Name: pHluorin的申请在芽殖酵母细胞内吞的定量，动力学和高通量分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: 学习利用超折叠pHluorin荧光蛋白和流式细胞术定量分析芽殖酵母细胞内吞途径中的囊泡运输事件。该方法可直接测量荧光标记货物的强度变化，为研究蛋白质突变对运输效率的影响提供高通量分析工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢 Gero Miesenböck 和 Tim Ryan 分享用于本研究中试剂构建的 pHluorin cDNA，感谢 Nathan Wright、Joanna Poprawski 和 Lydia Nyasae 提供出色的技术支持，感谢 Wendland 实验室成员提供的有益讨论，以及感谢约翰斯·霍普金斯大学综合影像中心（Integrated Imaging Center）的 Michael McCaffery 和 Erin Pryce 在显微镜和流式细胞术方面提供的建议与协助。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH，项目号：GM60979，授予 B.W.）和美国国家科学基金会（NSF，项目号：MCB 1024818，授予 B.W.）的资助。K.W. 的部分资助来自美国国立卫生研究院的培训项目（T32-GM007231）。A.F.O. 的研究得到了杜肯大学生物科学系发展基金以及美国国家科学基金会 CAREER 项目（553143）的支持。

1. 溶液与培养基
<ol>
	<li>准备以下储备液、培养基和培养板：
	<ol>
		<li>配制10x YNB：将67 g缺乏氨基酸的酵母氮源基础培养基（yeast nitrogen base lacking amino acids）溶解于1 L水中，用0.22 µm硝酸纤维素滤膜过滤除菌。</li>
		<li>使用1x YNB（来自10x母液）、2%葡萄糖（来自无菌的50% w/v母液）和1x氨基酸/营养混合物（来自100x母液，见步骤1.1.4）配制YNB液体培养基。用于质粒筛选时，根据需要省略特定的氨基酸或营养成分；为诱导Mup1表达，还需从氨基酸/营养混合物中省略甲硫氨酸。</li>
		<li>使用1x YNB（来自10x母液）、2%葡萄糖（来自无菌的50% w/v母液）、0.7 g/L氨基酸/营养混合物（见步骤1.1.5）和2.5%琼脂配制YNB平板培养基。制备方法：在860 ml水中加入25 g琼脂和0.7 g氨基酸/营养混合物，高压灭菌。待培养基冷却至55 °C后，加入100 ml 10x YNB和40 ml 50%葡萄糖。每10 cm培养皿倒入约30 ml培养基，室温下静置使其凝固，随后于4 °C保存。</li>
		<li>配制100x氨基酸/营养母液（用于液体培养基）：将以下成分溶于100 ml去离子水中：L-甲硫氨酸0.1 g、L-亮氨酸和L-赖氨酸各0.3 g、L-组氨酸、L-色氨酸、腺嘌呤和尿嘧啶各0.2 g（可根据特定菌株需要添加其他氨基酸或营养成分）。如需可轻微加热助溶，经0.45 µm硝酸纤维素滤膜过滤除菌。室温避光保存。用于质粒筛选时，根据需要配制缺少特定组分的母液。</li>
		<li>配制氨基酸/营养混合物（用于平板）：将以下成分混合：腺嘌呤0.5 g、L-亮氨酸4 g、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和尿嘧啶各2 g。用研钵和研杵充分研磨，避光保存。用于质粒筛选时，根据需要配制缺少特定组分的混合物，每升平板培养基中加入0.7 g该氨基酸混合物（见步骤1.1.3）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为进行显微镜观察，使用刀豆蛋白A（concanavalin A, ConA）包被8孔腔室载玻片。向每个腔室中加入25 µl浓度为2 mg/ml的ConA水溶液。用移液器吸头将ConA均匀涂布于孔底表面，室温下静置晾干至少4–8小时。建议在ConA包被后24小时内使用腔室载玻片。</li>
	<li>利用基于聚合酶链式反应（PCR）的整合方法（如Longtine et al. 和 Goldstein 与 McCusker25,26所述），构建在目标内吞货物蛋白上带有GFP或pHluorin原位融合标签的酵母菌株。 
	注：先前已有研究描述了含有pHluorin标记盒并携带卡那霉素抗性基因（KANMX6）和诺尔斯硫霉素抗性基因（NATMX4）的质粒20。
	<ol>
		<li>使用含有与基因组整合位点特异性序列的引物，扩增带有可筛选标记的GFP或pHluorin标记盒20,25。</li>
		<li>采用乙酸锂法27，将所得PCR产物转化至目标酵母菌株中。</li>
		<li>通过在含相应药物的YPD平板上培养细胞，筛选标记盒的整合子。平板配制方法：将10 g酵母提取物、20 g蛋白胨、0.1 g色氨酸和25 g琼脂溶于960 ml水中，高压灭菌。待培养基冷却至55 °C后，加入40 ml 50%葡萄糖，并根据需要加入G418至终浓度200 µg/ml（用于KANMX6筛选）或诺尔斯硫霉素至终浓度100 µg/ml（用于NATMX4筛选），混匀后倒板。</li>
		<li>通过PCR和/或使用抗GFP抗体进行Western印迹，以及通过荧光显微镜检测融合蛋白的荧光信号，验证单个克隆中GFP或pHluorin标签的正确整合20。 
		注：本研究中使用的具体酵母菌株和质粒分别列于表1和表2中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 组成型内吞货物稳态荧光的终点检测法
<ol>
	<li>接种细胞（约3个小型菌落）至5 ml YNB培养基中，培养基中根据质粒维持需要缺少相应的氨基酸或营养成分（如适用）。将细胞置于30 °C、250 rpm振荡的摇床培养箱中培养16–24小时。或者，将约1–2 mm的细胞菌落划线接种至缺少相应氨基酸或营养成分的YNB平板上，用于质粒筛选，并于30 °C过夜培养。</li>
	<li>测量密度（OD600使用分光光度计测定每种过夜培养物的光密度（OD）。制备5 ml、OD值为0.35–0.4的稀释液600在缺乏氨基酸或质粒维持所需营养物质的YNB培养基中，于30 °C振荡培养约3小时。若使用平板划线的菌落，则跳过此步骤，直接进行步骤2.4（见下文）。</li>
	<li>测量密度（OD600细胞密度，此时应在 0.6–1.0 OD 之间600/ml。取1.5 ml培养物转移至微量离心管中，在8,000 rpm（6,800 × g）条件下离心2 min以沉淀细胞。移除1,475 µl上清液。</li>
	<li>将细胞置于荧光显微镜下观察。在对每个样品成像前，先通过重悬细胞于剩余培养基中制备载玻片样品，并将3 µl细胞悬液滴加至盖玻片下。或者，可按照方案3中所述制备8孔腔室载玻片，根据质粒筛选需要使用YNB培养基。理想条件下，应使用100倍、数值孔径（NA）1.4或更高的油浸物镜、12位或16位相机，以及针对GFP荧光优化的激发/发射滤光片对细胞进行成像。 
	注意：若使用平板划线培养的细胞，可先在盖玻片上滴加3 µl新鲜YNB培养基制备载片。用移液器吸头从平板上挑取少量单菌落，将细胞分散于YNB培养基中，混匀后立即滴加至玻璃载片上，用于成像。</li>
	<li>每种条件下随机选取4-6个视野的细胞进行成像，使用相同的采集参数（即、滤光片组和曝光时间）应保持一致。 
	注意：对于pHluorin信号在MVB和液泡区室中被淬灭的细胞，为每个视野采集明场或微分干涉差（DIC）图像可能有助于观察。</li>
	<li>每种条件下定量至少30-50个细胞的荧光强度（参见方案5）。</li>
</ol>
3. 用于定量受调控内吞作用货物内吞动力学的实验方法
<ol>
	<li>接种2-3个酵母菌落（每个菌落直径约2 mm）至5 ml缺乏甲硫氨酸及其他用于质粒筛选的氨基酸或营养成分的YNB培养基中。在30 °C、振荡条件下培养16-24小时。 
	注意：本文中研究受调控内吞作用的货物蛋白所用的实验方案将采用甲硫氨酸透性酶Mup1。其他经历受调控内吞作用的货物蛋白也适合用pHluorin进行标记（例如尿嘧啶透性酶Fur4，其在缺乏尿嘧啶时积累于质膜，并在外界施加尿嘧啶后发生内化）；对于这些货物蛋白，应根据其特定的表达、诱导和内化条件调整培养基条件。</li>
	<li>在成像前约3小时，测定各过夜培养物的密度（OD600）。将培养物用缺乏甲硫氨酸及其他用于质粒维持的氨基酸或营养成分的YNB培养基稀释至5 ml，使OD600为0.35-0.4/ml，并在30 °C、振荡条件下继续培养。</li>
	<li>在步骤3.2的3小时孵育期间，预先将显微镜的环境培养室或加热载物台（如有）平衡至30 °C。</li>
