Name: 原位杂交技术在植物中的精确定位成绩单 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: 学习原位杂交技术用于植物组织中mRNA表达模式的可视化分析。该方法利用DIG标记RNA探针在石蜡包埋切片上进行杂交，通过显色反应在细胞水平精确定位基因表达，具有高灵敏度和特异性。

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M.T. 实验室的研究工作得到了美国国家科学基金会（DBI-0820610 和 IOS-1022102）以及纽约州卫生部（NYSTEM-C024308）资助项目的支持。C.M. 获得了西班牙教育部和科学部（2007-0937）以及西班牙拉斐尔·德尔皮诺基金会的博士后奖学金。

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<li>Piette, D., Hendrickx, M., Willems, E., Kemp, C. R., Leyns, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+procedure+for+whole-mount+in+situ+hybridization+on+mouse+embryos+and+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">An optimized procedure for whole-mount in situ hybridization on mouse embryos and embryoid bodies.</a> Nat. Protoc. 3, 1194-1201 (2008).</li>
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</ol>

未声明任何利益冲突。

的 原位 此处所述的杂交方法能够以高细胞分辨率、高灵敏度和高特异性，直接可视化任意目标基因的时空表达模式。该方案不适用于基因间表达水平的定量比较。然而，该方法的高灵敏度和高分辨率可揭示组织内基因表达的梯度变化。8, 18而大多数其他基因表达分析方法无法实现这一点。 
该实验方案包含多个步骤，这可能使问题排查变得困难。方案中最关键的步骤是组织的固定以及探针的选择与标记。组织渗透不良或地高辛（DIG）掺入量低的探针将产生非常微弱的信号，可能难以在背景之上被检测到。针对每一个新研究的基因，建议尝试来源于转录本不同区域的几个不同探针。有时，可能需要组合使用针对基因不同较小区域的两到三个探针，以获得强且特异的杂交信号。此外，杂交条件（如杂交缓冲液的温度和组成）可根据每个基因或组织进行优化，以降低或提高杂交的严谨性。蛋白酶处理步骤也是一个可变环节，可根据不同植物物种或极低丰度转录本的检测需求进行调整。同时使用阳性和阴性对照探针将有助于识别实验方案中的问题环节。
该方案针对石蜡包埋的植物组织切片进行了优化，但经过少量修改后也可用于整体封片 原位 杂交。尽管在动物研究中被广泛使用19，整体封片 原位 杂交将仅限于易于渗透的植物组织，例如胚胎、根或幼嫩的分生组织20,21该方案还可轻松修改，以同时检测两种不同的mRNA，或在蛋白质存在的情况下对转录本进行定位15,22,23最后，该方法还可拓展用于植物中小RNA表达模式的可视化研究。利用本实验方案，已在玉米和拟南芥中成功确定了miRNA的表达模式。8,14。最近， 体外 转录探针已被商品化的地高辛标记的锁核酸（LNA）寡核苷酸探针取代，后者可提高信号灵敏度18, 24.

