原位杂交技术在植物中的精确定位成绩单
November 23rd, 2011
"原位这里描述的杂交协议允许的mRNA和小RNA在细胞水平的高灵敏度和特异性表达的直接本地化。石蜡包埋植物组织切片进行了优化的过程，是适用于广泛的植物和组织，并可以在十天内完成。
以下实验的总体目标是以高灵敏度和特异性在细胞水平上可视化 mRNA 表达模式。这是通过首先通过一系列溶液取正式和固定和石蜡包埋的组织切片来实现的，以去除蜡渗透组织并阻断组织中可以产生背景信号的带正电的次要基团。随后，将对目标基因具有特异性的 A DIG 标记的 RNA 探针浸润到组织切片中，并将载玻片杂交过夜。
接下来，用 RNA 处理载玻片。A 从切片中去除非特异性结合的探针，然后与抗 DIG 抗体一起孵育。这允许通过色度量化学反应对杂交探针进行可视化。
结果显示，光学显微镜可以在表达目标基因的组织内的那些细胞中检测到深蓝色信号。我们的其他表达分析技术（如 R-T-P-C-R、显微射线或下一代测序方法）的主要优点是，此处显示的 I 杂交方案揭示了目标基因在其组织环境中的表达模式。这些方法包括许多最好通过视觉演示来学习的步骤。
我们将展示如何切片和包埋组织，以及 Al Hybridization pro 实验步骤中难以自行掌握的关键步骤。包埋 Paraldehyde 固定组织的方法将根据要分析的组织类型而有所不同。这里最重要的一点是确保样品的方向正确，以便以后进行切片。
一种嵌入方法是使用塑料模具和环。要开始此过程，请在 60 摄氏度的加热板上加热模具，然后将熔融石蜡倒入模具中。接下来，使用加热的镊子将组织样本转移到每个模具中，并将其定位到所需的位置。
小心地将模具从板子上移到工作台上，然后将白色环放在模具上。添加额外的摩尔和蜡。在切片前让蜡逐渐冷却并变硬。
将块加热至室温，然后将每个块修剪成梯形，在样品周围留下约 1 毫米的蜡。将修剪后的块放在切片机上，使两个平行面中较长的位于底部。小心地将块向前移动到刀片上，并确保块的表面与刀片部分平行。
厚度为 8 至 10 微米。将蜡带对准不粘表面（如铝箔），并在解剖镜下选择感兴趣的切片。接下来，用铅笔标记 prob bon plus 载玻片。
不要在记号笔上使用笔，因为它们会在 INI two 杂交方案期间被擦除。将 1 毫升干净的 milli Q 水分配到每张载玻片上。在室温下小心地将感兴趣的部分漂浮在水面上。
确保有光泽的一面朝向水面。将玻片缓慢转移到玻片加热器上。设定在 35 至 37 摄氏度。
与通常使用的 42 摄氏度相反，这个温度范围可以防止在截面下形成气泡。五分钟后，小心但平稳地倒出水，使丝带下降到载玻片上。让载玻片在 37 摄氏度下干燥至少几个小时或过夜，以便组织粘附以准备组织切片。
对于原位杂交，它们首先被 depa 再水化以进行 depa 定型。将玻片放入两次更换的 histic 透明溶液中孵育，每次 10 分钟。要对组织切片进行再水化，请将载玻片通过一系列浓度较低的乙醇，每次 30 秒。
在本视频中未显示的蛋白酶处理期间，准备一个装有 0.1 摩尔铁人三项胺溶液的玻璃皿，并将其放在通风橱中的搅拌板上。在将金属载玻片架放入溶液中之前，将 1.25 毫升乙酐加入铁人三项胺、缓冲液和楼梯间中。此外，设置夹紧系统和用于固定滑轨架的支架。
降低 Starr 的速度，将载玻片架夹在支架上，然后将架子降低到溶液中，使其保持在搅拌棒上方。用 PBS 冲洗后继续缓慢搅拌 10 分钟，然后再次通过乙醇系列脱水。组织切片已准备好进行杂交。
将玻片放在干净的表面上，让空气完全干燥 5 到 10 分钟。通过将变性探针添加到 80 μL 杂交缓冲液中来制备探针杂交缓冲液混合物。对于每张载玻片，通过移液 plus 充分混合，避免产生气泡。
移液探针杂交缓冲液。混合到玻片的右边缘。逐渐将盖玻片降低到载玻片上，确保杂交溶液覆盖所有切片，没有任何气泡。
用手指轻轻轻敲形成气泡的封面剪，以将它们从所有组织切片中移开。不要拉下盖子剪，因为这会损坏部分。将载玻片放入装有 watman 纸的湿度室中，该纸用 UE 水润湿并大部分被 param 覆盖。
密封盒子，在所需的杂交温度（通常为 50 至 55 摄氏度）下孵育载玻片 16 至 20 小时。杂交方案完成后，小心地从载玻片上取下盖玻片。当载玻片直立放置时，盖玻片可能会简单地脱落，但如果没有，请不要拉下盖玻片，因为这会损坏切片。
相反，将载玻片浸入 0.2 倍 SSC 的温暖中一到两分钟以洗掉盖玻片，取下盖玻片后，将玻片放在架子上，在 0.2 倍 SSC 中在 55 摄氏度下洗涤数次。RNA 处理后，将载玻片从架子转移到扁平塑料盒的底部，并用最小体积的封闭溶液覆盖。将载玻片在室温下缓慢摇动 45 分钟。
接下来，将最小体积的抗体溶液直接涂在每张玻片上。将玻片在室温下避光孵育 2 至 3 小时。孵育完成后，将载玻片转移到干净的平板盒中，并在室温下在摇动平台上用最小体积的洗涤缓冲液洗涤载玻片四次。
在 TBS 中冲洗载玻片一次，在 TN 缓冲液中冲洗两次，以便将新鲜制备的染色溶液涂在载玻片上。首先，将染色液倒入一个小塑料称量皿中。然后将两张载玻片夹在一起，使部分彼此相对。
将三明治浸入溶液中，让毛细管作用拉起溶液。用 kim 抹布排干载玻片。用染色溶液填充载玻片。
同样，当溶液流入时，可能需要轻敲载玻片以避免气泡，将载玻片放入塑料盒中，并在室温下避光储存。此处显示了使用不同探针和拟南芥组织获得的代表性结果。紫色信号可在细胞分辨率下直接观察目标基因的表达模式。
