Name: 表达和疫苗病毒样颗粒的纯化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: 了解病毒样颗粒纯化方法，用于疫苗开发中的病毒抗原鉴定。该技术利用哺乳动物或昆虫细胞系统表达VLPs，通过超速离心简化纯化流程，无需复杂密度层或蛋白沉淀步骤，为疫苗靶点识别提供安全灵活的解决方案。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们谨向Ross实验室的前任成员致以谢意，他们为优化本实验方案以实现最高效率和产量做出了贡献。

1. 用于产生流感H3N2病毒样颗粒的哺乳动物表达系统
<ol>
	<li>将病毒结构糖蛋白血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）以及人类免疫缺陷病毒（HIV）Gag p55 亚克隆至真核表达载体中，例如先前描述的 pTR6007。</li>
	<li>在化学感受态大肠杆菌（例如，DH5α）中扩增 DNA，并按照制造商说明使用质粒纯化试剂盒分离转染级质粒。DNA 用量取决于产量及使用者需求。</li>
	<li>在含 10% 胎牛血清（FBS）的培养基中，于 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中培养哺乳动物细胞系 293T。</li>
	<li>培养细胞，使每个 T-150 组织培养瓶含有 45–75 × 106 个细胞，确保次日细胞完全贴壁且融合度达到 85–95%。在显微镜下检查细胞以确认所需融合度。 
	注意：通常建议采用高细胞密度，以在使用商业转染试剂时获得最佳蛋白表达并尽量减少细胞毒性；但过度融合可能导致细胞代谢废物积累，降低细胞活力。</li>
	<li>转染当天，按照制造商推荐方法制备脂质体与 DNA 混合物，并以 HA:NA:Gag 为 1:1:2 的比例进行转染，每 T-150 培养瓶总 DNA 用量为 40 µg。将 DNA 和脂质体溶液用无血清、不含抗生素的转染培养基稀释，使每瓶总体积为 20–30 ml。 
	注意：基因构建体的比例可能需要使用者优化。尽管本文未展示，但类似转染程序曾以 1:1 比例用于呼吸道合胞病毒（RSV）F 蛋白与 HIV Gag。对于登革病毒（DENV）和基孔肯雅病毒（CHIKV）的单表达质粒，每 T-150 培养瓶使用 20 µg 总 DNA 可实现最佳表达。DNA 与转染试剂的比例由使用者优化。应根据转染方法选择推荐的转染培养基；例如，多阳离子脂质转染建议减少或去除胎牛血清，因此可在无血清条件下添加生长激素和微量元素以支持细胞生长。</li>
	<li>将培养瓶放回 37 °C、5% CO2 的培养箱中。对于 200 ml 总体积，使用 9 个 T-150 培养瓶。细胞在转染培养基中继续培养，直至病毒样颗粒（VLP）收获日。</li>
	<li>转染后 72–96 小时，根据抗原类型或当细胞活力降至 70–80%（通过显微镜观察估算）时，收集细胞培养上清液。将上清液转移至 50 ml 圆锥管中，在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟，沉淀细胞碎片。 
	注意：将 3 天后的上清液更换为新鲜预温的无血清转染培养基，继续培养贴壁细胞，可获得第二批病毒样颗粒，其产量相似或略有降低，具体应由使用者优化。</li>
	<li>合并上清液，并通过 0.22 µm 孔径滤膜过滤，随后进行超速离心沉淀。</li>
	<li>采用标准血凝试验14检测表达 HA 的病毒样颗粒的血凝活性，使用 0.8% 火鸡或哺乳动物红细胞，或进行抗原特异性 ELISA 检测。代表性结果见图 2。</li>
</ol>
2. 利用杆状病毒/昆虫细胞系统表达CHIK VLP
<ol>
	<li>使用商业化的杆状病毒表达系统，从S-27毒株构建表达基孔肯雅病毒衣壳蛋白和包膜蛋白（C-E3-E2-6K-E1）的重组杆状病毒。</li>
	<li>在无血清Sf9培养基中培养Spodoptera frugiperda Sf9细胞，添加100 U/ml青霉素和100 µg/ml链霉素，于28 °C培养。以3-5 × 105 个细胞/ml的密度接种多联搅拌瓶，用于悬浮细胞培养。当细胞密度达到2-4 × 106 个细胞/ml时（每3-4天）常规传代。</li>
	<li>将Sf9细胞在搅拌式多联搅拌瓶系统中以130 rpm持续搅拌进行悬浮培养。为保证充分通气，培养液体积不应超过搅拌瓶容量的一半。</li>
	<li>为表达CHIK VLPs，以感染复数（MOI）为1的重组杆状病毒感染密度为2 × 106 个细胞/ml的Sf9细胞，并放回28 °C培养箱继续培养。通常感染一个或两个含250 ml Sf9细胞的搅拌瓶。 
	注意：尽管我们未采用该方法，Sf9细胞也可在28 °C下使用摇床平台于摇瓶中培养。</li>
	<li>在感染后72–96小时，或根据台盼蓝染色排除法按照制造商说明书测定细胞活力降至70–80%时收获培养物。 
	注意：感染期间细胞仍持续增殖，在感染重组基孔肯雅病毒样颗粒（CHIK VLP）杆状病毒3天后（dpi），Sf9细胞的活力约为80%。杆状病毒感染的细胞体积增大，形态可能由圆形变为椭圆形。在杆状病毒感染晚期，细胞开始裂解。</li>
	<li>将培养物直接从悬浮液转移至50 ml锥形管中，在4 °C下以500 × g离心5分钟，沉淀细胞。</li>
	<li>收集上清液，并通过0.22 µm孔径滤膜过滤，随后进行超速离心沉淀。</li>
</ol>
3. VLP/SVP 的沉淀/纯化
<ol>
	<li>在生物安全柜中使用70%乙醇对25 mm × 89 mm开口超速离心管进行灭菌。使用前确保乙醇已完全挥发干燥。</li>
	<li>将最多32 ml上清液加入洁净离心管中。建议最小体积为25 ml，以防止填充不足的超速离心管在离心过程中塌陷或损坏。</li>
	<li>用无菌PBS中20%甘油（v/v）小心地在上清液下方铺加3 ml。确保离心管已配平。</li>
	<li>在4 °C条件下以135,000 × g离心4小时。</li>
	<li>吸除上清液，注意避免扰动管底沉淀物。</li>
	<li>用无菌PBS通过反复吹打，重悬管底的病毒样颗粒（VLP）。重悬VLP所需的PBS体积取决于VLP的总蛋白产量及后续应用。通常情况下，每份VLP沉淀至少用100 µl PBS重悬。</li>
	<li>样本短期保存可存放于4 °C，长期保存应置于-80 °C。</li>
</ol>
4. 确定蛋白质产量和特异性抗原产量
<ol>
	<li>使用商业化的蛋白质定量方法（如BCA法）并按照制造商的说明书测定总蛋白含量。</li>
	<li>为评估特定抗原含量，可通过将标准抗原的系列稀释液以及2–5 µg总蛋白样品包被到ELISA 96孔平底板上，进行直接酶联免疫吸附试验（ELISA）。
	<ol>
		<li>随后使用抗原特异性抗体探测板上抗原的存在，并采用常规ELISA显色底物，使微孔板读数仪可检测到吸光度。有关表达血凝素（HA）的病毒样颗粒（VLP）样品的HA和ELISA检测代表性结果，请参见图2；可存在多种HA与神经氨酸酶（NA）的组合，但产量可能因HA与NA之间的相容性而异15。 
		注意：抗原特异性抗体的亲和力存在差异，建议在进行VLP定量前先确定抗体的终点稀释滴度。商业抗体产品通常会提供适用于ELISA的推荐浓度或稀释范围，以及建议的操作流程。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Zeltins, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+virus-like+particles%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of virus-like particles: a review.</a> Mol Biotechnol. 53, 92-107 (2013).</li>