<table><tbody><tr><td>细胞封片剂 Cytoseal 60 4盎司</td><td>费舍科学（Fisher Scientific）</td><td>23-244-256</td><td>甲苯基 8310-4</td></tr><tr><td>组织清除剂 Histoclear</td><td>费舍科学（Fisher Scientific）</td><td>50-899-90147</td><td></td></tr><tr><td>组织包埋石蜡 Tissue Path Paraplast Plus </td><td>费舍科学（Fisher Scientific）</td><td>23-021-400</td><td></td></tr><tr><td>尼龙膜 Hybond-N+ </td><td>GE Healthcare</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>RNase OUT；40 U/&amp;mu;L </td><td>英潍捷基（Invitrogen）</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 无RNase的DNase；1 U/&amp;mu;l </td><td>普洛麦格公司（Promega Corp.）</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>DIG标记对照RNA </td><td>罗氏集团（Roche Group）</td><td>11585746910</td><td></td></tr><tr><td>DIG RNA标记混合物</td><td>罗氏集团（Roche Group）</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA聚合酶 1,000 U </td><td>罗氏集团（Roche Group）</td><td>10810274001</td><td></td></tr><tr><td>T3 RNA聚合酶 1,000 U </td><td>罗氏集团（Roche Group）</td><td>11031163001</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA聚合酶 1,000 U </td><td>罗氏集团（Roche Group）</td><td>10881767001</td><td></td></tr><tr><td>RNase-A </td><td>罗氏集团（Roche Group）</td><td>109142</td><td>溶于50%甘油和100 mM Tris缓冲液（pH 8.0）</td></tr><tr><td>封闭试剂</td><td>罗氏集团（Roche Group）</td><td>1 096 176</td><td>在TBS缓冲液中加热至70&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>抗地高辛-碱性磷酸酶（Anti-Digoxygenin-AP），羊来源Fab片段 150 U </td><td>罗氏集团（Roche Group）</td><td>1 093 274</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP储备溶液</td><td>罗氏集团（Roche Group）</td><td>1 681 451</td><td></td></tr><tr><td>微型快速自旋RNA柱 mini Quick Spin RNA Columns </td><td>罗氏集团（Roche Group）</td><td>11814427001</td><td></td></tr><tr><td>来自&lt;em&gt; E. coli&lt;/em&gt; 的tRNA </td><td>罗氏集团（Roche Group）</td><td>109541</td><td></td></tr><tr><td>曲拉通&amp;#174;X-100 </td><td>西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich）</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>吐温-20 </td><td>西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich）</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>去离子甲酰胺</td><td>西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich）</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>来自&lt;em&gt;Streptomyces griseus&lt;/em&gt; 的蛋白酶，XIV型 </td><td>西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich）</td><td>P5147</td><td>用超纯水稀释，并在37&amp;#x00B0;C 预消化4小时 </td></tr><tr><td>三乙醇胺 </td><td>西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich）</td><td>90279</td><td>溶于水，用HCl调节至pH 8.0</td></tr><tr><td>乙酸酐 </td><td>西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich）</td><td>A6404</td><td></td></tr><tr><td>来自&lt;em&gt;Leuconostoc spp.&lt;/em&gt; 的硫酸葡聚糖钠盐 </td><td>西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich）</td><td>D8906-5G</td><td>硫酸葡聚糖需加热至80&amp;#x00B0;C 以溶解。</td></tr><tr><td>Denhardt&amp;rsquo;s溶液 50倍浓缩液 </td><td>西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich）</td><td>D2532</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 - &amp;#8805;98%</td><td>西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich）</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>伊红Y二钠盐</td><td>西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich）</td><td>E4382</td><td>溶于96-100%乙醇直至饱和 </td></tr><tr><td>多聚甲醛 </td><td>西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich）</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇（200 proof）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>苯酚/氯仿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>包埋模具</td><td>电子显微镜科学公司（Electron Microscopy Sciences）</td><td>62352-15</td><td></td></tr><tr><td>包埋环</td><td>费舍科学（Fisher Scientific）</td><td>22-038-197</td><td></td></tr><tr><td>20 ml一次性闪烁瓶（带盖）</td><td>VWR国际公司（VWR international）</td><td>66020-326</td><td></td></tr><tr><td>载玻片 Probe-on-plus</td><td>费舍科学（Fisher Scientific）</td><td>22-230-900</td><td></td></tr><tr><td>显微盖玻片 24x50 mm</td><td>VWR国际公司（VWR international）</td><td>48404-452</td><td></td></tr><tr><td>沃特曼3 mm滤纸</td><td>VWR国际公司（VWR international）</td><td>89022-360</td><td></td></tr><tr><td>三个玻璃皿和一个不锈钢载玻片架</td><td>电子显微镜科学公司（Electron Microscopy Sciences）</td><td>71420-25</td><td>两个玻璃皿用于Histoclear处理，最后一个用于乙酸酐处理</td></tr><tr><td>18个洁净塑料容器</td><td>电子显微镜科学公司（Electron Microscopy Sciences）</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>2或3个带密封盖的大型平底塑料盒</td><td></td><td></td><td>用于杂交和抗体步骤</td></tr><tr><td>细毛刷</td><td></td><td></td><td>有助于操作石蜡切片带</td></tr><tr><td>切片机</td><td></td><td></td><td>Leica</td></tr><tr><td>自清洁干式真空系统</td><td>韦尔奇·艾伦（Welch Allyn）</td><td>2025</td><td></td></tr><tr><td>载玻片烘片台</td><td>费舍科学（Fisher Scientific）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热金属块</td><td></td><td></td><td>需要在60&amp;#x00B0;C 和85&amp;#x00B0;C 使用</td></tr><tr><td>58-60&amp;#x00B0;C 恒温培养箱 </td><td>费舍科学（Fisher Scientific）</td><td></td><td>用于熔融Paraplast步骤</td></tr><tr><td>55&amp;#x00B0;C 和37&amp;#x00B0;C 的恒温箱或水浴锅 </td><td>费舍科学（Fisher Scientific）</td><td></td><td>由于温度需快速切换，需准备两个</td></tr><tr><td>离心机（4&amp;#x00B0;C - 20&amp;#x00B0;C）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>通风橱</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

