Name: 单分子荧光原位杂交实验中单个大肠埃希菌细胞的转录标记方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 学习单分子荧光原位杂交技术，利用荧光标记DNA探针标记大肠埃希菌单个mRNA转录本，实现固定细胞中mRNA分子的检测、定位与定量，为系统生物学研究转录过程统计特性提供可靠方法。

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本工作由以色列科学基金会资助项目514415（资助J.S.）以及BSF-NSF（MCB）资助项目2016707（资助J.S.）支持。同时感谢Siegfried和Irma Ullman讲席教授基金（资助J.S.）提供的支持。

1. 探针设计
注意：本方案使用已商业化的、预先标记有荧光染料的寡核苷酸探针。这些探针包含一组与目标 mRNA 互补的特异性序列，每条探针均偶联一个荧光分子。此外，也可按照其他文献所述方法将荧光标记物连接至探针5,16。
<ol>
	<li>使用设计smFISH探针&#160;探针设计工具16 由麻省理工学院 Arjun Raj（van Oudenaarden 实验室）开发的算法；本文所用 smFISH 探针序列列于材料表中。 
	注意：一组探针中产生可检测信号的最少探针数约为30。该精确数目可能因目标基因而异，特别是当检测非常短的转录本时。</li>
	<li>选择适合光学装置的染料（参见材料表）。 
	注意：强烈推荐使用Cy3染料或光学性质等效且抗光漂白性能较强的染料。用于双重标记的候选染料为Cy5或光学性质等效的染料（参见材料表）。适用于标记mRNA的STORM成像的染料，其特征在于能够进行多轮荧光发射。某些smFISH染料可用于STORM成像（参见材料表）。若要在同一细胞中对两个（或更多）对应于不同基因的转录本进行成像，应选择偶联染料的寡核苷酸探针，其染料光谱应尽可能无重叠或重叠极少。</li>
</ol>
2. 试剂准备
注意：使用无RNase的耗材（如带滤芯的移液器吸头和离心管）并保持工作环境清洁，对于防止样本受到RNase污染至关重要。为避免靶标转录本降解，细胞固定后所用的所有试剂必须为无核酸酶试剂（参见材料表）或经焦碳酸二乙酯（DEPC）处理并灭菌的试剂。
<ol>
	<li>smFISH用缓冲液
	<ol>
		<li>配制无RNase的1×&#160;PBS（磷酸盐缓冲盐水，磷酸盐缓冲液浓度为0.01 M，氯化钠浓度为0.154 M，pH 7.4）。将无RNase的10× PBS（见材料表）用无核酸酶水（见材料表）按1:10的体积比稀释。
		<ol>
			<li>也可配制经DEPC处理的1× PBS。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>配制无RNase的2× SSC（生理-柠檬酸钠缓冲液，含0.3 M NaCl和0.03 M柠檬酸钠，pH 7.0）。将无RNase的20× SSC（见材料表）用无核酸酶水按1:10的体积比稀释。
		<ol>
			<li>也可配制经DEPC处理的2× SSC。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>寡核苷酸探针储备液
	<ol>
		<li>将干燥的寡核苷酸探针混合物重新溶解于200 µL TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 8.0）中，配制成25 µM的探针储备液。通过移液器反复吹打充分混匀，然后涡旋并短暂离心。</li>
		<li>为避免反复冻融储备液管，可将储备液分装成多个等份，每份对应单次实验预计使用量。将储备液储存于-20 °C或更低温度，并避光保存。 
		注：一组5 nmol的探针最多可进行约250次杂交反应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>杂交缓冲液（参照Skinner et al.7 方法）：
	<ol>
		<li>向一个50 mL聚丙烯圆底离心管中加入5 mL无核酸酶水。加入1 g硫酸葡聚糖，通过剧烈涡旋溶解。在轨道摇床上混合内容物直至气泡消失（约30分钟）。</li>
		<li>向上述溶液中加入3,530 µL去离子甲酰胺、10 mg E. coli tRNA、1 mL 20×&#160;SSC、100 µL 200 mM 钒酰-核糖核苷复合物以及40 µL 50 mg/mL BSA。用DEPC处理水或无核酸酶水定容至10 mL，涡旋至溶液均匀。 
		注：为避免反复冻融，可将该溶液分装成多个等份，每份对应单次实验预计使用量。将储备液储存于-20 °C。打开甲酰胺瓶前，务必使其恢复至室温。为降低背景信号，建议优化甲酰胺的最佳浓度（体积比10–40%）。 
		注意： 警告！甲酰胺具有高毒性，且为已知致畸物。避免接触眼睛或皮肤，避免吸入或摄入。操作时应在通风橱内进行，并穿戴实验服和防护手套。</li>
		<li>通过0.22 µm滤膜过滤溶液以实现灭菌。分装后储存于-20 °C，可保存长达一年。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将37%甲醛（v/v）按1:8体积比加入1× PBS（见2.1.1）中，配制固定缓冲液（含4.6%甲醛的1× PBS），并涡旋混匀。 
