轴垂直方向，将气管两端各切开一半。接着沿两条气管之间的中线切开。

在轻轻移除肠道之前，仔细切断每个气管与体壁的连接。这可以保持周围神经系统（PNS）与中枢神经系统（CNS）之间的节段神经完整。将仍固定在细胞防护板上的幼虫置于含4%多聚甲醛的PBS溶液中，在室温下轻轻摇动固定20分钟，每次解剖操作应在五分钟内完成。

否则，树突授权神经元的神经末梢将开始退化。固定后，去除多余的幼虫组织，然后用PBST清洗肌片三次，每次10分钟。

洗涤后，在室温下用封闭液轻柔振荡孵育幼虫20分钟。封闭完成后，弃去封闭液，加入一抗溶液。将样品置于被湿润纸巾包围的小型塑料容器中，于4°C过夜孵育。次日，在室温下继续孵育额外1小时。

然后用PBST对组织样本清洗六次，每次清洗10分钟。加入二抗后，将样本置于避光容器中，以防止荧光染料发生光漂白。将样本在室温下孵育数小时，或在4°C下孵育过夜，随后在室温下继续孵育1小时。

最后用PBST清洗6次，每次10分钟。组织即可进行封片。为观察轴突末端，只需将幼虫肌膜切片以表皮面朝下置于凹玻片中的80%甘油中封片即可。

为了获得更清晰的树突图像，使用PLL包被的盖玻片制作永久装片。对盖玻片进行编码后，取适量PLL，加入双蒸水至总体积10毫升，并添加20微升Kodak Photo-Flo。

将盖玻片浸入PLL溶液中30分钟，取出后自然晾干。随后用清水短暂冲洗，并再次晾干。

重复此过程两次。从PLL溶液开始，处理后的盖玻片可保存约一个月。现在将解剖好的幼虫肌片组织切面朝下置于PLL盖玻片上的PBS液滴中。

使用一张滤纸可使肌片迅速粘附到盖玻片上。尽可能去除多余的液体，但切勿使其完全干燥。接下来对幼虫肌片进行脱水处理，依次用35%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇、100%乙醇各浸泡10分钟，最后再用100%乙醇浸泡一次，每次10分钟。

用二甲苯浸泡2到3次，每次10分钟。然后在干净的载玻片上滴一滴DPX，小心地将盖玻片盖在DPX上，使盖玻片朝下完全覆盖。将载玻片置于避光处，静置一天使DPX固化。

在使用活体成像和聚焦显微镜观察组织之前，可以采集此类图像。图中显示的是四型树突分支神经元的完整树突形态。此图为经免疫组织化学标记的三型神经元树突分支的放大图像，该样本已正确固定，以保持其形态结构。

插图显示了在解剖和固定不成功后可能发生的降解现象。该叠加图像显示了中枢神经系统（CNS）中单个IV类轴突末端。轴突以绿色的抗GFP标记，所有IV类轴突末端共染色了紫红色的抗CD2。

进行该操作时，重要的是要记住，应通过从外周向中枢神经系统追踪轴突，快速解剖并固定样品。需要注意的是，每个体节中的外周神经系统神经元会投射至腹神经索的相应体节区域。此外，如果仅希望观察树突结构，可在解剖过程中去除中枢神经节（CNAs），染色步骤也可在离心管中进行，而无需使用培养板。

在为树突成像制备这些组织切片时，首先用口钩切除头部，用闪光物切除后端。以获得满意的制备效果。