原位 杂交技术用于植物中转录本的精确定位

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

随着过去十年基因组学研究的进步，植物生物学领域已涌现出大量针对基因表达的大规模定量分析研究。研究人员正利用微阵列和下一代测序技术，对发育、生理及应激反应过程进行探究，解析表观遗传和小RNA通路，并构建大规模的基因调控网络1-3。尽管这些技术能够实现对大量基因集合的同步分析，但通常只能提供非常有限的基因表达变化时空分辨率。这一局限性可通过将上述分析方法与激光显微切割或荧光激活细胞分选技术结合使用而部分克服4-7。然而，要全面理解一个基因的生物学功能，必须掌握其在细胞分辨率水平上的时空表达模式。特别是在研究发育过程或环境刺激及突变体效应时，对基因表达模式的精细分析显得尤为关键。例如，关键调控基因在特定细胞类型中表达水平的微小定量差异，可能因伴随特定细胞类型的表达缺失或获得，而导致显著的表型变化。
有多种方法常用于基因表达模式的详细分析。其中之一是通过分析转基因报告基因品系。然而，在分析多个基因或在难以转化的植物中开展研究时，该方法可能耗时较长。此外，通常还需要独立验证，以确保转基因的表达模式能够模拟内源基因的表达模式。蛋白质的免疫组织化学定位或mRNA 原位 杂交技术为细胞和组织内基因表达的直接可视化提供了相对较快的替代方法。后者具有明显优势，可便捷地应用于任何目的基因。 原位 杂交可通过与标记的反义RNA探针结合来检测细胞中的靶mRNA，该探针由以下方法获得 体外 目的基因的转录 
本文概述了一种实验方案 原位 基因表达在植物中的高灵敏度和高特异性定位。该方法针对多聚甲醛固定、石蜡包埋的组织切片进行优化，可良好保存组织形态结构，并利用地高辛标记的探针，通过免疫检测及碱性磷酸酶显色反应进行可视化。本实验方案已成功应用于多种植物物种的多种组织，可用于分析mRNA及小RNA的表达情况8-14.

的 原位 此处描述的杂交方案可在细胞水平上高灵敏度、高特异性地直接定位 mRNA 和小 RNA 的表达。该程序针对石蜡包埋的植物组织切片进行了优化，适用于多种植物和组织类型，可在十天内完成。