	<li>取1 ml细胞培养物转移至微量离心管中，在8,000 rpm（6,800 × g）下离心2分钟以收集细胞沉淀，弃去上清液975 µl。</li>
	<li>准备经ConA处理的8孔玻璃底培养皿用于成像（见方案1.2）。</li>
	<li>向每个孔中加入200 µl缺乏甲硫氨酸及其他用于质粒筛选的氨基酸或营养成分的YNB培养基。将步骤3.4所得细胞沉淀用剩余上清液重悬，取2.5 µl细胞悬液滴加至各孔中央。通过移液吹打使细胞在孔表面均匀分散，并静置5-10分钟使细胞沉降附着。</li>
	<li>将培养皿置于已平衡至30 °C的倒置荧光显微镜上（见步骤3.3），使用明场照明找到合适的细胞视野。</li>
	<li>向孔中200 µl培养基内加入50 µl含有100 µg/ml甲硫氨酸（预热至30 °C）的YNB培养基，使终浓度达到20 µg/ml。操作时避免扰动孔内液体，以防细胞从底部脱落漂浮。</li>
	<li>开始成像前，让细胞平衡2分钟。在采集第一张图像前，立即调节显微镜至所需焦平面（通常赤道焦平面效果最佳）。</li>
	<li>以5分钟为间隔，连续采集45-60分钟的GFP和明场（或微分干涉差，DIC）图像，同一时间序列中的所有图像应使用相同的采集参数（例如，100倍、数值孔径1.4的油浸物镜，GFP滤光片下采集时间为500毫秒，DIC滤光片下为100毫秒）。 
	注意：若显微镜载物台及成像软件不具备自动校正焦平面漂移功能，则每次成像前可能需要手动重新调焦。此外，由于不同显微镜的照明和滤光片系统存在差异，实际采集时间会有所不同，应在实验开始前手动确定最佳成像条件。若使用除Mup1以外的其他内吞货物蛋白，可能需要根据该货物的内化动力学调整采集时间、成像间隔以及实验总时长。</li>
	<li>在每个时间点定量单个细胞的荧光强度（见方案5），并将数值表示为第一张图像初始荧光强度的百分比。</li>
</ol>
4. 定量分析经历调节性内吞作用的内吞货物的终点检测法
<ol>
	<li>按照方案3（步骤3.1至3.6）所述方法准备用于成像的细胞。</li>
	<li>在添加甲硫氨酸之前，立即使用明场和GFP滤光片组合对每种条件下的4-5个随机细胞视野进行成像。</li>
	<li>向孔中200 µl培养基加入50 µl含有100 µg/ml甲硫氨酸的YNB培养基（预热至30 °C），使甲硫氨酸终浓度达到20 µg/ml。操作时避免扰动孔内培养基，以防细胞从底部脱落漂浮。</li>
	<li>在添加甲硫氨酸30分钟后，使用与0分钟时间点（步骤4.2）相同的采集参数，对4-5个随机细胞视野进行成像。</li>
	<li>对每个时间点至少30-50个细胞的荧光强度进行定量分析（参见方案5）。使用以下公式计算Mup1-pHluorin在30分钟内化百分比：[0分钟平均强度 - 30分钟平均强度] / [0分钟平均强度] × 100%。 
	注意：可通过错开每个实验的起始时间，同时进行最多八个终点检测实验。表3提供了一个同时进行八项检测实验的工作流程示例。</li>
</ol>
5. 采集后分析
<ol>
	<li>从采集软件中以16位标记图像文件格式（.tif 或 .tiff 格式）导出图像。 
	注意：其他文件格式也可能适用，且 ideally 应使用无损压缩算法。8 位图像通常不适用于定量分析。</li>
	<li>使用 ImageJ 软件（可从“文件”菜单中的“打开”选项免费获取）打开文件。使用荧光图像进行定量分析，使用明场/DIC 图像作为参考，以确定细胞位置并排除死细胞（如果存在）；在 DIC 下观察时，死细胞比活细胞更暗，而在 GFP 激发/发射滤光片下观察时具有自发荧光。</li>
	<li>对荧光图像进行背景扣除。对于背景信号不均匀的图像，使用“Process”菜单中的“Background Subtraction”算法。采用默认设置（滚动球半径为50像素），该设置通常足以满足定量分析的需求。 
	注意：对于具有均匀背景的图像，步骤 5.3.1–5.3.2 中描述了另一种背景减除方法；然而，上述方法同样适用于均匀背景。
	<ol>
		<li>对于具有均匀背景的图像（即，图像所有边缘及中心区域的背景强度大致恒定），执行手动背景扣除。点击主 ImageJ 窗口中的“freehand selections”按钮，在图像中选择 3–5 个不包含细胞的随机区域。</li>
		<li>打开“分析”菜单中的“设置测量”功能，选择“平均灰度值”参数，然后使用“分析”菜单中的“测量”功能测量强度值。从3-5个测量区域计算平均值，并从该图像后续所有测量值中减去该平均值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为定量分析动力学实验（方案3），需为时间序列生成单个堆叠图像。按时间顺序依次打开各时间点的荧光图像，并使用“图像转堆叠”功能（位于“图像”菜单下的“堆叠”子菜单中）生成堆叠图像。</li>
	<li>使用套索工具勾勒细胞轮廓，确保包含整个细胞，同时尽量减少细胞外区域的选取。</li>
	<li>测量以下参数：“面积、积分密度”和“平均灰度值”。通过“分析”菜单中的“设置测量”功能选择这些参数。 
	注意：总密度（Integrated Density）表示所选区域内所有像素强度的总和，平均灰度值（Mean Gray Value）表示[总密度/面积]，用于校正细胞大小对强度值的影响。</li>
	<li>打开位于“分析”菜单下“工具”子菜单中的“ROI管理器”。在ROI管理器窗口中，点击“添加”按钮，将高亮区域作为新的感兴趣区域（ROI）输入。</li>
	<li>重复步骤 5.4 至 5.6，对图像中其余细胞进行操作。根据明场/DIC 和荧光观察结果排除任何死亡细胞（死亡细胞在 DIC 图像中呈现较暗形态，且在 GFP 激发/发射条件下可见自发荧光的细胞质信号；参见 图 2F），以及所有与图像边缘接触的细胞。在“ROI Manager”窗口中，点击“More”按钮，将选定的感兴趣区域（ROI）保存为.zip文件，并将所有测量数据导出至电子表格或统计分析软件。</li>
	<li>对于动力学实验的定量分析（方案3），按照步骤5.4和5.5所述，从初始时间点勾画并测量一个细胞。在该实验中所有后续时间点的测量均使用相同的感兴趣区域（ROI）。</li>
	<li>对于终点检测实验（方案2和4），每种条件下至少测量30–50个细胞。每组至少分析2–3张图像，并将每张图像中符合步骤5.8所述标准的所有细胞纳入分析。</li>
	<li>使用单因素方差分析（one-way ANOVA）评估样本间的统计学显著性，随后进行Tukey多重比较检验 事后检验 分析。</li>
</ol>
6. 通过流式细胞术对 Mup1-pHluorin 内吞作用进行群体分析
<ol>
	<li>挑取2-3个酵母菌落（每个菌落直径约2 mm），接种于0.5 ml缺乏甲硫氨酸及其他用于维持质粒筛选的氨基酸或营养成分的YNB培养基中。将细胞置于5 ml圆底试管中，在30 °C下于旋转滚筒上培养16-24小时。</li>
	<li>向其中加入1.5 ml缺乏甲硫氨酸及其他用于质粒维持的氨基酸或营养成分的YNB培养基，并在30 °C下于旋转滚筒上继续培养3小时。</li>
	<li>将1 ml细胞悬液分别转移至两个5 ml圆底试管中。向第一个试管中加入0.25 ml YNB -Met培养基（-Met条件），向第二个试管中加入0.25 ml含有100 µg/ml甲硫氨酸的YNB培养基，使最终甲硫氨酸浓度为20 µg/ml（+Met条件）。将细胞在30 °C下于旋转滚筒上孵育45分钟。</li>
	<li>通过流式细胞术分析细胞，以前向散射光（FS）作为细胞大小的指标，以异硫氰酸荧光素（FITC）滤光片检测的Mup1-pHluorin荧光强度作为货物内化程度的指标。</li>
	<li>使用滑动按钮调节FS和FITC通道的电压，以优化针对所用酵母细胞大小范围和荧光强度的检测效果（本实验中FS设为50 V，FITC设为400 V）。 
	注意：两个通道的电压设置取决于所使用的流式细胞仪。此步骤应在添加甲硫氨酸处理的45分钟内（步骤6.3）之前或同时完成。</li>
	<li>在高流速设置下，分别测定每种条件下10,000个细胞的FS和荧光强度。生成FS与荧光强度的散点图：点击“添加图表”，选择FITC为x轴，FS为y轴，绘制1,000个数据点（软件将显示1,000个细胞的数据，即使实际测量了10,000个细胞）。 
	注意：为获得最大一致性，应在添加甲硫氨酸后45-50分钟内进行细胞分析；对于涉及大量样本的实验，应分批加入甲硫氨酸，以适应流式细胞术分析所需的时间。</li>
	<li>将野生型（WT）细胞的-Met和+Met条件作为对照。使用门控功能，以WT +Met条件设定一条垂直门控线，使约5%最亮的细胞位于门控线右侧。该门控设置应应用于实验中所有其他条件。</li>
</ol>

