单分子荧光原位杂交实验中单个大肠埃希菌细胞的转录标记方法

该方案的总体目标是标记大肠杆菌中的单个转录本，用于荧光标记的 DNA 探针，以便在单分子 FiSH 实验中进行可视化。该方法可以帮助回答系统生物学领域的关键问题，例如表征感兴趣领域的转录本细胞间能力。以及细胞壁定位的转录本。

这种技术的主要优点是它提供了有关转录过程统计的大量信息。为了开始该方案，在 LB 培养基中以 260 RPM 和 37 摄氏度的速度在 LB 培养基中培养 E.Coli MG1655 过夜。第二天，在新鲜培养基中将过夜培养物稀释 1 至 100，并在分光光度计中测量其光密度，最高可达 0.2 至 0.4。

接下来，在 4 °C 下以 4， 500 G 离心 5 分钟，使细胞沉淀。从所有试管中取出上清液。向每管中加入 1 毫升 1XPBS 并重新悬浮沉淀，以尽量减少细胞间聚集。

然后加入 4 毫升固定缓冲液并轻轻涡旋试管。在轨道振荡器中孵育样品。重新悬浮沉淀，以尽量减少细胞间聚集，这可能会干扰细胞成像。

孵育后，沉淀细胞，去除上清液，加入 1 毫升 1XPBS。将悬浮液转移至 1.8 mL 锥形底微量离心管中。通过离心沉淀细胞。

通过小心去除上清液开始细菌透化。使用小体积移液器去除沉淀外的所有液体。接下来，将沉淀重新悬浮在 300 微升 DEPC 处理水中。

加入 350 微升高级无水乙醇，倒置试管轻轻混合溶液。再加入 350 微升乙醇并再次混合。然后在室温下用试管旋转器以 20 RPM 的速度旋转样品 1 小时。

从透化中沉淀细胞。离心后，去除上清液。向样品中加入 1 毫升 20% 洗涤缓冲液。

让它们静置几分钟。接下来，在 750 G 和 4 摄氏度下离心 7 分钟，使细胞沉淀。非常轻柔地去除上清液，并使用小体积移液器去除沉淀外的所有液体。

然后将寡核苷酸探针组储备液加入杂交缓冲液等分试样中，使最终寡核苷酸浓度为 250 纳摩尔，并剧烈涡旋试管。将样品悬浮在 50 μL 含有寡核苷酸探针的杂交缓冲液中，同时避免产生气泡。将样品在 30 摄氏度的加热块上避光放置过夜。

为了准备洗涤，为每个样品获取一个新的微量离心管进行成像。向每管中加入 1 mL 洗涤缓冲液。从杂交样品中加入 10 至 15 μL 到含有洗涤缓冲液的新试管中。

通过离心沉淀细胞。然后，去除上清液。再洗涤样品两次。

沉淀重悬于 25 μL 洗涤缓冲液中。通过将 150 毫克琼脂糖添加到 10 mL 2X SSC 缓冲液中来制备琼脂糖凝胶。每次将溶液微波 10 到 15 秒，直到琼脂糖完全溶解。

然后将试管放在一边冷却几分钟。接下来，在载玻片上放置一个单独的硅胶框架，使载玻片的中心保持裸露。在载玻片中心放置一个 10 毫米宽、1 到 2 毫米厚的刚性环。

将少量凝胶沉积到中心进行密封，并等待几分钟让凝胶硬化。然后加入更多凝胶，直到形成高圆顶形状。等待约 10 分钟，让凝胶变硬并取下环。

将 10 微升洗涤细菌细胞沉积到凝胶上，并用零号盖玻片密封。将样品置于黑暗中以防止光漂白。大肠杆菌细胞的 smFiSH 测量显示了响应可变细胞外 D-岩藻糖浓度的 galK 诱导水平。

背景信号由 galK 缺失菌株或 delta galK JW0740 作为阴性对照显示。在大多数细胞中可以看到许多斑点。当向细菌培养物中加入两个毫摩尔 D-岩藻糖时，对应于单个或几个 galK 转录物。

然而，在没有细胞外 D-岩藻糖的情况下可以看到一些斑点。该方案应用的另一个示例由 sodB 基因提供，具有野生型或 JW1648 sodB 缺失菌株中 smFiSH 的荧光和相差图像。使用该方案制备的样品也可以使用 STORM 进行成像，这允许准确精确测量细胞中的转录本。

经过开发，这项技术为系统生物学领域的研究人员探索单个细胞中转录事件的统计数据铺平了道路。