随着过去十年基因组学研究的进步，植物生物学领域已涌现出大量研究，这些研究对基因进行了大规模的定量分析……

本实验的总体目标是在细胞水平上以高灵敏度和特异性可视化 mRNA 的表达模式。首先将经过福尔马林固定和石蜡包埋的组织切片通过一系列溶液处理，以去除石蜡、通透组织，并封闭组织中带正电荷的内源性基团，这些基团可能产生背景信号。随后，将针对目的基因的 DIG 标记 RNA 探针渗入组织切片中，并将载玻片在适宜条件下杂交过夜。接下来，将切片用 RNAs A 处理，以去除切片中非特异性结合的探针，然后与抗 DIG 抗体孵育。这可通过比色化学反应实现对杂交探针的可视化。结果显示，在组织内目的基因表达的细胞中，可通过光学显微镜检测到深蓝色信号。与R-T-P-C-R、微阵列或下一代测序等其他表达分析方法相比，该技术的主要优势在于，本文所示的原位杂交实验方案能够揭示目的基因在其组织环境中的表达模式。这些方法包含多个步骤，通过视频演示学习效果最佳。我们将展示如何对组织进行切片和包埋，以及在Al杂交实验方案中一些难以自行掌握的关键步骤。对于经戊二醛固定的组织，其包埋方法将根据待分析组织的类型而有所不同。此处最重要的环节是确保样本在后续切片时具有正确的方向性。一种包埋方法是使用塑料模具和模具环。开始此操作时，将模具置于60摄氏度的加热板上预热，然后将熔化的石蜡倒入模具中。接着，使用预热的镊子将组织样本转移至每个模具内，并将其调整至所需的位置。小心地将模具从载物台移至实验台，将白色环状物放置在模具上。加入额外的摩尔量（mol）和石蜡。在切片前，让石蜡逐渐冷却并完全固化。将包埋块升温至室温，然后将其修整为梯形，样品周围保留约一毫米的石蜡。将修整好的包埋块放置于切片机上，使两条平行面中较长的一侧位于底部。小心地将包埋块向前推进至刀刃处，并确保包埋块表面与刀片切面平行。厚度为8到10微米。将石蜡带置于防粘表面（如铝箔）上，并在解剖显微镜下选择感兴趣的切片区域。接着，用铅笔标记prob bon plus载玻片。请勿使用记号笔标记，因为在进行 INI 双杂交实验时标记会被擦除。将一毫升洁净的 Milli-Q 水均匀滴加到每张载玻片上。在室温下，小心地将感兴趣的切片漂浮于水面。确保有光泽的一面朝向水。将载玻片缓慢转移至载玻片加热台上，温度设置为 35 至 37 摄氏度。与常用的42摄氏度相比，此温度范围可防止切片下方产生气泡。五分钟后，小心地一次性将水倒出，使切带平缓地降落在载玻片上。将载玻片在37摄氏度下干燥至少数小时或过夜，以使组织牢固附着，从而制备组织切片。进行原位杂交时，首先对样本进行脱蜡并重新水化以完成脱蜡步骤。将载玻片先后浸入两份组织清除剂溶液中，每次10分钟。为使组织切片重新水化，需将载玻片依次通过浓度递减的乙醇溶液，每步30秒。在蛋白酶处理过程中（本视频未展示），准备一个盛有 0.1 摩尔三乙醇胺溶液的玻璃皿，并将其置于通风橱内的搅拌器上。在将金属载片架放入溶液前，立即向三乙醇胺缓冲液中加入 1.25 毫升乙酸酐，并搅拌均匀。此外，安装好用于固定载片架的夹紧装置和支架。降低Starr夹的速度，将载玻片架夹到支架上，并将架子放入溶液中，保持其高于搅拌子。在用PBS冲洗并再次通过乙醇系列脱水后，继续缓慢搅拌10分钟。组织切片现已准备好进行杂交。将载玻片置于洁净的表面上，室温下完全干燥5到10分钟。通过将变性的探针加入80微升杂交缓冲液中，制备探针杂交缓冲液混合物。每张载玻片均需用移液器反复吹打混匀，注意避免产生气泡。用移液器吸取探针杂交缓冲液，将其混合至载玻片的右侧边缘。逐渐将盖玻片放下，覆盖在载玻片上，确保杂交溶液覆盖所有组织区域，且无气泡产生。