<ol><li>Kaksonen, M., Sun, Y., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathway+for+association+of+receptors%2C+adaptors%2C+and+actin+during+endocytic+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A pathway for association of receptors, adaptors, and actin during endocytic internalization.</a> Cell. 115 (4), 475-487 (2003).</li>
<li>Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+design+for+the+clathrin-+and+actin-mediated+endocytosis+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery.</a> Cell. 123 (2), 305-320 (2005).</li>
<li>Boettner, D. R., Chi, R. J., Lemmon, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+yeast+for+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lessons from yeast for clathrin-mediated endocytosis.</a> Nat Cell Biol. 14 (1), 2-10 (2012).</li>
<li>Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High+Precision+Survey+of+the+Molecular+Dynamics+of+Mammalian+Clathrin-Mediated+Endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis.</a> PLoS Biol. 9 (3), e1000604(2011).</li>
<li>Hansen, C. G., Nichols, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+clathrin-independent+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of clathrin-independent endocytosis.</a> J Cell Sci. 122 (11), 1713-1721 (2009).</li>
<li>Sabharanjak, S., Sharma, P., Parton, R. G., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPI-anchored+proteins+are+delivered+to+recycling+endosomes+via+a+distinct+cdc42-regulated%2C+clathrin-independent+pinocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">GPI-anchored proteins are delivered to recycling endosomes via a distinct cdc42-regulated, clathrin-independent pinocytic pathway.</a> Dev Cell. 2 (4), 411-423 (2002).</li>
<li>Radhakrishna, H., Klausner, R. D., Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aluminum+fluoride+stimulates+surface+protrusions+in+cells+overexpressing+the+ARF6+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Aluminum fluoride stimulates surface protrusions in cells overexpressing the ARF6 GTPase.</a> J Cell Biol. 134 (4), 935-947 (1996).</li>
<li>Prosser, D. C., Drivas, T. G., Maldonado-Báez, L., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Existence+of+a+novel+clathrin-independent+endocytic+pathway+in+yeast+that+depends+on+Rho1+and+formin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Existence of a novel clathrin-independent endocytic pathway in yeast that depends on Rho1 and formin.</a> J Cell Biol. 195 (4), 657-671 (2011).</li>
<li>Prosser, D. C., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+roles+for+yeast+Rho1+and+mammalian+RhoA+GTPases+in+clathrin-independent+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Small+GTPases%22%5BJournal%5D)">Conserved roles for yeast Rho1 and mammalian RhoA GTPases in clathrin-independent endocytosis.</a> Small GTPases. 3 (4), 229-235 (2012).</li>
<li>Kohno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bni1p+implicated+in+cytoskeletal+control+is+a+putative+target+of+Rho1p+small+GTP+binding+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Bni1p implicated in cytoskeletal control is a putative target of Rho1p small GTP binding protein in Saccharomyces cerevisiae.</a> EMBO J. 15 (22), 6060-6068 (1996).</li>
<li>Evangelista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Yeast+Formin+Linking+Cdc42p+and+the+Actin+Cytoskeleton+During+Polarized+Morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">a Yeast Formin Linking Cdc42p and the Actin Cytoskeleton During Polarized Morphogenesis.</a> Science. 276 (5309), 118-122 (1997).</li>
<li>Kübler, E., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+fimbrin+are+required+for+the+internalization+step+of+endocytosis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Actin and fimbrin are required for the internalization step of endocytosis in yeast.</a> EMBO J. 12 (7), 2855-2862 (1993).</li>
<li>Lin, C. H., MacGurn, J. A., Chu, T., Stefan, C. J., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin-Related+Ubiquitin-Ligase+Adaptors+Regulate+Endocytosis+and+Protein+Turnover+at+the+Cell+Surface%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Arrestin-Related Ubiquitin-Ligase Adaptors Regulate Endocytosis and Protein Turnover at the Cell Surface.</a> Cell. 135 (4), 714-725 (2008).</li>
<li>Nikko, E., Sullivan, J. A., Pelham, H. R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin-like+proteins+mediate+ubiquitination+and+endocytosis+of+the+yeast+metal+transporter+Smf1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Arrestin-like proteins mediate ubiquitination and endocytosis of the yeast metal transporter Smf1.</a> EMBO Rep. 9 (12), 1216-1221 (2008).</li>
<li>Nikko, E., Pelham, H. R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin-Mediated+Endocytosis+of+Yeast+Plasma+Membrane+Transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Arrestin-Mediated Endocytosis of Yeast Plasma Membrane Transporters.</a> Traffic. 10 (12), 1856-1867 (2009).</li>
<li>O'Donnell, A. F., McCartney, R. R., Chandrashekarappa, D. G., Zhang, B. B., Thorner, J., Schmidt, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Deoxyglucose+impairs+Saccharomyces+cerevisiae+growth+by+stimulating+Snf1-regulated+and+%CE%B1-arrestin-mediated+trafficking+of+hexose+transporters+1+and+3%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">2-Deoxyglucose impairs Saccharomyces cerevisiae growth by stimulating Snf1-regulated and α-arrestin-mediated trafficking of hexose transporters 1 and 3.</a> Mol Cell Biol. 35 (6), 939-955 (2015).</li>
<li>O'Donnell, A. F., Huang, L., Thorner, J., Cyert, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+calcineurin-dependent+switch+controls+the+trafficking+function+of+%CE%B1-arrestin+Aly1%2FArt6%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A calcineurin-dependent switch controls the trafficking function of α-arrestin Aly1/Art6.</a> J Biol Chem. 288 (33), 24063-24080 (2013).</li>
<li>Prosser, D. C., Pannunzio, A. E., Brodsky, J. L., Thorner, J., Wendland, B., O'Donnell, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-Arrestins+participate+in+cargo+selection+for+both+clathrin-independent+and+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">α-Arrestins participate in cargo selection for both clathrin-independent and clathrin-mediated endocytosis.</a> J Cell Sci. 128 (22), 4220-4234 (2015).</li>
<li>Lamaze, C., Dujeancourt, A., Baba, T., Lo, C. G., Benmerah, A., Dautry-Varsat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+2+receptors+and+detergent-resistant+membrane+domains+define+a+clathrin-independent+endocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Interleukin 2 receptors and detergent-resistant membrane domains define a clathrin-independent endocytic pathway.</a> Mol Cell. 7 (3), 661-671 (2001).</li>
<li>Prosser, D. C., Whitworth, K., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+endocytosis+with+cytoplasmic+pHluorin+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of endocytosis with cytoplasmic pHluorin chimeras.</a> Traffic. 11 (9), 1141-1150 (2010).</li>
<li>Bokman, S. H., Ward, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renaturation+of+green-fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Renaturation of green-fluorescent protein.</a> Biochem Biophys Res Commun. 101 (4), 1372-1380 (1981).</li>
<li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+pHluorins+for+Optical+Measurements+of+Presynaptic+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity.</a> Biophys J. 79 (4), 2199-2208 (2000).</li>
