神经元树突分支复杂性的定量分析 果蝇

本实验的总体目标是观察 SOX5 基因在黑腹果蝇神经元发育过程中对树突分支神经元复杂性的影响。该方法有助于研究神经树突的形态发生以及基因在神经系统发育中的功能，从而更好地理解神经退行性疾病相关基因的作用。最终，该技术可实现对树突复杂性的定量分析，适用于多种不同类型的神经树突研究。

该技术的意义在于揭示神经退行性疾病的遗传机制，因为突变是理解基因功能的关键。将UAS-GFP;ppk-GAL4果蝇与UAS-Sox102F-RNAi品系果蝇或W118对照果蝇进行杂交配对。在25摄氏度的标准条件下培养果蝇。

大约五到六天后，使用镊子小心地收集三龄幼虫用于解剖。将一只幼虫置于由硅弹性体基质制成的解剖皿中，并放入组织培养用培养皿内，然后将培养皿置于解剖显微镜下。

现在将幼虫尾部固定，以暴露中线。然后固定幼虫的口钩，使幼虫背侧朝上。接着向培养皿中加入 200 µL PBS，使幼虫完全浸入溶液中。

接下来，用小切口剪去幼虫的尾部和口器。然后从尾端向头端沿背侧中线以及两条气管之间将幼虫体壁剪开。随后在身体的四个角各固定一枚图钉，使身体平展。

现在将幼虫体壁在4% PFA中室温固定25分钟。然后用PBS洗涤幼虫，每次5分钟，共洗涤三次。洗涤后，移除大头针并将组织转移至载玻片上。

然后将组织浸入抗荧光淬灭封片剂中，用盖玻片封片。封片后让组织在室温下静置干燥一小时，再用指甲油封闭盖玻片边缘。将这些载玻片置于黑暗环境中，于4°C保存。

使用共聚焦显微镜和20倍物镜采集z系列图像。首先，设置z轴步进范围以包含幼虫体壁中的所有DA神经元，并将步长设为0.5 µm。然后将图像存储为TIF或ND2文件以供后续处理。

接下来，评估多巴胺能神经元上树突的数量和形态。首先从测量其长度开始。第一步，在 Fiji ImageJ 中，如有需要，将图像拆分为独立的通道。

只需评估 GFP 通道。接下来，进行 z 投影。在新窗口中，选择“最大强度”作为投影类型，并选择起始和终止层面。

然后单击“确定”生成具有清晰树突突起的Z轴投影图像。现在使用插件工具追踪神经突。首先，移动到目标神经元的胞体处，点击树突从细胞体延伸出的位置。

然后点击该树突的末端。如果连接两点的蓝色线条与神经突的长度一致，请按 Y 键表示“是”。如果此线条与神经突的完整路径吻合，请点击“完整路径”。

如果直线无法贴合路径，则单击该神经突上更远的点，将路径弯曲成多个线段，以匹配神经突的长度。然后，单击完成路径，并继续为下一个神经突标记路径。完成所有轨迹路径后，选择“分析”菜单中的“测量路径”选项，将路径导出为 CSV 文件。

使用此数据计算并得出用于分析的平均路径长度。接下来，计算神经元的表面积。首先，从 Fiji ImageJ 窗口中选择自由手绘工具。

然后，连接目标神经元的端点。接着，从“分析”窗口中选择“测量”选项。结果将显示在一个新窗口中，包含所选区域的数值。

将该数值复制到数据分析软件中。最后，使用Analyze Skeletonized Paths插件计算分支总数。通过在DA神经元的胞体和树突分支中共同过表达GFP，以进行GFP荧光成像分析来标记其树突。

使用倒置共聚焦显微镜对树突的形态进行成像。按照所述方法追踪多巴胺能神经元的树突，并利用该文件估算树突长度。

在三龄幼虫的多巴胺能神经元中沉默 Sox102F 导致树突总数显著减少，分支长度约为正常的一半，结构更简单，分支数量仅为正常的一半。逻辑上，这导致了树突分支表面积的减少。本方案提供了一种快速评估多巴胺能感觉神经元发育的方法。

进行该操作时，务必对每组多巴胺能神经元拍摄足够数量的图像，以获得良好的覆盖范围。完成该操作后，可进一步开展树突分析等其他方法，以回答有关树突发育的更多科学问题。由于涉及发育过程，该技术已帮助神经科学领域的研究人员利用模式系统对阿尔茨海默病等神经退行性疾病做出推论。