<li>Jain, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formulation+and+stabilization+of+recombinant+protein+based+virus-like+particle+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Formulation and stabilization of recombinant protein based virus-like particle vaccines.</a> Adv Drug Deliv Rev. , (2014).</li>
<li>Mair, C. M., Ludwig, K., Herrmann, A., Sieben, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+binding+and+pH+stability+-+how+influenza+A+virus+hemagglutinin+affects+host-specific+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Receptor binding and pH stability - how influenza A virus hemagglutinin affects host-specific virus infection.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1838, 1153-1168 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engerix-B+package+insert%5BTitle%5D)+AND+%22GlaxoSmithKline%2C+Research+Triangle+Park%2C+NC%22%5BJournal%5D)">Engerix-B package insert.</a> GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC. , (2013).</li>
<li>Giles, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computationally+optimized+hemagglutinin+virus-like+particle+vaccine+elicits+broadly+reactive+antibodies+that+protect+nonhuman+primates+from+H5N1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">A computationally optimized hemagglutinin virus-like particle vaccine elicits broadly reactive antibodies that protect nonhuman primates from H5N1 infection.</a> J Infect Dis. 205, 1562-1570 (2012).</li>
<li>Giles, B. M., Ross, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computationally+optimized+broadly+reactive+antigen+%28COBRA%29+based+H5N1+VLP+vaccine+elicits+broadly+reactive+antibodies+in+mice+and+ferrets%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">A computationally optimized broadly reactive antigen (COBRA) based H5N1 VLP vaccine elicits broadly reactive antibodies in mice and ferrets.</a> Vaccine. 29, 3043-3054 (2011).</li>
<li>Green, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C3d+enhancement+of+neutralizing+antibodies+to+measles+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">C3d enhancement of neutralizing antibodies to measles hemagglutinin.</a> Vaccine. 20, 242-248 (2001).</li>
<li>Bright, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-Clade+Protective+Immune+Responses+to+Influenza+Viruses+with+H5N1+HA+and+NA+Elicited+by+an+Influenza+Virus-Like+Particle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cross-Clade Protective Immune Responses to Influenza Viruses with H5N1 HA and NA Elicited by an Influenza Virus-Like Particle.</a> PLoS ONE. 3, e1501(2008).</li>
<li>Yondola, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Budding+Capability+of+the+Influenza+Virus+Neuraminidase+Can+Be+Modulated+by+Tetherin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Budding Capability of the Influenza Virus Neuraminidase Can Be Modulated by Tetherin.</a> J Virol. 85, 2480-2491 (2011).</li>
<li>Schneider-Ohrum, K., Ross, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-like+particles+for+antigen+delivery+at+mucosal+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Virus-like particles for antigen delivery at mucosal surfaces.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 354, 53-73 (2012).</li>
<li>Murawski, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus-like+particles+containing+respiratory+syncytial+virus+G+protein+induced+protection+in+BALB%2Fc+mice%2C+with+no+evidence+of+immunopathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus-like particles containing respiratory syncytial virus G protein induced protection in BALB/c mice, with no evidence of immunopathology.</a> J Virol. 84, 1110-1123 (2010).</li>