<li>Katzmann, D. J., Babst, M., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-dependent+sorting+into+the+multivesicular+body+pathway+requires+the+function+of+a+conserved+endosomal+protein+sorting+complex%5BTitle%5D)+AND+%22ESCRT-I.+Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-dependent sorting into the multivesicular body pathway requires the function of a conserved endosomal protein sorting complex.</a> ESCRT-I. Cell. 106 (2), 145-155 (2001).</li>
<li>Longtine, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additional+modules+for+versatile+and+economical+PCR-based+gene+deletion+and+modification+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).</li>
<li>Goldstein, A. L., McCusker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+new+dominant+drug+resistance+cassettes+for+gene+disruption+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 15 (14), 1541-1553 (1999).</li>
<li>Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Curr+Prot+Mol+Biol%22">Curr Prot Mol Biol</a>. , John Wiley & Sons. New York. (1991).</li>
<li>Urbanowski, J. L., Piper, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+sorts+proteins+into+the+intralumenal+degradative+compartment+of+the+late-endosome%2Fvacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin sorts proteins into the intralumenal degradative compartment of the late-endosome/vacuole.</a> Traffic. 2 (9), 622-630 (2001).</li>
<li>Newpher, T. M., Smith, R. P., Lemmon, V., Lemmon, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Dynamics+of+Clathrin+and+Its+Adaptor-Dependent+Recruitment+to+the+Actin-Based+Endocytic+Machinery+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">In Vivo Dynamics of Clathrin and Its Adaptor-Dependent Recruitment to the Actin-Based Endocytic Machinery in Yeast.</a> Dev Cell. 9 (1), 87-98 (2005).</li>
<li>Maldonado-Báez, L., Dores, M. R., Perkins, E. M., Drivas, T. G., Hicke, L., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+Epsin%2FYap180+adaptors+and+the+scaffolds+Ede1%2FPan1+is+required+for+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Interaction between Epsin/Yap180 adaptors and the scaffolds Ede1/Pan1 is required for endocytosis.</a> Mol Biol Cell. 19 (7), 2936-2948 (2008).</li>
<li>Aguilar, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epsin+N-terminal+homology+domains+perform+an+essential+function+regulating+Cdc42+through+binding+Cdc42+GTPase-activating+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Epsin N-terminal homology domains perform an essential function regulating Cdc42 through binding Cdc42 GTPase-activating proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (11), 4116-4121 (2006).</li>
<li>Isnard, A. D., Thomas, D., Surdin-Kerjan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+study+of+methionine+uptake+in+Saccharomyces+cerevisiae+reveals+a+new+family+of+amino+acid+permeases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The study of methionine uptake in Saccharomyces cerevisiae reveals a new family of amino acid permeases.</a> J Mol Biol. 262 (4), 473-484 (1996).</li>
<li>Wendland, B., McCaffery, J. M., Xiao, Q., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fluorescence-activated+cell+sorter-based+screen+for+yeast+endocytosis+mutants+identifies+a+yeast+homologue+of+mammalian+eps15%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel fluorescence-activated cell sorter-based screen for yeast endocytosis mutants identifies a yeast homologue of mammalian eps15.</a> J Cell Biol. 135 (6), 1485-1500 (1996).</li>
<li>Alvaro, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+Alpha-Arrestins+Negatively+Regulate+Saccharomyces+cerevisiae+Pheromone+Response+by+Down-Modulating+the+G-Protein-Coupled+Receptor+Ste2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific Alpha-Arrestins Negatively Regulate Saccharomyces cerevisiae Pheromone Response by Down-Modulating the G-Protein-Coupled Receptor Ste2.</a> Mol Cell Biol. 34 (14), 2660-2681 (2014).</li>
<li>Ghaddar, K., Merhi, A., Saliba, E., Krammer, E. M., Prevost, M., Andre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-Induced+Ubiquitylation+and+Endocytosis+of+Yeast+Amino+Acid+Permeases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Substrate-Induced Ubiquitylation and Endocytosis of Yeast Amino Acid Permeases.</a> Mol Cell Biol. 34 (24), 4447-4463 (2014).</li>
<li>Becuwe, M., Léon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+control+of+transporter+endocytosis+and+recycling+by+the+arrestin-related+protein+Rod1+and+the+ubiquitin+ligase+Rsp5%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Integrated control of transporter endocytosis and recycling by the arrestin-related protein Rod1 and the ubiquitin ligase Rsp5.</a> eLife. 3, (2014).</li>
<li>Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Zhao, Y., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Endosomal+Sorting+Complex+ESCRT-II+Mediates+the+Assembly+and+Architecture+of+ESCRT-III+Helices%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Endosomal Sorting Complex ESCRT-II Mediates the Assembly and Architecture of ESCRT-III Helices.</a> Cell. 151 (2), 356-371 (2012).</li>
<li>Nickerson, D. P., Russell, M. R. G., Lo, S. -Y., Chapin, H. C., Milnes, J. M., Merz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Termination+of+Isoform-Selective+Vps21%2FRab5+Signaling+at+Endolysosomal+Organelles+by+Msb3%2FGyp3%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Termination of Isoform-Selective Vps21/Rab5 Signaling at Endolysosomal Organelles by Msb3/Gyp3.</a> Traffic. 13 (10), 1411-1428 (2012).</li>
<li>Nickerson, D. P., Merz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LUCID%3A+A+Quantitative+Assay+of+ESCRT-Mediated+Cargo+Sorting+into+Multivesicular+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">LUCID: A Quantitative Assay of ESCRT-Mediated Cargo Sorting into Multivesicular Bodies.</a> Traffic. 16 (12), 1318-1329 (2015).</li>
<li>Dulic, V., Egerton, M., Elguindi, I., Raths, S., Singer, B., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+endocytosis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Yeast endocytosis assays.</a> Methods Enzymol. 194, 697-710 (1991).</li>
<li>Silve, S., Volland, C., Garnier, C., Jund, R., Chevallier, M. R., Haguenauer-Tsapis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+insertion+of+uracil+permease%2C+a+polytopic+yeast+plasma+membrane+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane insertion of uracil permease, a polytopic yeast plasma membrane protein.</a> Mol Cell Biol. 11 (2), 1114-1124 (1991).</li>
<li>Miliaras, N. B., Park, J. -H., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Function+of+the+Endocytic+Scaffold+Protein+Pan1p+Depends+on+Multiple+Domains%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The Function of the Endocytic Scaffold Protein Pan1p Depends on Multiple Domains.</a> Traffic. 5 (12), 963-978 (2004).</li>
<li>Vida, T. A., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+vital+stain+for+visualizing+vacuolar+membrane+dynamics+and+endocytosis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast.</a> J Cell Biol. 128 (5), 779-792 (1995).</li>
<li>Toshima, J. Y., Toshima, J., Kaksonen, M., Martin, A. C., King, D. S., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+dynamics+of+receptor-mediated+endocytic+trafficking+in+budding+yeast+revealed+by+using+fluorescent+alpha-factor+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Spatial dynamics of receptor-mediated endocytic trafficking in budding yeast revealed by using fluorescent alpha-factor derivatives.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (15), 5793-5798 (2006).</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