用手指轻轻敲击盖玻片上气泡形成的位置，以驱除所有组织切片中的气泡。切勿撕下盖玻片，以免损伤切片。将载玻片置于湿盒中，湿盒内放置经超纯水润湿的Watman滤纸，并用Parafilm膜大面积覆盖。将盒子密封后，在所需的杂交温度下孵育载玻片，通常为 50 至 55 摄氏度，孵育 16 至 20 小时。杂交程序完成后，小心地从载玻片上移除盖玻片。当载玻片直立时，盖玻片可能会自行脱落；若未脱落，切勿强行撕下盖玻片，以免损伤组织切片。去除盖玻片后，将载玻片浸入温热的0.2倍SSC溶液中1至2分钟，以洗去盖玻片，随后将载玻片放入染色架中，并在55摄氏度下用0.2倍SSC溶液多次洗涤。RNA处理后，将载玻片从染色架转移至平底塑料盒底部，并加入最小体积的封闭液覆盖载玻片。在室温下，于缓慢摇动的平台上封闭45分钟。接下来，将少量抗体溶液直接加到每张载玻片上。室温下避光孵育 2 至 3 小时。孵育完成后，将载玻片转移至一个洁净的平底盒中，并在摇床上用少量洗涤缓冲液于室温下洗涤 4 次。用TBS缓冲液冲洗载玻片一次，再用TN缓冲液冲洗两次，随后即可施加新鲜配制的染色液。首先，将染色液倒入一个小的塑料称量皿中。然后将两张载玻片夹在一起，使组织切片面相互对向。将三明治结构浸入溶液中，利用毛细作用使溶液上升。将载玻片在无尘纸上沥干。向载玻片中加入染色液。同样，当溶液流入时可能需要轻敲载玻片以避免产生气泡，然后将载玻片放入塑料盒中，于室温避光保存。此处展示了使用不同探针和拟南芥组织获得的代表性结果。紫色信号可在细胞水平上直观显示目的基因的表达模式。图A显示了营养生长阶段茎尖分生组织中Meli one转录本的定位情况。注意分生组织的未定型区域存在紫色蓝信号，而周围叶片中无此信号。图B至图D为拟南芥鱼雷期胚胎的切片，其中图B显示covata three在少数胚胎干细胞中表达。C 显示表皮层中 T ML 一个基因的表达，D 显示使用随机阴性对照 RNA 探针的切片中无信号。接下来的图像展示了在玉米组织上使用不同探针获得的结果。图 E 显示 STM Humalog knotted 一个基因在发育中的玉米胚胎中的定位。注意，在胚胎中胚和根部通过营养鞘顶端的纵切面中，信号特别强，表明在图 F 中，ARF3A 在轴向叶基部表面表达，而 ATML1 同源基因 OCL4 在表皮中特异性表达。如图 G 所示。如预期，在图 H 的阴性对照探针中未观察到杂交信号。此处展示了体外转录探针过程中不同检测点的预期结果。体外转录后，经 DNA 酶处理并随后纯化体外转录反应产物后，将原位杂交探针在标准 ARAZ 凝胶上进行检测。对于长度超过 250 个碱基对的探针（如探针 1），在碳酸盐水解后并准备使用时，碳酸盐水解将产生一系列较小的探针片段。该图显示了通过点杂交分析对探针进行颜色和定量评估的结果，分析中使用的稀释梯度为10⁻¹至10⁻⁵，起始浓度为100 纳克/微升的对照探针，以及三个新标记的DIG探针。这些探针点样于转移膜上，经抗DIG抗体孵育并进行检测。分析结果表明，探针二的浓度约为100 纳克/微升，探针三为10 纳克/微升，探针四为1 纳克/微升，提示探针四可能难以产生良好的原位杂交信号。最后，这些来自Mace品种营养鞘顶端的纵切面图像提供了非特异性背景信号与有效探针信号之间的对比。A 显示非特异性背景信号，而 B 显示 OC five 探针在外层细胞中的特异性原位双杂交信号。观看本视频后，您应能较好地掌握原位杂交实验中多个关键步骤的操作，从而能够确定您感兴趣的基因的精确时空表达模式。

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