通过荧光示踪鉴定小鼠视网膜神经节细胞亚型

0 次观看3:20 分钟 • May 29th, 2025

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将从转基因小鼠中分离的视网膜组织置于记录室中,该小鼠的视网膜神经节细胞(RGCs)带有荧光标记。

视觉信息被传递给视网膜神经节细胞(RGCs),其轴突通过视神经将信息传送到大脑。

视网膜神经节细胞(RGC)亚型通过其树突的分支模式加以区分,这些树突分层分布于视网膜内层的亚层中。

展平视网膜组织,并使用组织固定锚将其固定。

将灌流室转移至显微镜载物台上,并灌注含氧溶液以维持视网膜神经节细胞(RGC)的活性。

使用红外照明识别荧光标记的视网膜神经节细胞(RGCs)。

将含有荧光示踪剂的移液器置于RGC上。

施加正压以防止堵塞。

切换至负压,将膜吸入移液管内以形成封接。

施加负压以破裂膜,形成全细胞构型,从而促进示踪剂向树突扩散。

观察树突形态及其分层以鉴定视网膜神经节细胞亚型。

用充氧的细胞外溶液冲洗视网膜,然后用塑料移液管将其转移至玻璃底记录室中。随后,用镊子小心展平组织,使感光细胞层朝下。用移液管吸除多余液体,并用带尼龙网的铂金丝环固定组织。接着,向记录室中加入充氧的细胞外溶液,并将其安装到显微镜载物台上。以每分钟2至4毫升的速度持续灌流充氧的细胞外溶液。

为准备该实验步骤,使用微电极拉制仪拉制若干玻璃微量移液管,用于电生理记录。使用红外微分干涉差(IR-DIC)光学系统观察神经节细胞层。随后在约480纳米波长的落射荧光下识别表达GFP的神经节细胞。接着在DIC下定位充满细胞内液的移液管。施加轻微正压,并在放大器上校正任何电压偏移。

随后,将玻璃微电极移至GFP阳性细胞上,并施加测试电压指令阶跃,以监测封接电阻。应通过负压在电极与细胞膜之间形成吉欧姆(Giga ohm)级封接。形成稳定封接后,施加短暂的负压脉冲以击破膜,从而获得全细胞记录模式。等待一到两分钟,使细胞的树突充分填充荧光示踪剂。

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最后更新:15 八月 2026