利用pHluorin对酵母细胞中内吞事件进行定量分析时，通常使用跨膜运输蛋白作为货物分子，其中荧光标签与蛋白的胞质端尾部融合（图1A）。在本文所述的检测中，当pHluorin标签暴露于中性环境时，货物分子具有强荧光信号；而当其进入酸性环境时，荧光则被淬灭。因此，带有pHluorin标签的内吞货物在质膜的胞质侧以及早期内体上易于被检测到，但一旦被整合至多泡体（MVB）腔内小泡或递送至液泡腔内，荧光即变为&#34;弱信号&#34;。通常情况下，新合成的内吞货物可能在GFP及其多数变体尚未完全成熟之前，便已离开内质网（ER）并抵达质膜；因此，尚未到达细胞表面的pHluorin标记货物预计无法被检测到，除非其从内质网或高尔基体的输出过程受到阻碍。
使用 pHluorin 标记的内吞货物（如 Ste3 和 Mup1）已促进了对酵母 CIE 通路中多种相关蛋白的鉴定与表征（图 1B）8,18。具体而言，本文所述方法已被用于证明：在多种具有网格蛋白介导内吞（CME）缺陷的酵母突变体中，肌动蛋白调控 GTP ...

囊泡运输在维持真核细胞细胞器的身份和功能方面起着重要作用，同时也是调控各个细胞区室中蛋白质和膜组成的关键机制。在质膜上，分泌囊泡的融合将新的蛋白质和膜运送至细胞表面，而通过内吞作用形成的囊泡则从细胞表面移除膜和蛋白质，随后进行再循环或靶向输送至溶酶体。因此，内吞作用对于营养物质的摄取以及对外部环境的响应具有重要意义。胞吐作用与内吞作用相互平衡，以调控质膜的表面积，并实现受损蛋白质的更新替换。
在酵母和哺乳动物细胞中的研究已鉴定出大量参与内吞作用的蛋白质，以及多种促进特定货物分子内化或响应不同环境条件的内吞途径。其中研究最为深入的是网格蛋白介导的内吞作用（CME），在该过程中，网格蛋白与胞质辅助蛋白组装成包被结构，以稳定新生的内吞囊泡。对出芽酵母Saccharomyces cerevisiae进行的实验，揭示了许多内吞相关蛋白质招募的动态过程及其顺序1-3。值得注意的是，CME机制在进化过程中高度保守，酵母中大多数与CME相关的蛋白质在人类中均有同源物；因此，出芽酵母已成为理解高等真核生物中保守的内吞机制的重要工具。例如，利用出芽酵母的研究发现，CME结构（在酵母中称为皮层肌动蛋白斑块）的形成与成熟涉及多种蛋白质的有序招募：首先招募网格蛋白及结合货物的衔接蛋白，随后招募其他内吞辅助蛋白，激活Arp2/3介导的肌动蛋白聚合，并进一步招募参与囊泡断裂的蛋白质1,2。CME机器各组分向皮层肌动蛋白斑块的招募是一个高度有序且具有典型模式的过程，许多蛋白质的招募顺序已相对于CME机器其他组分被明确界定。重要的是，近期研究已证实，在哺乳动物细胞的网格蛋白包被小窝中，CME相关蛋白质的招募顺序也具有相似性4。
除了网格蛋白介导的内吞作用（CME）外，许多细胞类型还拥有一种或多种不依赖网格蛋白的内吞（CIE）途径，这些途径依赖于其他机制来促进从质膜形成和内化囊泡5-7。在酵母中，我们最近发现了一条利用小GTP酶Rho1及其激活的鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）Rom1的CIE途径8,9。Rho1可激活成束蛋白Bni1，促进肌动蛋白聚合10,11，而这一过程是酵母中此类不依赖网格蛋白的内吞所必需的12。此外，α-抑制蛋白家族蛋白可招募泛素连接酶Rsp5，促进货物蛋白的泛素化及随后通过CME途径的内化13-17，同时也可通过CIE途径促进货物蛋白的内化，可能通过与参与CIE的蛋白直接相互作用实现18。在哺乳动物细胞中也存在多种CIE途径，包括依赖Rho1同源物RhoA的不依赖网格蛋白及吞噬性内吞途径9,19。RhoA在哺乳动物CIE中的作用尚不明确；因此，对酿酒酵母的研究可能为哺乳动物CIE提供进一步的机制性见解。
准确量化内吞事件可提供有关特定蛋白质在调控内吞作用中功能的重要信息，并能揭示突变对货物分子内化或沿内吞途径转运的影响。为此，可采用生物化学方法来监测配体的摄取，或测量内吞货物蛋白的降解速率。在活细胞中，将绿色荧光蛋白（GFP）及其变体与目标货物分子融合，可直接观察货物的转运过程。然而，由于GFP在溶酶体（或酵母中的液泡）中具有抗降解性，因此GFP标记的货物分子在内吞作用的定量分析中应用受限。此外，GFP荧光对pH变化仅有部分敏感性，在液泡腔内仍可被检测到20,21。因此，在货物其余部分已被降解后，GFP标签的荧光仍会在液泡中持续存在，导致基于全细胞的货物强度定量可能因液泡中长期存在的GFP荧光而不准确。
为了克服液泡中GFP荧光的局限性，我们此前采用了超 ecliptic pHluorin（superecliptic pHluorin），这是一种对pH敏感的GFP变体，在中性pH条件下具有强烈荧光，但在酸性环境（如液泡/溶酶体腔）中荧光会消失20,22,23。将pHluorin标签置于内吞货物蛋白的胞质尾部，可在质膜和早期内体上观察到这些货物蛋白，此时pHluorin标签仍暴露于胞质中（图1A）。随着早期内体成熟，运输所需的内体分选复合物（ESCRT）机制会将定位于膜表面的货物蛋白包裹进向内出芽形成的囊泡中，从而生成多泡体（MVBs）24。对于已被整合进MVB内部囊泡的货物蛋白，其pHluorin标签朝向囊泡腔内。MVB内部囊泡呈酸性环境，因此当早期内体成熟为MVB时，带有pHluorin标签的货物蛋白荧光随之淬灭20。随后MVB与液泡融合，将其腔内内容物递送至降解途径，而pHluorin标签在液泡腔的酸性环境中持续保持淬灭状态。
本文详细描述了利用带有细胞质pHluorin标签的货物蛋白在酵母中进行的定量胞吞实验。表达pHluorin标记货物蛋白的菌株可根据特定货物蛋白的性质和运输行为，用于动力学和/或终点实验。此外，某些pHluorin标记的货物蛋白适用于高通量分析方法，包括流式细胞术。重要的是，pHluorin标签是一种研究活细胞中胞吞事件的多功能工具，可实现对胞吞作用的定量，并可用于比较野生型和突变型菌株之间的胞吞功能。