<li>Quan, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viruslike+particle+vaccine+induces+protection+against+respiratory+syncytial+virus+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Viruslike particle vaccine induces protection against respiratory syncytial virus infection in mice.</a> J Infect Dis. 204, 987-995 (2011).</li>
<li>Ross, T. M., Tang, X., Lu, H. R., Olagnier, D., Kirchenbaum, G. A., Evans, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COBRA-Based+Dengue+Tetravalent+Vaccine+Elicits+Neutralizing+Antibodies+Against+All+Four+Dengue+Serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vaccine+Immunotechnology%22%5BJournal%5D)">COBRA-Based Dengue Tetravalent Vaccine Elicits Neutralizing Antibodies Against All Four Dengue Serotypes.</a> J Vaccine Immunotechnology. 1 (7), (2014).</li>
<li>Manual for the Laboratory Diagnosis and Virological Surveillance of Influenza. World Health Organization. , (2011).</li>
<li>Mitnaul, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balanced+Hemagglutinin+and+Neuraminidase+Activities+Are+Critical+for+Efficient+Replication+of+Influenza+A+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Balanced Hemagglutinin and Neuraminidase Activities Are Critical for Efficient Replication of Influenza A Virus.</a> J Virol. 74, 6015-6020 (2000).</li>
<li>Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJarvis%2C+DL+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 463, Academic Press. 191-222 (2009).</li>
<li>Pijlman, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enveloped+virus-like+particles+as+vaccines+against+pathogenic+arboviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Enveloped virus-like particles as vaccines against pathogenic arboviruses.</a> Biotechnol J. 10, 659-670 (2015).</li>
<li>Park, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+efficacy+of+crude+virus-like+particle+vaccine+against+HPAI+H5N1+in+chickens+and+its+application+on+DIVA+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Influenza+Other+Respir+Viruses%22%5BJournal%5D)">Protective efficacy of crude virus-like particle vaccine against HPAI H5N1 in chickens and its application on DIVA strategy.</a> Influenza Other Respir Viruses. 7, 340-348 (2013).</li>
<li>Gangadharan, D., Smith, J., Weyant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosafety+Recommendations+for+Work+with+Influenza+Viruses+Containing+a+Hemagglutinin+from+the+A%2Fgoose%2FGuangdong%2F1%2F96+Lineage.+MMWR.+Recommendations+and+reports+%3A+Morbidity+and+mortality+weekly+report%5BTitle%5D)+AND+%22Recommendations+and+reports+%2F+Centers+for+Disease+Control%22%5BJournal%5D)">Biosafety Recommendations for Work with Influenza Viruses Containing a Hemagglutinin from the A/goose/Guangdong/1/96 Lineage. MMWR. Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report.</a> Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 62, 1-7 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们已采用上述技术，成功表达并纯化了由多种结构蛋白组成的针对不同病原体的SVPs和VLPs。通常情况下，我们使用哺乳动物表达系统来制备VLPs。然而，在我们的实验中，来源于哺乳动物细胞的CHIK VLP产量较低。当采用重组杆状病毒-昆虫细胞系统时，CHIK VLP的产量更为可观。总体而言，杆状病毒-昆虫细胞系统能够产生更高水平的重组蛋白，这可能归因于与组织培养瓶相比，旋转瓶中可培养的细胞密度更高，同时也由于在杆状病毒多角体蛋白启动子控制下，外源基因的表达水平较高16。然而，使用杆状病毒的一个缺点是VLP制备物中存在杆状病毒本身，其具有佐剂活性，可能干扰疫苗研究中的免疫学结果17。我们还发现流感VLP的产量因所使用的HA和NA组合不同而存在差异；H3N2 VLP2的产量相较于H3N2 VLP1相对较低，这可能与VLP组装效率较低或NA兼容性有关15，仍需进一步研究。DNA构建体的优化以及转染比例的调整仍是确保VLP最佳产量的关键步骤。在基于哺乳动物系统的VLP制备中，我们选择始终使用哺乳动物表达载体pTR600，因其表达效率通常较高，且利用多种限制性内切酶进行亚克隆操作较为...

