使用双光子荧光寿命成像显微镜观察小鼠体内的蛋白激酶 A 活性

麻醉的小鼠在其运动皮层上有一个颅窗固定到跑步机上。

小鼠在皮质神经元中表达蛋白激酶-A报告基因。

跑步机放置在双光子 FLIM 物镜下方。

物镜和颅窗之间添加一个水滴。

让鼠标醒来并适应跑步机。

使用明场照明，定位成像区域。关闭显微镜外壳以阻挡外部光线。

设置成像参数，启动跑步机旋转以诱导运动，然后开始成像。

强制运动激活PKA，PKA磷酸化报告基因，使其供体和受体荧光团更近。

显微镜引导红外激光，激发供体将能量传递给受体，从而缩短供体的荧光寿命。

当运动停止时，PKA 和报告基因返回其非活性状态，从而减少能量转移并延长供体的荧光寿命。

分析图像以比较休息和运动期间的皮质 PKA 水平。

窗安装后至少两周，将双光子激发激光波长设置为960纳米，并确认麻醉实验小鼠对脚趾捏缺乏反应。将麻醉的小鼠放在电动跑步机上，并将鼠标的头板安装到跑步机装置的头板支架上。用70%乙醇清洁颅窗盖玻片的表面，并将电动跑步机放在2pFLIM物镜下方。

物镜的颅窗盖玻片之间滴一滴蒸馏水，让小鼠醒来并适应跑步机和显微镜环境至少10分钟。导航到落射照明下的注射位置，并在明场下记录基准特征，以帮助在后续成像会话中对同一感兴趣区域进行成像。

关闭落射光源。封闭 2pFLIM 显微镜装置的外壳。要激活 2pFLIM 显微镜光电倍增管，请打开硬件命令电压控制。要获取 Z 堆栈 2pFLIM 图像，请将图像大小设置为 128 x 128 像素。扫描速度为每行 2 毫秒，视场角可达 90 至 100 微米，平均为三帧。

准备和硬件配置调整成像设置。并在 FLIM 视图中检查采集的图像。使用减小的视场、降低的扫描速度、增加的激光功率和增加要平均的帧数来增加积分光子数并根据需要减少寿命估计误差。

确保每个感兴趣区域获得足够的光子。对于视野中的正体细胞，可行的综合照片计数约为 1,000 到 10,000 个光子。

图像后，在跑步机上以 0 速度定期获取基线重复 Z 堆栈图像至少 15 分钟。然后将跑步机旋转设置为每秒约厘米，持续 15 分钟，同时获取 2pFLIM 图像，然后在关闭跑步机旋转后进行至少 20 分钟的图像采集，以评估蛋白激酶 A 活性的持续时间停止强制运动。

对于 2pFLIM 图像分析，请在胶片视图中打开图像，然后单击单光子计数最小和最大范围字段以输入适当的最小和最大单光子计数范围值。单击时间 0 值字段输入时间 0 值，然后单击寿命亮度最小阈值字段以输入所需的阈值，介于 5 到 30 个光子之间。

单击"新建组"按钮并分配一个实验组名称，以生成一个组，该组将每个添加的 FLIM 图像中的数据组合在一起。单击感兴趣区域控制模块中的感兴趣区域，并在 T-ACCR α 阳性体细胞周围绘制感兴趣区域。移动 Z 堆栈控制滑块中的 Z 轴下限和上限以减小 Z 堆栈范围并最大程度地减少源自背景光子和其他 Z 倾角的信号污染，然后单击加号将 FLIM 图像添加到组中。

单击 calc 以计算感兴趣区域的寿命估计误差中的平均寿命，然后打开 2pFLIM 成像系列中的下一个文件。随着时间的推移测量每个连续图像中相同的 T-ACCR α 阳性体细胞，根据需要调整体细胞周围的感兴趣区域。分析完所有图像后，在组控制模块中选择增量平均光子发射时间增量平均光电子发射T0，然后单击基线数字字段输入感兴趣图像的索引，以定义用于计算基线寿命的图像。

然后，单击绘图以生成一个图表，其中包含实验期间在定义的感兴趣区域中对 T-ACCR α 阳性活性的 FLIM 响应，以便比较激酶在不同感兴趣区域运动期间的蛋白激酶 A 活性。