<table><tbody><tr><td>腺嘌呤</td><td>Sigma</td><td>A8626-25G</td><td>用于氨基酸混合物和储备液的配制</td></tr><tr><td>细菌琼脂</td><td>Fisher</td><td>BP1423-2</td><td>用于平板培养基的配制</td></tr><tr><td>BD Difco 酵母氮源基础（不含氨基酸）</td><td>BD</td><td>291920</td><td>用于液体和平板培养基的配制</td></tr><tr><td>刀豆蛋白A</td><td>Sigma</td><td>C5275-5MG</td><td>用于腔室载玻片的包被</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Fisher</td><td>BP350-1</td><td>用于液体和平板培养基的配制</td></tr><tr><td>L-组氨酸</td><td>Fisher</td><td>BP382-100</td><td>用于氨基酸混合物和储备液的配制</td></tr><tr><td>L-亮氨酸</td><td>Acros</td><td>125121000</td><td>用于氨基酸混合物和储备液的配制</td></tr><tr><td>L-赖氨酸</td><td>Fisher</td><td>BP386-100</td><td>用于氨基酸混合物和储备液的配制</td></tr><tr><td>L-甲硫氨酸</td><td>Fisher</td><td>BP388-100</td><td>用于氨基酸混合物和储备液的配制</td></tr><tr><td>L-色氨酸</td><td>Fisher</td><td>BP395-100</td><td>用于氨基酸混合物和储备液的配制</td></tr><tr><td>L-酪氨酸</td><td>Acros</td><td>140641000</td><td>用于氨基酸混合物的配制</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek 八孔腔室盖玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>155411</td><td>用于Mup1-pHluorin内吞动力学及终点检测</td></tr><tr><td>尿嘧啶</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>用于氨基酸混合物和储备液的配制</td></tr><tr><td>Axiovert 200 倒置显微镜</td><td>Carl Zeiss</td><td>Custom Build</td><td></td></tr><tr><td>100X/1.4 Plan-Apochromat 油浸物镜</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>物镜应为100X，数值孔径1.4或更高</td></tr><tr><td>Sensicam</td><td>Cooke Corporation</td><td></td><td>相机应具有12位或更高的动态范围</td></tr><tr><td>X-Cite 120PC Q 光源系统</td><td>Excelitas Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 5 软件</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr></tbody></table>