病毒样颗粒（VLPs）是一种已获批准用于人类疫苗接种的技术。事实上，一些近年来获批的疫苗，包括人乳头瘤病毒（HPV）疫苗和乙型肝炎疫苗，均采用了该技术。&#160;&#914; （Hep&#914;）疫苗采用这一方法。病毒样颗粒（VLPs）由能够自我组装的结构蛋白形成。组装后的颗粒模拟病毒的形态，但由于缺乏病毒基因组，不具备感染性和复制能力。VLPs 可从多种原核和真核表达系统中表达并纯化。文献综述显示，不同表达系统的使用比例如下：细菌—28%，酵母—20%，植物—9%，昆虫—28%，哺乳动物—15%1值得注意的是，基于L1衣壳蛋白的HPV疫苗是在酵母（Gardasil）或昆虫细胞系统（Cervarix）中生产的。2肝&#914; 疫苗，Recombivax 和 Engerix-&#914;，也在酵母中产生，且由 Hep 组成&#914; 表面抗原3,4.
我们采用哺乳动物细胞和昆虫细胞表达系统来生产需要多种结构蛋白共表达才能组装的病毒样颗粒（VLPs）。本研究的重点是设计、生产及纯化针对人类病原体的基于VLP的疫苗：流感病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）、登革病毒（DENV）和基孔肯雅病毒（CHIKV）。我们的方法具有足够的灵活性，可实现多个表达质粒或单个表达质粒中多种结构蛋白的共表达（图1）。此前，我们在人胚肾293T细胞中通过共转染编码流感病毒血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）和基质蛋白（M1）的质粒，成功生产并纯化了H5N1 VLPs5,6。这些基因经过密码子优化以利于在哺乳动物细胞中表达，并克隆至pTR600载体中；该载体是一种真核表达载体，含有巨细胞病毒即时早期启动子及内含子A，用于启动外源插入片段的转录，同时含有牛生长激素多聚腺苷酸化信号以终止转录7。在本研究中，采用类似方法，通过三个质粒共表达HA、NA（图1A）以及另一种病毒基质蛋白HIV Gag p55，用于生成人季节性流感亚型H3N2 VLPs，该方法已被证明可产生与天然流感病毒颗粒大小相似的VLPs8。尽管流感疫苗主要诱导抗HA抗体的产生，但加入流感神经氨酸酶可介导唾液酸酶活性，促进VLP从转染细胞中出芽9，同时也提供额外的免疫原性靶点。为了生产RSV VLPs，我们也选用了无关的HIV Gag核心结构，设计仅呈递RSV表面糖蛋白的原型疫苗，进一步展示利用HIV Gag形成VLP的灵活性，此前已有研究通过电子显微镜对此进行了描述和表征6,10。其他研究者此前已证明，可通过新城疫病毒（NDV）11和流感病毒基质蛋白12等多种病毒成分组装呈递RSV糖蛋白的VLPs。本研究使用全长表面糖蛋白序列，以保留其天然构象，这对于功能性受体结合以及通过酶联免疫吸附试验（ELISA）进行抗体识别检测可能是必需的。
我们使用单质粒表达系统生成颗粒的示例如登革病毒（DENV）和基孔肯雅病毒（CHIKV）。对于DENV，可通过转染含有prM/E结构基因表达盒的单个质粒，在293T细胞中产生不含衣壳的亚病毒颗粒（SVPs）13。术语SVP用于指在病毒结构蛋白组装过程中缺乏核心或衣壳蛋白。CHIKV样颗粒（CHIK VLPs）也可通过使用含有CHIKV结构基因盒（编码衣壳蛋白和包膜蛋白）的单质粒表达系统产生；或者通过感染携带相同结构基因盒的重组杆状病毒（该基因盒已优化以适应昆虫细胞表达）在昆虫细胞中产生（图1B-C）。
上述表达方法的最终结果是将病毒样颗粒（VLPs）释放到细胞培养基中，随后可通过穿过20%甘油垫的超速离心法进行纯化。在本报告中，我们介绍了从哺乳动物和昆虫细胞系统表达和纯化这些病毒样颗粒的方法。