	注意：警告！甲醛具有高毒性，且为已知致癌物。操作时应在通风橱内进行，并穿戴实验服和防护手套。</li>
	<li>通过将去离子甲酰胺按1:4体积比加入2× SSC（见2.1.2）中，配制smFISH洗涤缓冲液（含20%甲酰胺的2× SSC），并涡旋混匀。</li>
	<li>通过将5 mM半胱胺及氧清除剂（7 µM葡萄糖氧化酶、56 nM过氧化氢酶和10%葡萄糖（w/v））加入洗涤缓冲液（含20%甲酰胺的2× SSC）中，配制smFISH成像缓冲液。</li>
	<li>STORM用缓冲液
	<ol>
		<li>向无核酸酶水中加入50 mM Tris-HCl和10 mM NaCl，配制缓冲液A。 
		注：可在室温下长期储存数年。</li>
		<li>向无核酸酶水中加入50 mM Tris-HCl、10 mM NaCl和10% w/v葡萄糖，配制缓冲液B。 
		注：可在4 °C下储存长达一年。</li>
		<li>将77 mg半胱胺溶解于1 mL缓冲液A中，配制MEA缓冲液（得到1 M溶液）。 
		注：可在4 °C下储存一个月。</li>
		<li>向1 mL缓冲液A中加入8,440 AU（任意单位）葡萄糖氧化酶和70,200 AU过氧化氢酶，配制Gloxy缓冲液。 
		注：配制成50×储备液，可在4 °C下储存一个月。</li>
		<li>向缓冲液B中加入50 mM MEA缓冲液和1× Gloxy缓冲液，配制STORM成像缓冲液。 
		注：STORM成像缓冲液的组成为：50 mM Tris、10 mM NaCl、10%葡萄糖（pH 8.0），含5 mM半胱胺及氧清除剂（7 µM葡萄糖氧化酶和56 nM过氧化氢酶）。应在成像前现配，可在室温下储存并使用约2小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 样品固定
<ol>
	<li>培养细菌细胞（例如, E. coli MG1655）在选定的培养基中培养（例如，LB培养基）中于37 °C、260 rpm条件下在摇床中过夜培养。 
	注意：为确定探针非特异性结合所产生的背景信号，应使用目标基因已被敲除的菌株进行测量，并遵循相同的操作步骤（参见 Δgalk 在 图1 和 ΔsodB 在 图2).</li>
	<li>将过夜培养物按1:100比例稀释至新鲜培养基中，并测定其光密度（OD600在分光光度计中每约1小时测量一次，直至OD600值达到0.2 - 0.4；4 mL培养液即足够。 
	注意：如果所选显微镜不具备相差或微分干涉对比功能， E. coli 外膜可用 2 μM 疏水性荧光标记物（见材料表）进行标记，该标记物应在固定前 20 分钟加入细菌悬液中17固定和后续处理按以下所述进行。必须注意选择发射光谱不同的荧光标记，以尽量减少与标记探针组之间的光谱重叠。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 4,500 g 离心 5 分钟，使细胞成团；从所有离心管中弃去上清液。</li>
	<li>向每管中加入 1 mL 1x PBS，重悬沉淀，以尽量减少细胞间的聚集。然后加入 4 mL 固定缓冲液，轻轻涡旋混匀。</li>
	<li>在24 °C条件下，将样品置于转速为260 rpm的摇床中孵育30分钟。</li>
	<li>离心收集细胞，4 °C，1,000 g，10 min。弃上清液。加入1 mL 1×PBS。</li>
	<li>将悬液转移至1.8 µL圆底微量离心管（见材料表），并重复步骤3.6两次。</li>
</ol>
4. 样品透化
<ol>
	<li>非常小心地移除上清液。如有必要，使用小容量移液器将沉淀物外的所有液体彻底去除。</li>
	<li>将沉淀重悬于 300 µL DEPC 处理水或无核酸酶水中。加入 350 µL 高纯度无水乙醇（99%），轻轻颠倒离心管进行混匀。再加入 350 µL 乙醇，再次混匀，使最终乙醇浓度达到 70%（v/v）。 
	注意：警告！乙醇易燃。</li>
	<li>将样品置于旋转混合仪上，以 20 rpm 转速在室温（RT）旋转 1 小时，或在 4 °C 过夜。样品可在 4 °C&#160;保存最多一周。</li>
</ol>
5. 杂交
<ol>
	<li>离心收集细胞，7 min，750 × g，4 °C。弃上清液。</li>
	<li>加入1 mL 20%洗涤缓冲液至样品中，静置数分钟，或用移液器吹打使沉淀完全溶解。</li>
	<li>750 × g、4 °C 离心 7 分钟，沉淀细胞。</li>
	<li>用移液器非常轻柔地吸除上清液。如有必要，使用小容量移液器以完全去除沉淀物外的所有液体。</li>
	<li>将寡核苷酸探针组原液加入杂交缓冲液分装液中，使寡核苷酸终浓度为 250 nM；充分涡旋振荡。 
	注意：可在同一细胞内同时标记两种或多种不同的靶 mRNA。将两种靶标的探针组均加入杂交缓冲液中。需谨慎选择具有不同发射光谱的荧光染料，以最大程度减少光谱重叠（例如，Cy3 和 Cy5）。确保用于STORM成像的样品与一组寡核苷酸探针杂交，该探针需偶联适用于STORM的荧光染料（例如，见材料表）。</li>
	<li>将样品（见步骤 5.4）重悬于 50 µL 含有寡核苷酸探针的杂交缓冲液中，避免产生气泡（该溶液黏度较高）。</li>
	<li>在避光条件下，将样品置于30 °C的加热金属块上过夜。 
	注意：此后，样品可在 4 °C 下保存长达 6 个月。</li>
</ol>
6. 清洗
<ol>
