无血清胚胎体的建立与维持

从含有神经前体细胞或NPC聚集体的培养孔开始，使用分化培养基-1（DM-1）。

这些NPC是在受控条件下，使用DM-1由人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化而来的神经谱系前体细胞。

将神经前体细胞聚集体转移至置于含有DM-1培养基的孔中膜插件上，并去除多余培养基。

更换为 DM-2 培养基并进行孵育。

DM-2 提供营养物质和分化因子，促进神经前体细胞向不同神经细胞类型的成熟。

未分化的NPCs在缺乏血清的培养基中会转化为类胚体，称为无血清类胚体（SFEBs）。这些类胚体在形态上类似于发育中的大脑。

将插入片段转移至含有 DM-3 的孔中。

DM-3 含有维持和生长 SFEB 所必需的生长因子。

孵育至 SFEBs 达到所需大小。

培养细胞两周后，准备六孔板，每孔中放入40微米的细胞培养小室，并加入1毫升DM1培养基。在接种培养细胞前，将六孔板孵育至少4小时。

接下来，使用200微升宽口移液枪头，收集约含20微升培养基的两周龄细胞聚集体。将4至6个聚集体转移至每个插入式培养小室中，尽量减少溶液量，并去除任何多余液体。

在此步骤中，需快速且平稳地操作。在移除 SFEB 周围培养基时，由于表面张力的作用，您可能会观察到 SFEB 在溶液中移动。待培养基移除后，可重新调整其位置。

将所有细胞团块接种至插入式培养皿后，更换为 1 毫升 DM2 培养基，继续培养细胞。每隔一天更换四分之三的培养基，补充新鲜培养基。培养 14 天后，开始向培养物中添加 DM3 培养基。继续培养 16 天，以促进 SFEBs 的生长。