phluorin在芽殖酵母内吞作用的定量、动力学及高通量分析中的应用

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

绿色荧光蛋白（GFP）及其变体是研究活细胞中蛋白质定位以及细胞骨架重塑、囊泡运输等动态过程的常用工具。针对多种应用已开发出利用GFP融合蛋白的定量方法；然而，GFP对蛋白水解具有一定的抗性，因此其荧光在溶酶体/液泡中仍可持续存在，这可能干扰对内吞途径中货物运输的定量分析。一种用于量化内吞作用及内吞后运输事件的替代方法利用了超灵敏pHluorin（superecliptic pHluorin），这是一种对pH敏感的GFP变体，在酸性环境中荧光会被淬灭。将pHluorin与跨膜货物蛋白的胞质端融合形成嵌合蛋白，当货物被纳入多泡体（MVBs）并运送至溶酶体/液泡腔时，其荧光信号随之减弱。因此，液泡荧光的淬灭有助于对内吞作用及内吞途径早期事件进行定量分析。本文介绍了利用pHluorin标记的货物蛋白，通过荧光显微镜进行内吞作用定量的方法，以及基于群体分析的流式细胞术检测方法。

稳态下组成型内吞的胞吞作用货物蛋白 Ste3 的定位与定量
为了证明pHluorin标记的货物蛋白可用于活细胞中内吞作用的定量分析，本文比较了嵌合型GFP和pHluorin与酵母a因子信息素受体Ste3的胞质C端尾部融合蛋白的定位情况。Ste3是一种G蛋白偶联受体（GPCR），会持续转运至质膜，随后被内吞并靶向液泡进行降解28。因此，在稳态条件下，大多数Ste3定位于液泡腔内，如表达Ste3-GFP的野生型（WT）细胞所示（图2A）。相比之下，缺失编码四种网格蛋白结合衔接蛋白Ent1、Ent2、Yap1801和Yap1802基因的细胞（ent1Δ ent2Δ yap1801Δ yap1802Δ，以下简称4Δ）无法在内吞位点稳定网格蛋白29，在网格蛋白介导的内吞作用（CME...

准确量化囊泡运输事件通常可为特定蛋白质的功能及突变效应提供关键见解。本文介绍了利用对pH敏感的GFP变体——超 ecliptic pHluorin，结合定量荧光显微镜和流式细胞术，在活细胞中定量内吞事件的方法。

pHluorin在芽殖酵母内吞作用的定量、动力学及高通量分析中的应用

绿色荧光蛋白（GFP）及其变体是研究蛋白质定位和细胞骨架等事件动态过程的常用工具...