	<li>为每个待成像样本使用一个新的微量离心管，加入 1 mL 洗涤缓冲液。</li>
	<li>从已杂交的样本中取 10–15 µL 加入含有洗涤缓冲液的新管中，混匀或涡旋振荡。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 750 × g 离心 7 分钟，使细胞沉淀，弃去上清液。 
	注意：为降低背景信号，可在 30 °C 下孵育 1 小时。</li>
	<li>再洗涤两次（用 1 mL 洗涤缓冲液重悬沉淀，离心后弃去上清液）。</li>
	<li>用 25 µL 洗涤缓冲液重悬沉淀。 
	注意：为减少光漂白，可在洗涤缓冲液中添加氧气清除系统（2.6），以提高单分子荧光实验中染料的稳定性6。</li>
</ol>
7. 成像样品的制备
注意：为了在荧光和相差显微镜下进行良好的成像，需要将细胞固定。以下方法可用于制备样本，以便在不同焦平面成像不同的视野。
<ol>
	<li>琼脂糖凝胶制备
	<ol>
		<li>将150 mg琼脂糖加入10 mL 2x SSC缓冲液中。切勿将2x SSC缓冲液加入琼脂糖粉末中，否则琼脂糖将无法充分溶解。</li>
		<li>每次微波加热10–15秒，直至出现大量气泡。取出后静置数分钟使其冷却。</li>
		<li>将一个分隔用硅胶框放置在载玻片上，使载玻片中心区域暴露出来。</li>
		<li>在载玻片中心放置一个宽10 mm（厚1–2 mm）的刚性环，并在其中加入少量凝胶进行密封。静置数分钟，待其凝固。</li>
		<li>继续添加凝胶，直至形成较高的穹顶状结构。静置10分钟使其完全凝固，然后移除环（可使用精细镊子或其他方法）。</li>
		<li>在凝胶上加入约10 μL洗涤后的细菌细胞（见6.5），并用#0盖玻片密封。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单分子FISH（smFISH）样品腔室制备
	<ol>
		<li>替代步骤7.1的方法：将洗涤后的细菌细胞（见6.5）固定在聚-D-赖氨酸包被的玻璃底一次性塑料培养皿中，用于成像。</li>
		<li>将样品置于避光条件下，室温孵育过夜，以促进细胞贴附于表面。成像前用洗涤缓冲液（2.5）洗涤一次；并始终用洗涤缓冲液（2.5）或smFISH成像缓冲液（2.6）保持样品湿润。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>STORM样品腔室制备
	<ol>
		<li>将样品制备于聚-D-赖氨酸包被的玻璃底一次性塑料培养皿中，用于STORM成像。</li>
		<li>将样品置于避光条件下，室温（RT）孵育过夜。成像前用smFISH洗涤缓冲液（2.5）洗涤一次，并加入STORM成像缓冲液（2.7.5）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 转录本可视化
<ol>
	<li>使用配备电动载物台的宽场荧光显微镜对细胞进行成像（参见材料表）。 
	注意：对于STORM修饰，应使用能够进行多轮荧光发射的染料标记的细胞。使用3D超分辨率成像系统对样品进行成像例如，参见材料表。</li>
	<li>使用（推荐）60-100x N.A. &#62;1.3 油浸相位差物镜，配合强光源使用，例如汞灯或金属卤化物灯；也推荐使用基于LED的光源。</li>
	<li>使用标准的冷却CCD相机，理想情况下应针对低光照成像而非成像速度进行优化（我们使用的相机像素尺寸为16 µm）（参见材料表）。 
	注意：必须使用冷却的EMCCD（电子倍增电荷耦合器件）相机，以降低热噪声，防止检测信号受到干扰，尤其是在单分子检测中。</li>
	<li>使用适合所选荧光染料的滤光片组。</li>
	<li>为准确确定细胞边界，应使用相差光学显微镜或对外细胞膜进行荧光标记，获取各样本中不同视野的图像。对所有通道采集不同焦平面（z轴堆栈）的图像（通常采集13个切片，间隔为250 nm）。 
	注意：显微镜的电动载物台和滤光片组应由商用软件（参见材料表）或自行开发的软件控制，以按顺序采集一系列图像。</li>
</ol>
9. 数据分析
<ol>
	<li>将图像堆栈转换为适合数据分析的格式。</li>
	<li>通过细胞中荧光焦点的总强度来估算目标 mRNA 的拷贝数，而不是像其他现有方案那样通过计数离散的“点”来进行估算。</li>
	<li>使用开源软件18或自定义程序进行图像分析。有关数据成像和分析的详细信息，请参见 Skinner et al.7</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们在实验室中使用单分子荧光原位杂交（smFISH）方法测量了大肠杆菌（E. coli）细胞中不同基因的转录本数量2。简而言之，该实验流程包括以下步骤：细胞固定、膜通透化以允许探针进入、探针杂交，以及利用标准荧光显微镜对样品成像。本方法基于先前已发表的方法，并进行了部分改进6,7,16。已有研究报道，为获得显著高于背景的信号，smFISH要求寡核苷酸探针的数量应处于48–72的范围内7。我们已证明，该数量实际上可能更少20，具体取决于目标基因序列、光学装置配置以及特定的实验条件。
每个探针的长度应为17-22个核苷酸，探针之间的间隔至少为两个核苷酸，GC含量约为45%，以减少非特异性、脱靶结合的影响。某些探针可能无法与目标结合，而结合的整...