<table><tbody><tr><td>质粒大提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Life Technologies</td><td>L3000075</td><td>Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>杆状病毒Bac-to-Bac表达系统</td><td>Life Technologies</td><td>10359-016</td><td></td></tr><tr><td>Cimarec I 6 多点搅拌器板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>50094596</td><td></td></tr><tr><td>Polyclear 超速离心管</td><td>赛顿</td><td>7025</td><td>确认超速离心机及吊桶尺寸适用的离心管</td></tr><tr><td>Micro BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐柠檬酸盐缓冲液</td><td>Sigma</td><td>P4922</td><td></td></tr><tr><td>邻苯二胺二盐酸盐&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P8287</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m 真空滤器上部（500 ml）</td><td>Nalgene</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>339741&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10902-096</td><td></td></tr></tbody></table>

用于疫苗接种的病毒样颗粒的表达与纯化

Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

病毒样颗粒（VLPs）和亚病毒颗粒（SVPs）为病毒疫苗设计提供了一种替代策略，相较于使用活病原体，具有更高的生物安全性和稳定性优势。VLPs无感染性且可自我组装，可用于呈递结构蛋白作为免疫原，从而避免了使用活病原体或重组病毒载体进行抗原递送的需要。本文展示了VLP在临床前动物试验未来应用中的不同设计与开发阶段，包括以下步骤：抗原选择、在选定细胞系中表达抗原、VLPs/SVPs的纯化以及抗原剂量的定量分析。我们展示了利用哺乳动物和昆虫细胞系表达抗原的方法，并比较了不同方法在产量上的差异。本文所述方法可适用于多种病原体，只需将抗原替换为使用者感兴趣的微生物中的免疫原性结构蛋白即可。VLPs和SVPs有助于抗原的表征，并辅助筛选最佳疫苗候选物。

病毒样颗粒的产量因病毒抗原构建设计的不同而有所差异。在本方案中，我们展示了利用昆虫细胞和哺乳动物细胞在上清液中生产SVP或VLP，并通过超速离心进行纯化的方法。使用了四种登革病毒（DENV）prM/E结构基因表达盒，构建了四种不同版本的DENV SVP（标记为1-4） 表1 在0.6 ml体积中，总蛋白含量介于1.1–2.6 mg之间。对于需要三种基因构建体的病毒样颗粒（VLP），我们发现合成流感病毒样颗粒的最佳DNA转染比例为HA:NA:Gag = 1:1:2；相比之下，单个表达多种基孔肯雅病毒蛋白的质粒足以用于生成重组杆状病毒和哺乳动物细胞来源的CHIK VLP。此外，哺乳动物细胞也可采用双质粒转染方法，例如以1:1的比例共转染RSV F和Gag，可获得约0.01 mg/ml的总细胞培养上清液蛋白量。如图所示 表1，CHIK SVP 在 Sf9 细胞中的产量可达到每毫升上清液 0.008–0.016 mg 总蛋白，而通过哺乳动物 293T 细胞生产时，蛋白产量降低 10 倍。在使用不同野生型全长 HA...

