表达和疫苗病毒样颗粒的纯化

这里，我们提出用于合成使用任一杆状病毒或哺乳动物表达系统，并超速离心纯化病毒样颗粒的协议。这种高度可定制的方式被用来识别在一个安全的，灵活的方式的病毒抗原作为疫苗的目标。

该程序的总体目标是纯化由哺乳动物或昆虫细胞表达系统表达和分泌的病毒样颗粒或 VLP。这种方法可以回答疫苗领域中的关键问题，例如如何以安全灵活的方式表达和纯化构象相关的病毒抗原。该技术的主要优点是它不需要使用聚乙二醇进行蛋白质沉淀或制备多个密度层来浓缩 VLP。

虽然这种方法可以深入了解将病毒抗原鉴定为疫苗靶标，但 VLP 也可以用作疾病诊断和血清学的工具。这种方法的视觉演示至关重要，因为 VLP 重悬步骤中的甘油衬垫很难学习，因为初学者可能无法练习正确的技术。在横剖当天，根据制造商的建议准备脂质体和 DNA 溶液。

用 DNA 组成为 1 到 1 到 2 的 HA 到 NA 到 Gag 和 DNA 总量为每个 T150 烧瓶 40 微克的 DNA 细胞进行横切。重复此步骤以创建 9 个 T150 培养瓶，总体积为 200 毫升。接下来，在不含抗生素的无血清横流培养基中稀释 DNA 和脂质体溶液，使每个培养瓶的总体积为 24 mL。

将培养瓶放回培养箱中，保持细胞和横流培养基，直到收获病毒样颗粒 （VLP） 的那一天。将上清液转移到 50 毫升锥形管中，以便在横流后 72 至 96 小时后从细胞中收获培养物。将细胞向下旋转以沉淀细胞碎片。

收集上清液并通过 0.22 微米倾倒膜过滤。通过在多点搅拌板系统上以 130 rpm 的转速连续搅拌，在旋转瓶中悬浮培养先前制备的草地贪夜蛾或 Sf9 细胞。将培养体积保持在不超过旋转瓶体积的一半，以实现适当的通气。

接下来，用先前制备的重组杆状病毒以 2 倍 10 的密度感染旋转瓶中的 250 毫升 Sf9 细胞，将 6 个细胞/毫升的细胞感染来表达 CHIK VLP，并将细胞放回 28 摄氏度的培养箱中。使用台盼蓝排除法确定细胞活力是否已降至 70% 至 80%确认后，将培养物直接从悬浮液转移到 50 mL 锥形管中，并将细胞离心。收集上清液，并在沉淀前通过 0.22 微米的倾倒膜过滤。

用 70% 乙醇对 6 个 25 毫米 x 89 毫米的开口超速离心管进行消毒。然后，确保乙醇已完全干燥。将 32 毫升上清液加载到干净的试管中。

接下来，用 3 毫升无菌 20% 甘油和 PBS 小心地将上清液覆盖。缓慢地将甘油铺在下面，以避免破坏甘油和 VLP 溶液之间的薄密度层。甘油分配过快会导致甘油和 VLP 溶液混合，从而减少 VLP 沉降。

确保管子平衡，然后开始旋转。4 小时后，从离心机中取出试管。吸出上清液，注意不要将沉淀从试管中脱落。

通过轻轻缓慢地上下移液，用无菌 PBS 将沉淀的 VLP 重悬于管底部至少 100 微升中。VLP 沉淀的重悬应通过轻柔、缓慢的重复吸液和用移液管排出 PBS 进行。避免产生气泡以限制 VLP 损失。

最后，储存重悬的 VLP。从各种 SVP 和 VLP 构建体中获得来自常规 BCA 测定的 VLP 体积和总蛋白产量。Sf9 细胞的 CHIK SVP 产量范围为每毫升上清液体积 0.008 至 0.016 毫克总蛋白。

而通过哺乳动物 293 T 细胞产生，蛋白质减少 10 倍。该电子显微镜图像显示 HA Gag 核心流感 VLP 成功表达、组装和纯化为 VLP。好吧，尝试此程序时，重要的是要记住仅对健康和活的细胞培养物进行 transvect 和感染，因为这会影响整体蛋白质表达水平。

按照此程序，可以进行其他方法，如 BCA、ELIZA 和 HA 测定，以测量总蛋白含量、特异性抗原含量和功能性 HA 的表达。不要忘记，使用超速离心机可能很危险，在执行此程序时应始终采取预防措施，例如平衡试管、仅使用推荐的转子和速度以及适当监督新的实验室人员。