基因表达中的随机性是一种基本且不可避免的特性，它导致了单个细胞之间在转录本和蛋白质水平上均存在异质性1，这种异质性既体现在转录本层面，也体现在蛋白质层面2,3。在明确定义的条件下量化细胞间的变异，为研究基因表达及其调控背后的基本过程提供了一个独特的窗口。在细菌中，细胞间异质性的一个重要来源发生在转录水平。转录本数量的波动不仅源于转录过程的随机性，还受到小RNA和RNA酶等介导的转录后调控过程的影响2。一种以定量方式直接检测此类异质性的方法是在单分子荧光原位杂交（smFISH）中对特定基因的单个转录本进行荧光标记。该方法能够在固定的单个细菌细胞中检测特定RNA分子并确定其亚细胞定位4。mRNA通过一组设计为特异性结合目标转录本的、约20个碱基长度的荧光标记寡核苷酸进行杂交5,6。多重标记确保信号高于背景荧光水平，单个mRNA分子在荧光显微镜下呈现为衍射极限的亮点7（见图1）。此外还有其他标记mRNA分子的方法，其中互补的寡核苷酸探针携带偶联的半抗原（例如，生物素或地高辛），通过荧光标记的二抗检测系统进行检测8。
除了单分子荧光原位杂交（smFISH）之外，还有其他方法可提供有关转录本的定量信息。其中一些方法，例如Northern印迹或定量PCR，检测的是整体样本，因此既无法测量单个细胞中mRNA拷贝的数量，也无法确定其位置，因而不适合用于量化细胞间的异质性。最近开发出一种基于图像的技术，称为多重误差稳健荧光原位杂交（multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization, MERFISH），能够同时定量细胞内RNA的拷贝数及其亚细胞定位。MERFISH技术基于为每种RNA分配一个唯一的条形码，该条形码由固定数量的荧光标记寡核苷酸探针中特定组合构成。这些条形码通过多轮连续的smFISH测量读取，每轮杂交后进行光漂白，从而使通量提高两个数量级9,10。该技术需要配备自动化的液体处理系统，并对探针组进行合理设计。
将单个转录本的多重荧光标记与新型超分辨率技术（如随机光学重建显微镜（STORM））相结合，可使转录本亚细胞定位的分辨率提高十倍11。在STORM中，合适的荧光探针与成像缓冲液组合可使每个探针分子实现多轮荧光发射（闪烁）。通过同时标记所有感兴趣的转录本，STORM还可用于成像大肠杆菌（E. coli）转录组，并观察RNA的全基因组空间分布12。
上述所综述的所有单细胞方法均基于在固定细胞中对转录本进行成像，因此无法提供有关细胞内转录本动力学特性的任何信息。为了在活细胞中追踪转录本13，可将目的基因与一段重复的RNA结合位点序列融合，从而对mRNA进行标记。这些结合位点随后会被RNA结合蛋白（如噬菌体MS2外壳蛋白）识别，该蛋白与荧光蛋白（如绿色荧光蛋白GFP）融合，从而实现荧光标记10,14,15。
本文介绍了一种使用一组荧光标记的DNA探针对单个mRNA进行标记的方法，可用于单分子荧光原位杂交（smFISH）实验，特别是在大肠杆菌（E. coli）中的应用。此外，我们还表明，通过少量修改，相同的标记方案也可用于STORM成像测量。