本文介绍了一种利用杆状病毒或哺乳动物表达系统合成病毒样颗粒并结合超速离心纯化的实验方案。该方法具有高度可定制性，可用于以安全且灵活的方式鉴定病毒抗原作为疫苗靶点。

病毒样颗粒（VLPs）和亚病毒颗粒（SVPs）是病毒疫苗设计的一种替代策略，具有提高安全性和免疫原性等优势……

本实验的总体目标是纯化由哺乳动物或昆虫细胞表达系统表达并分泌的病毒样颗粒（VLPs）。该方法可解决疫苗学领域中的关键问题，例如如何以安全且灵活的方式表达和纯化具有正确构象的病毒抗原。该技术的主要优势在于无需使用聚乙二醇进行蛋白质沉淀，也无需制备多层密度梯度来浓缩病毒样颗粒。尽管该方法可为鉴定病毒抗原作为疫苗靶点提供依据，病毒样颗粒（VLPs）也可用作疾病诊断和血清学检测的工具。对该方法进行可视化演示至关重要，因为在VLP重悬步骤中使用甘油垫的操作较难掌握，初学者可能因技术不当而失败。在转染当天，应按照生产商的建议配制脂质体和DNA溶液。用HA:NA:Gag比例为1:1:2、总DNA量为每T150培养瓶40微克的DNA混合物转染DNA细胞。重复此步骤制备九个T150培养瓶，总体积为200毫升。接着，将DNA和脂质体溶液用不含抗生素的无血清转染培养基稀释，使每个培养瓶中的总体积为24毫升。将培养瓶放回培养箱中，继续培养细胞和转染后的培养基，直至病毒样颗粒（VLP）收获日。转染后72至96小时，将上清液转移至50毫升锥形管中，以从细胞中收获培养物。离心细胞以沉淀细胞碎片。收集上清液，并通过0.22微米的滤膜过滤。将先前制备的草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）或Sf9细胞在旋转烧瓶中悬浮培养，使用多点搅拌板系统以130 rpm持续搅拌。培养体积应维持在不超过旋转烧瓶体积的一半，以确保适当的通气。接下来，将预先制备的重组杆状病毒接种于装有250毫升Sf9细胞的旋转烧瓶中，细胞密度为每毫升2×10⁶个，以表达CHIK VLPs，并将细胞放回28°C培养箱中继续培养。使用台盼蓝排斥法检测细胞活力，当细胞活力降至70%至80%时，立即将培养物从悬浮液中直接转移至50毫升锥形管中，离心沉淀细胞。收集上清液，并通过0.22 µm孔径滤膜过滤，随后进行沉降处理。用70%乙醇对六根25毫米×89毫米的开口超速离心管进行灭菌，然后确保乙醇完全挥发。将32毫升上清液加入洁净的离心管中。接下来，将上清液小心地叠加在 3 毫升无菌的 20% 甘油和 PBS 上。应缓慢加入甘油，以避免破坏甘油与病毒样颗粒（VLP）溶液之间形成的薄密度层。若加入甘油速度过快，会导致甘油与 VLP 溶液混合，从而降低 VLP 的沉降效果。确保离心管已平衡，然后启动离心。离心四小时后，从离心机中取出离心管。小心吸除上清液，避免将管底的沉淀物移出。用无菌 PBS 通过轻柔缓慢地吹打，将沉淀的 VLP 重新悬浮于管底至少 100 微升的液体中。使用移液器轻柔、缓慢地反复吸液和排液，以重悬 VLP 沉淀物。应避免产生气泡，以减少 VLP 的损失。最后，储存重悬的病毒样颗粒（VLP）。通过常规BCA测定法获得了多种SVP和VLP构建体的VLP体积及总蛋白产量。Sf9细胞产生的CHIK SVP产量在每毫升上清液体积中总蛋白含量为0.008至0.016毫克之间。尽管通过哺乳动物293T细胞进行生产会导致蛋白产量降低十倍。该电子显微镜图像显示，HA Gag核心流感病毒样颗粒（VLP）已成功表达、组装并纯化为VLP。在尝试此操作时，务必记住仅转染和感染健康且具有活力的细胞培养物，因为这将影响整体蛋白表达水平。完成此操作后，可采用其他方法如BCA法、ELIZA法和HA检测法，以测定总蛋白含量、特异性抗原含量以及功能性HA的表达。请注意，使用超速离心机可能存在危险，因此在进行该操作时，必须采取相应的预防措施，例如平衡离心管、仅使用推荐的转子和转速，以及对新进实验室人员进行适当的监督。