图 A 显示了芽 Meli one 转录本在营养芽顶端的定位。请注意，在不确定的分生组织中存在紫蓝色信号，而周围的叶子中没有信号。图 B 2D 是拟南芥鱼雷期胚胎的切片，其中 B 显示 covata 3 在少数胚胎干细胞中表达。
C 显示 T ML 在表皮层中的表达，D 显示用随机阴性对照 RNA 探测的切片中缺乏信号。接下来的这些图像显示了在迷宫组织上使用不同探针获得的结果。图 E 显示了发育中的迷宫胚胎中 STM Humalog 打结的定位。
请注意，在胚胎 mes、茎和根纵切面上，通过营养槽顶端的强烈信号表明，ARF three A 在图 F 的轴向底叶表面表达，而 A T ML one 同源物 OCL four 在表皮中特异性表达。在图 G.As 预期中，未观察到图 H 中阴性对照探针的杂交信号，探针体外转录过程中不同检查点的预期结果如下所示。在 DNA 处理后的体外转录和随后的体外转录反应纯化后，在标准 ARAZ 凝胶上检查原位杂交探针碳酸盐水解后，当准备好用于长度超过 250 个碱基对的探针（例如探针 1）时，碳酸盐水解将产生一系列较小的探针片段。
该图显示了通过斑点印迹分析稀释度对探针进行颜色和公制鉴定的结果，稀释度范围从 10 到负 1 到 10 再到负 5,100 ng/μL 对照探针和三个新标记的 DIG 标记探针点样在与抗 DIG 抗体和测定一起孵育的转移膜上。分析表明，探针 2 的估计浓度为 100 纳克/微升，探针 3 的估计浓度为每微升 10 纳克，探针 4 的估计浓度为每微升 1 纳克，这表明探针 4 不太可能产生良好的杂交信号。最后，这些通过来自 Mace 的营养人溜槽顶点的纵向切片提供了非特异性背景信号和工作良好的探针板之间的比较。
A 显示了非特异性背景信号，而图 B 显示了外细胞层中 OC 5 探针的特异性原位 2 杂交信号。看完这个，你应该对如何执行 init 杂交协议中的许多棘手步骤有一个很好的了解，这样你就可以确定你最喜欢的青少年的精确压力时间表达模式。
概述
本文介绍了一种详细的原位杂交协议，用于可视化石蜡包埋植物组织中的mRNA表达模式。该方法针对高灵敏度和特异性进行了优化，使研究人员能够在其组织背景下观察基因表达。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 植物生物学
- 基因表达分析
背景
- 原位杂交允许定位mRNA和小RNA。
- 该协议适用于各种植物组织。
- 它提供了一种直接可视化基因表达模式的方法。
- 高灵敏度和特异性是该技术的关键优势。
研究目的
- 在细胞水平上可视化mRNA表达模式。
- 为分析植物组织中的基因表达提供可靠的方法。
- 展示原位杂交相对于其他表达分析方法的优势。
所用方法
- 准备石蜡包埋的组织切片。
- 将DIG标记的RNA探针渗透到组织切片中。
- 探针杂交和通过比色反应进行可视化。
- 使用特定的洗涤和阻断溶液来减少背景信号。
主要结果
- 在表达目标基因的细胞中观察到深蓝色信号。
- 该方法揭示了组织背景下的基因表达模式。
- 使用光学显微镜成功实现了可视化。
- 该协议可以在十天内完成。
结论
- 原位杂交协议对于研究植物中的基因表达是有效的。
- 它比RT-PCR和微阵列等其他方法具有明显优势。
- 适当的样品制备和取向对于成功切片至关重要。
常见问题
Executive Industry Relevance
Precise spatial localization of gene transcripts in plant tissues is critical for de-risking target validation and understanding gene function in developmental and stress-response pathways. In situ hybridization enables high-resolution mapping of mRNA and small RNA expression, supporting predictive confidence in early discovery and translational research. This capability strengthens portfolio decisions by clarifying gene activity within relevant cellular contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of gene expression at cellular resolution for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by revealing spatial and temporal expression patterns in situ.
- Facilitates hypothesis testing for gene function in developmental and stress-response models.
- Improves predictive confidence for advancing gene targets in plant biotechnology pipelines.
Screening & Assay Development