<table><tbody><tr><td>右旋糖酐硫酸钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>纯乙醇，99.5%，ACS级，无水</td><td>Mallinckrodt Baker - Avantor</td><td>8025.25</td><td></td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯（DEPC）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>无RNase 20X SSC</td><td>Life Technologies/Ambion</td><td>AM9763</td><td></td></tr><tr><td>无RNase 10X PBS</td><td>Life Technologies/Ambion</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 8.0）BioUltra，分子生物学用</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93283</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10977035</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学用甲醛溶液，36.5-38%水溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>去离子甲酰胺，无核酸酶</td><td>Thermo Fisher Scientific/Ambion</td><td>AM9342</td><td></td></tr><tr><td>大肠杆菌tRNA（转移型核糖核酸，来自大肠杆菌）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1753-500UN</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure BSA（50 mg/ml）</td><td>Thermo Fisher Scientific/Ambion</td><td>AM2616</td><td></td></tr><tr><td>钒酰-核糖核苷复合物（VRC），200 mM</td><td>New England Biolab</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>半胱胺和氧气</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30070</td><td></td></tr><tr><td>黑曲霉来源葡萄糖氧化酶，VII型，50KU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>D-岩藻糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8150</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiO 细胞标记溶液</td><td>Life Technologies</td><td>V2286</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖，试剂级</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>粘性硅胶隔离器 24-2mm 直径 × 1.8 mm 深度 JTR24R-A2-2.0</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR24R-A2-2.0&lt;span&gt; &lt;/span&gt;666208</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸包被玻璃底培养皿</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35GC-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Super life 丁腈无粉检查手套</td><td>Supermax</td><td>TC-N-9889</td><td></td></tr><tr><td>品牌灭菌培养箱胶带</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR61750</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管（1.8 ml）</td><td>Axygen - Corning Life Sciences</td><td>MCT-175C</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 圆底聚丙烯管（14 ml）</td><td>BD Biosciences</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>锥底聚丙烯离心管（50 ml）</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>移液管（Corning 5 ml）</td><td>Corning Life Sciences</td><td>4051</td><td></td></tr><tr><td>移液管（Corning 10 ml）</td><td>Corning Life Sciences</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>移液管（Corning 25 ml）</td><td>Corning Life Sciences</td><td>4251</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计比色皿</td><td>Sarstedt</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>无RNase移液器吸头 0.2 - 20 &amp;mu;l</td><td>FroggaBio</td><td>FT20</td><td></td></tr><tr><td>无RNase移液器吸头 10 - 200 &amp;mu;l</td><td>Axigene/corning</td><td>TF-200</td><td></td></tr><tr><td>无RNase移液器吸头 100 - 1000 &amp;mu;l</td><td>FroggaBio</td><td>FT1000</td><td></td></tr><tr><td>无RNase移液器吸头 100 - 1000 &amp;mu;l</td><td>Sorenson</td><td>14200</td><td></td></tr><tr><td>一次性注射器 10 mL 针头 G-21</td><td>Becton Dickinson, Biosciences</td><td>BD-309643</td><td></td></tr><tr><td>Minisart 0.2 μm 注射式滤器</td><td>Sartorius</td><td>16534 K</td><td></td></tr><tr><td>尼康仪器显微镜专用浸油 A型，8cc</td><td>Nikon</td><td>MXA20233</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片 76×26，3&quot;×1&quot;×1mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>421-004ET</td><td></td></tr><tr><td>#0 盖玻片 24×60</td><td>Thermo Fisher Scientific/Menzel</td><td>BNBB024060A0</td><td></td></tr><tr><td>旋转摇床</td><td>M.R.C</td><td>TOU-50</td><td></td></tr><tr><td>加热金属块</td><td>M.R.C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Fried Electric Company</td><td>G-560-E</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5427R</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>便携式移液控制器 Pipet-Aid XP2</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>4-000-501-I</td><td></td></tr><tr><td>用于细菌生长速率测定的OD600分光光度计（DiluPhotometer）</td><td>Midsci</td><td>OD600-10</td><td></td></tr><tr><td>iXon X3 EMCCD相机</td><td>Andor</td><td>DU-897E-CS0-#BV</td><td> </td></tr><tr><td>Eclipse Ti 显微镜</td><td>Nikon</td><td>MEA53100</td><td> </td></tr><tr><td>CFI 平场复消色差 DM 100X 油镜 lambda PH-3 数值孔径 1.45 工作距离 0.13</td><td>Nikon</td><td>MRD31905</td><td> </td></tr><tr><td>滤光片组（TRITC/CY3）：激发 - ET545/30X；发射 - ET620/60M；二向色镜 - T570LP</td><td>Nikon</td><td>49005</td><td> </td></tr><tr><td>滤光片组（CY5）：激发 - ET640/30X；发射 - ET690/50M；二向色镜 - T660P</td><td>Nikon</td><td>49009</td><td> </td></tr><tr><td>Nis-elements AR 自动研究软件</td><td>Nikon</td><td>MQS31000</td><td> </td></tr><tr><td>STORM 显微镜</td><td>Vutara</td><td>SR-200</td><td> </td></tr><tr><td>数值孔径 1.2 水浸物镜&lt;span&gt; &lt;/span&gt;</td><td>Olympus</td><td> </td><td> </td></tr><tr><td>SRX 图像采集与分析软件</td><td>Vutara</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Evolve 512 EMCCD相机</td><td>Photometrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stellaris&amp;reg; FISH 探针，定制检测，含 CAL Fluor&amp;reg; Red 590 染料</td><td>Biosearch Technologies Inc</td><td>SMF-1083-5</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;galK mRNA 