expression-and-purification-of-virus-like-particles-for-vaccination

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

表达和疫苗病毒样颗粒的纯化

来源：Yuan, M., 等．构建突变型痘苗病毒载体的一种简单高效方法．J. Vis. Exp.

基于荧光的重组痘苗病毒检测与纯化

本视频展示了在哺乳动物系统中生成流感病毒样颗粒（VLPs）的方法。通过在合适的哺乳动物宿主细胞中表达三种编码不同病毒结构蛋白的真核表达载体，表达的病毒蛋白可在宿主细胞质膜上自我组装形成VLPs，并通过细胞表面出芽的方式释放。...

一种通过哺乳动物系统产生流感病毒样颗粒的技术

本视频展示了如何通过用携带基孔肯雅病毒基因盒的重组杆状病毒感染昆虫细胞，从而产生病毒样颗粒（VLPs）。重组病毒感染细胞后，可诱导VLP的形成、组装并释放到培养基中，有望用于疫苗生产。...

利用昆虫细胞中杆状病毒表达系统产生基孔肯雅病毒样颗粒

一种快速且模块化的方案，用于生成表达荧光蛋白的重组痘苗病毒 此处描述了使用瞬时显性选择方法同时标记蛋白质的技术。...

高效生成荧光标记的痘苗病毒蛋白的方法学

在此，我们介绍一种用于构建原理验证型二价腺病毒5型（Ad5）载体Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His的实验方案。6 通过利用抗原衣壳整合策略，该载体被证明具有良好的适应性，并能够逃逸Ad5阳性血清的中和作用...

利用抗原衣壳整合策略开发腺病毒5型载体疫苗方法

痘苗病毒（VV）已广泛应用于生物医学研究及人类健康改善。本文介绍一种利用CRISPR-Cas9系统对VV基因组进行编辑的简单且高效的方法。...

一种构建突变型痘苗病毒载体的简单高效方法

本文提供了一种详细的方法，用于自组装蛋白纳米颗粒（SAPNs）的纯化、复性及表征，以应用于疫苗开发。...

E. coli表达的自组装蛋白质纳米颗粒的制备：适用于需要三聚体表位呈递的疫苗

本文介绍了一种基于聚（β-氨基酯）聚合物的mRNA纳米颗粒的简单制备方案，通过更换所包载的mRNA即可轻松实现定制化。该方案涵盖了聚合物的合成、纳米颗粒的制备及其表征的完整工作流程。 体外...

用于疫苗接种的mRNA负载型聚(β-氨基酯)纳米颗粒的合成与表征

本文介绍了一种用于检测抗原展示型病毒样颗粒（VLPs）上中和表位的实验方案。利用与蛋白G偶联磁珠结合的包膜糖蛋白特异性单克隆抗体，对来源于人类免疫缺陷病毒（HIV）的VLPs进行免疫沉淀。捕获的VLPs随后通过SDS-PAGE分离，并使用针对病毒核心蛋白Gag的特异性抗体进行Western印迹分析。...

利用捕获法检测基于病毒样颗粒（VLP）疫苗中抗原的中和敏感性表位

本方案描述了外膜囊泡的生物工程化，以构建“即插即用”型疫苗平台，包括其制备、纯化、生物偶联及表征。...

基于展示SARS-CoV-2受体结合域的外膜囊泡的“即插即用”纳米颗粒疫苗平台

了解病毒样颗粒纯化方法，用于疫苗开发中的病毒抗原鉴定。该技术利用哺乳动物或昆虫细胞系统表达VLPs，通过超速离心简化纯化流程，无需复杂密度层或蛋白沉淀步骤，为疫苗靶点识别提供安全灵活的解决方案。

用于疫苗接种的病毒样颗粒的表达与纯化

探索更多视频