- Provides validated tissue-based systems for downstream molecular and phenotypic assays.
- Delivers reproducible, quantitative spatial readouts for assay standardization.
- Enables rapid evaluation of multiple gene targets without the need for transgenic lines.
- Supports scalable screening by applying the protocol across diverse plant species and tissues.
Translational & Preclinical Research
- Aligns gene expression data with disease-relevant or stress-response phenotypes in plants.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by confirming endogenous gene activity.
- Reduces risk of false positives by distinguishing specific from background signals in tissue context.
- Supports biomarker identification for translational research in crop improvement and trait development.
Pipeline & Workflow Integration
In situ hybridization fits between early discovery and preclinical validation, bridging high-throughput transcriptomics with spatially resolved expression analysis.
- Discovery Biology: Confirms gene expression hypotheses and clarifies pathway localization in plant tissues.
- Screening: Provides robust, reproducible spatial data to inform downstream functional assays.
- Analytics: Generates quantitative and qualitative readouts for comparing gene expression across conditions and genotypes.
- Translational Research: Links molecular findings to phenotypic outcomes in relevant plant models.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable across plant species and gene targets, supporting broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene function studies.
- Operational Value: Standardizes spatial gene expression analysis with high sensitivity and specificity.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and prioritizes targets with validated tissue-specific expression.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of gene targets and traits in plant biotechnology pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue embedding, sectioning, and probe design for optimal results.
- Needs access to microtomy, hybridization, and colorimetric detection infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility and data comparability.
- Protocol is adaptable but may require optimization for different plant species or tissue types.
- Signal specificity and background minimization are critical for reliable interpretation.