探针序列：&lt;/strong&gt;</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtgttttttctttcagactc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tagccaaatgcgttggcaaa</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ctgaatggtgtgagtggcag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>caccaatcaaattcacgcgg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>acgaaaccgtcgttgtagtc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgataatcaatcgcgcaggg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtggtgcacaactgatcacg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>acgcgaactttacggtcatc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gctgattttcataatcggct</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gcatcgagggaaaactcgtc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gttttcatgtgcgacaatgg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>cacgccacgaacgtagttag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ttacgcagttgcagatgttt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tccagtgaagcggaagaact</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgctgcaatacggttccgac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtccagcggcagatgataaa</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgaccgttaagcgcgatttg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>agcctacaaactggttttct</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gcggaaattagctgatccat</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>aaggcatgatctttcttgcc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>cagtgagcggcaatcgatca</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgggcatggaaactgctttg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gatgatgacgacagccacac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gggtacgtttgaagttactg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtgttgtattcgctgccaac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ggtttcgcactgttcacgac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tggctgctggaagaaacgcg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ttcaatggtgacatcacgca</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>catgcgcaacagcgttgaac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ggcgttttcagtcagtatat</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>atacgtttcaggtcgccttg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgagactccgccatcaactc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gaaatcatcgcgcatagagg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>caatttgcggcacggtgatt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ttgacgatttctaccagagt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>acctttgtcgccaatcacag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ggatcagcgcgacgatacag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>atattgttcagcgacagctt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtctctttaatacctgtttt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ctccttgtgatggtttacaa</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>Stellaris&amp;reg; FISH 探针，定制检测，含 Quasar Fluor&amp;reg; Red 670 染料</td><td>Biosearch Technologies Inc</td><td>SMF-1083-5</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;sodB mRNA 探针序列：&lt;/strong&gt;</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtgttttttctttcagactc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tagccaaatgcgttggcaaa</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ctgaatggtgtgagtggcag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>caccaatcaaattcacgcgg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>acgaaaccgtcgttgtagtc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgataatcaatcgcgcaggg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtggtgcacaactgatcacg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>acgcgaactttacggtcatc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gctgattttcataatcggct</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gcatcgagggaaaactcgtc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gttttcatgtgcgacaatgg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>cacgccacgaacgtagttag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ttacgcagttgcagatgttt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tccagtgaagcggaagaact</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgctgcaatacggttccgac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtccagcggcagatgataaa</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgaccgttaagcgcgatttg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>agcctacaaactggttttct</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gcggaaattagctgatccat</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>aaggcatgatctttcttgcc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>cagtgagcggcaatcgatca</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgggcatggaaactgctttg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gatgatgacgacagccacac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gggtacgtttgaagttactg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtgttgtattcgctgccaac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ggtttcgcactgttcacgac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tggctgctggaagaaacgcg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ttcaatggtgacatcacgca</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>catgcgcaacagcgttgaac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ggcgttttcagtcagtatat</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>atacgtttcaggtcgccttg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgagactccgccatcaactc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gaaatcatcgcgcatagagg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>caatttgcggcacggtgatt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ttgacgatttctaccagagt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>acctttgtcgccaatcacag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ggatcagcgcgacgatacag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>atattgttcagcgacagctt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtctctttaatacctgtttt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ctccttgtgatggtttacaa</td><td> </td><td> </td><td></td></tr></tbody></table>

单个细胞中转录本标记方法 大肠杆菌 用于单分子荧光的细胞 原位 杂交实验

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

一种用于在固定细菌中对单个信使RNA（mRNA）转录本进行标记以用于单分子荧光检测的方法 原位 杂交（smFISH）实验在 E. coli单分子荧光原位杂交（smFISH）可用于测量目的基因在单个细胞间的mRNA拷贝数变异，以及转录本的亚细胞定位。该方法主要包括细菌培养物的固定、细胞膜的通透化处理，以及使用商业化短片段荧光标记寡核苷酸探针与靶标转录本进行杂交。smFISH可实现同一细胞内多个基因转录本的成像，但其多重检测能力受限于不同荧光标记物之间的光谱重叠。完成下文所示实验流程后，可利用配备适合弱荧光成像相机的显微镜对细胞进行成像。结合相位差图像分割获得的细胞轮廓或细胞膜染色结果，这些图像可通过开源或自定义软件分析，计算出细胞群体中mRNA拷贝数的分布情况。本文所述标记方法亦可用于随机光学重建显微镜（STORM）对转录本进行成像。

我们对 galK 和 sodB 转录本进行了单分子荧光原位杂交（smFISH）检测 E. coli 细胞。转录本与一组特异性序列杂交，这些序列互补于目标序列，每种探针均偶联一个荧光分子（参见材料表）。MG1655野生型的荧光与相差图像 E. coli 野生型（WT）或 JW0740（Keio 菌种库）19 galK 缺失菌株（ΔgalK) 暴露于 2 mM D-岩藻糖的样本显示于 图1A 和 1B细胞在暴露于D-岩藻糖后至少3 h进行固定。图中各面板 图1A （上图）显示13帧中的一帧，对应于细胞轮廓清晰对焦的高度，代表该层面的 galK 在不同浓度的胞外D-岩藻糖刺激下的诱导情况。荧光图像中细胞内的斑点对应于单个或少数几个galk转录本，每个细胞中转录本数量的确定通过定量局部荧光信号完成。当向细菌培养...

本文描述了一种利用荧光标记的DNA探针对单个信使RNA（mRNA）转录本进行标记的方法，用于大肠杆菌（E. coli）中的单分子荧光原位杂交（smFISH）实验。smFISH是一种可视化技术，可在固定的单个细胞中同时检测、定位并定量单个mRNA分子。

一种用于在固定细菌中对单个信使RNA（mRNA）转录本进行标记的方法，可用于单分子荧光原位杂交……

本实验方案的总体目标是对大肠杆菌（E. coli）中的单个转录本进行标记，使用荧光标记的DNA探针，以便在单分子荧光原位杂交（FiSH）实验中实现可视化。该方法有助于回答系统生物学领域中的一些关键问题，例如表征特定研究领域中转录本在细胞间的分布差异，以及转录本在细胞壁上的定位情况。该技术的主要优势在于能够提供有关转录过程统计学的大量信息。开始实验前，将大肠杆菌MG1655在LB培养基中于37摄氏度、260 RPM的摇床中过夜培养。次日，将过夜培养物按1:100的比例接种至新鲜培养基中，并使用分光光度计测量其光密度，直至达到0.2至0.4的数值。接下来，将细胞在4,500 ×g、4°C条件下离心5分钟，使细胞沉淀。弃去所有离心管中的上清液。每管加入1毫升1×PBS，重悬沉淀，以尽量减少细胞间的聚集。然后加入 4 mL 固定缓冲液，轻轻涡旋混匀试管。将样品置于摇床中孵育。重悬沉淀，以尽量减少细胞间的聚集，避免影响细胞成像。孵育后，离心收集细胞，弃去上清液，加入1毫升1×PBS。将悬液转移至1.8毫升锥底微量离心管中。通过离心收集细胞。开始细菌透化：小心移除上清液，使用小体积移液器彻底去除沉淀外的所有液体。随后，将沉淀重悬于 300 µL 经 DEPC 处理的水中。加入 350 µL 高纯度无水乙醇，通过轻轻倒置离心管来温和混匀溶液。再加入 350 µL 乙醇，再次混匀。然后在室温下以 20 RPM 的转速使用离心管旋转仪旋转样品 1 小时。将透化后的细胞离心收集沉淀。离心后，弃去上清液。向样品中加入1 mL 20%洗涤缓冲液。静置数分钟。随后，在4℃条件下以750 G离心7分钟，使细胞沉淀。小心地弃去上清液，并使用小容量移液器彻底去除沉淀周围的所有液体。然后将寡核苷酸探针组原液加入杂交缓冲液分装液中，使寡核苷酸终浓度为 250 纳摩尔，并剧烈涡旋混匀。将样品悬浮于含有寡核苷酸探针的 50 微升杂交缓冲液中，注意避免产生气泡。将样品置于 30 摄氏度的加热块上，避光孵育过夜。为准备洗涤步骤，为每个待成像样本取一个新的微量离心管。向每根管中加入一毫升洗涤缓冲液。将杂交样本中的10至15微升液体加入含有洗涤缓冲液的新管中。通过离心收集细胞沉淀。然后弃去上清液。再用洗涤液清洗样品两次。将沉淀重悬于25微升洗涤缓冲液中。通过将150毫克琼脂糖加入10毫升2X SSC缓冲液中制备琼脂糖凝胶。每次微波加热10至15秒，直至琼脂糖完全溶解。然后将试管放置一旁冷却几分钟。接着，在载玻片上放置一个分隔用的硅胶框架，使载玻片的中心区域保持暴露。将一个宽10毫米、厚1至2毫米的刚性环置于载玻片的中央。在中心位置滴加少量凝胶用于封固，静置几分钟使凝胶硬化。然后继续添加凝胶，直至形成较高的圆顶状。再静置约10分钟使凝胶完全硬化，随后取下环状模具。取10微升洗涤后的细菌细胞滴加到凝胶上，并用0号盖玻片封片。将样品避光保存，防止光漂白。大肠杆菌细胞的smFiSH测量结果显示了galK基因在不同胞外D-岩藻糖浓度下的诱导水平。背景信号由 galK 缺失菌株（即 delta galK JW0740）作为阴性对照显示。在大多数细胞中可见多个斑点，这对应于当向细菌培养物中加入 2 毫摩尔 D-岩藻糖时的单个或少数 galK 转录本。而在无胞外D-岩藻糖存在时，仅可见少量斑点。该实验方案的另一个应用实例是sodB基因，在野生型或JW1648 sodB基因缺失菌株中进行smFiSH检测所获得的荧光与相差显微图像。采用本方案制备的样品也可用于STORM成像，从而实现对细胞内转录本的精确定位。该技术问世后，为系统生物学领域的研究人员探索单个细胞中转录事件的统计特性开辟了道路。

method-for-labeling-transcripts-individual-escherichia-coli-cells-for

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

单分子荧光原位杂交实验中单个大肠埃希菌细胞的转录标记方法

荧光原位杂交（FISH）可用于鉴定单个细胞中的mRNA转录本，从而分析多基因活性，例如在恶性疟原虫感染的红细胞中同时转录var多基因家族中的多个成员1。该技术具有可适应性，可应用于不同类型的基因、细胞和生物体。...

单细胞基因转录的RNA荧光原位杂交（FISH）分析

本方案描述了一种进行荧光检测的实验操作流程 原位...

mRNA分子的荧光可视化与分析 原位 杂交在 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

生物分子研究 体内 对于理解生物体系中分子功能至关重要。本文描述了一种新方法，可实现荧光生物分子（如 DNA 或蛋白质）向活体微生物内部的导入。对 体内...

通过电穿孔法将荧光生物分子导入活体微生物并进行观察

本文介绍了一种直接测定纯化的大肠杆菌（Escherichia...

Escherichia coli中转运RNA丰度及其荷载水平的定量分析

该单分子荧光原位杂交实验方案经过优化，可用于定量营养生长和减数分裂期间芽殖酵母中的RNA分子数量。...

单分子荧光 原位 芽殖酵母营养生长与减数分裂过程中的杂交（smFISH）分析

定点突变是一种用于在脱氧核糖核酸（DNA）中引入特定突变的技术。本实验方案介绍了基于两步法和三步法聚合酶链式反应（PCR）的定点突变操作方法，该方法适用于任何感兴趣的DNA片段。...

位点定向诱变在体外和体内实验中的应用——以大肠杆菌（Escherichia coli）中的RNA相互作用为例

本文介绍了一种在单分子水平上评估复杂蛋白质样品中每种蛋白质组分标记均一性的实验方案。...

单分子水平下蛋白质组范围内的标记均一性定量分析

本方案描述了单分子荧光原位杂交（smFISH）技术的一种应用，用于测量体内mRNA合成与降解的动力学过程。...

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此处，我们介绍一种利用光学光热红外-荧光技术的实验方案 原位 杂交技术（OPTIR-FISH），也称为中红外光热-FISH（MIP-FISH），可用于鉴定单个细胞并研究其代谢活动。该方法具有广泛适用性，可用于多种应用，包括以单细胞分辨率绘制细胞代谢图谱。...

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长RNA的荧光末端标记与封装用于单分子FRET-TIRF显微镜观察

学习单分子荧光原位杂交技术，利用荧光标记DNA探针标记大肠埃希菌单个mRNA转录本，实现固定细胞中mRNA分子的检测、定位与定量，为系统生物学研究转录过程统计特性提供可靠方法。

单个细胞中转录本标记方法大肠杆菌用于单分子荧光的细胞原位杂交实验

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