本实验的总体目标是定量分析活细胞内吞途径中的囊泡运输事件。该方法有助于回答囊泡运输领域中的关键问题，例如基因突变或蛋白表达水平变化如何影响运输事件的速率和效率。该技术的主要优势在于，可通过检测荧光标记的货物蛋白的荧光强度，实现对活细胞内吞运输过程的直接定量分析。根据文本方案配制溶液和培养基后，取两到三个酵母菌落接种于5毫升YNB培养基中，该培养基不含有用于维持质粒筛选的额外营养成分。将培养物在30摄氏度条件下振荡培养16至24小时。成像前约3小时，测定各过夜培养物在600 nm处的光密度（OD 600）。然后在缺乏质粒维持所需额外营养的 YNB 培养基中，制备 5 毫升、OD600 为 0.35 至 0.4 的稀释菌液，并在 30 摄氏度下振荡培养 3 小时。在孵育期间，预先将显微镜的环境培养室或加热载台平衡至 30 摄氏度。根据文本方案准备经处理的八孔玻璃底培养板及腔室载玻片用于成像后，向每孔加入 200 微升缺乏质粒筛选所需额外营养的 YNB 培养基。当培养物准备就绪后，取一毫升转移至微量离心管中，在8,000 RPM条件下离心两分钟以收集细胞沉淀。随后移除975微升上清液。用剩余的上清液重悬细胞沉淀。然后将2.5 µL细胞悬液滴加到八孔板每个孔的中央。用移液器轻轻吹打混匀以分散细胞，静置5至10分钟使细胞沉降。将培养腔室载玻片置于已平衡至30°C的倒置荧光显微镜上。然后，使用明场照明定位一片细胞。向孔中200微升的培养基加入50微升预热的YNB培养基，其中含有100微克/毫升的甲硫氨酸，使最终甲硫氨酸浓度为20微克/毫升。在开始成像前，让细胞平衡2分钟。然后在成像前立即调整显微镜至所需的焦平面。以5分钟为间隔，采集45至60分钟内的GFP荧光、明场或微分干涉相差（DIC）图像。同一时间序列中的所有图像须采用相同的采集参数。有关更多详细信息，请参阅文字版实验方案。量化每个时间点单个细胞的荧光强度，并将数值表示为第一张图像初始强度的百分比。在根据文字版实验方案在 ImageJ 中导出图像后，使用“文件”菜单中的“打开”选项打开文件。使用荧光图像进行定量分析，并利用明场或微分干涉差（DIC）图像作为参考以确定细胞位置。在DIC下观察时，死亡细胞比活细胞更暗，且在GFP通道下表现出自发荧光，若存在此类细胞应予以排除。对于背景不均匀的图像，在“Process”菜单中选择背景减除算法，并采用默认设置。获取图像后，在进行定量分析之前，必须执行背景扣除。此步骤尤为重要，因为背景信号可能掩盖或减弱样本间的差异。使用自由选择工具勾勒出一个细胞，确保包含整个细胞，同时尽可能减少细胞外区域的选中范围。然后在“分析”菜单下，使用“设置测量”功能来测量面积、积分密度和平均灰度值。通过点击“分析”，然后选择“工具”，打开 ROI 管理器。在 ROI 管理器窗口中，点击“添加”按钮，将高亮区域作为新的感兴趣区域（ROI）输入。对图像中其余细胞重复上述轮廓勾画和测量操作，排除任何已死亡的细胞或与图像边缘接触的细胞。单击“measure”按钮，将选定的感兴趣区域（ROIs）保存为压缩文件，该操作将在新窗口中显示测量值。然后单击“more”按钮，将所有测量数据导出至电子表格或统计分析软件中。接种两到三个酵母菌落及0.5毫升缺乏维持质粒筛选所需额外营养成分的YNB培养基。将细胞置于30摄氏度的旋转滚筒中培养16至24小时。加入1毫升缺乏质粒维持所需额外营养成分的YNB培养基，继续培养额外3小时。接下来，将一毫升细胞转移至两个五毫升圆底试管中。然后向第一个试管中加入0.25毫升YNB Met培养基，向第二个试管中加入0.25毫升含有100微克/毫升甲硫氨酸的YNB培养基，使最终浓度为20微克/毫升。对于大量样本，可错开添加甲硫氨酸的时间，以便为事实分析留出足够时间。我们的流式细胞仪每次运行最多可检测40个样本。我们分批加入甲硫氨酸，每5分钟加入8个样本。这确保所有样品均在添加甲硫氨酸后45至50分钟内完成测量。将细胞孵育45分钟，随后通过流式细胞术分析细胞，以前向散射（FS）作为细胞大小的指标，并选取FITC滤光片检测的荧光强度作为货物内化程度的指标。在45分钟孵育期间，使用滑块按钮调节FS和FITC通道的电压，以优化适用于所用酵母细胞大小范围和荧光强度的检测效果。从每种条件下采集10,000个细胞的FS和荧光强度数据。使用高流速设置，点击“添加图表”生成FS与荧光强度的散点图。然后选择 FITC 作为横轴，FS 作为纵轴，并绘制 1000 个数据点。利用门控功能和野生型 Met 条件，设置一个垂直门控，使约 5% 最亮的细胞位于门控右侧。该门控设置应应用于实验中所有其他条件。如图所示，在无甲硫氨酸或有甲硫氨酸的条件下，以每5分钟一次的时间间隔对细胞进行延时成像，以监测GFP或氟标记的Mup1的内化过程及其荧光信号的变化。预期结果表明，在无甲硫氨酸时，GFP和氟标记的Mup1保留在质膜上。相比之下，在有甲硫氨酸条件下成像的细胞中，细胞表面的荧光信号逐渐减弱，与货物蛋白的内化过程一致。然而，在添加甲硫氨酸的情况下，Mup1-GFP细胞的荧光丢失动力学相较于pHlourin-Mup1细胞有所延迟。这些散点图比较了野生型或四种ΔENTH1细胞在有或无甲硫氨酸处理并施加垂直门控后的荧光强度。在门控右侧（对应于群体中最亮的细胞）中，仅有4%的野生型Met处理细胞位于该区域，而65%的未处理野生型细胞位于门控内。相比之下，四种 delta ENTH1 细胞在亮细胞与暗细胞的分布上无差异，这与内吞作用缺陷一致。一旦掌握，若操作得当，该技术可在三到四小时内完成。在进行该实验时，重要的是要记住错开同时进行的实验起始时间，以便所有样本在相同处理时间后收集终点数据。采用此方法后，还可进行其他实验，例如花卉遗传筛选，以回答更多问题，如哪些新因子参与了囊泡运输。该技术建立后，为囊泡运输领域的研究人员探索内体损耗机制以及芽殖酵母中一种新发现的、不依赖网格蛋白且依赖酸性的运输途径铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用弗洛瑞特型（florent-type）货物蛋白在活细胞中定量内吞事件。

applications-phluorin-for-quantitative-kinetic-high-throughput

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

pHluorin的申请在芽殖酵母细胞内吞的定量，动力学和高通量分析

基因删除和蛋白质过表达是研究蛋白质功能的常用方法。本文中，我们描述了一种在群体水平和单细胞水平上分析酿酒酵母（Saccharomyces...

酿酒酵母中蛋白质浓度依赖的形态表型发育分析

裂殖酵母的定量活细胞荧光显微镜分析

我们提供了一种简单的实验方案，用于获取酵母细胞生长过程的荧光显微镜视频，以及一个基于图形用户界面的软件包，用于提取单细胞时间序列数据。该分析方法结合了自动化的谱系追踪与分裂时间分配，并整合了可视化检查及对追踪数据的手动校正。...

获取芽殖酵母荧光延时成像并利用GRAFTS分析单细胞动态

本文介绍了基于流式细胞术和显微镜技术的两种互补方法，可在单细胞水平上定量分析酵母中由MAPK通路激活所诱导的基因表达动态变化。...

单个酵母细胞中MAPK诱导表达的时间定量分析

本文介绍了一种利用荧光测定法定量分析贴壁巨噬细胞系吞噬荧光颗粒的实验方案。该方法可实现对颗粒内化及伴随发生的肌动蛋白聚合的高通量定量分析。...

高通量荧光测定法评估巨噬细胞吞噬作用与肌动蛋白聚合

利用对pH敏感的荧光蛋白——超 ecliptic...

利用pHluorin标记的受体监测亚细胞定位与转运

芽殖酵母是研究微管动态的有利模型 体内 由于其强大的遗传学特性和微管细胞骨架的简单性。以下实验方案描述了如何转化和培养酵母细胞，获取共聚焦显微镜图像，以及在活体酵母细胞中对微管动态进行定量分析。...

高分辨率成像与分析酿酒酵母中单个星体微管的动力学行为

该单分子荧光原位杂交实验方案经过优化，可用于定量营养生长和减数分裂期间芽殖酵母中的RNA分子数量。...

单分子荧光 原位 芽殖酵母营养生长与减数分裂过程中的杂交（smFISH）分析

胞葬作用（efferocytosis）是指吞噬细胞清除凋亡细胞的过程，对于维持机体稳态至关重要，该过程依赖于一系列受体和信号通路，以实现对凋亡细胞的识别、吞噬和内化。本文介绍了一种利用荧光显微镜定量分析胞葬作用及其相关信号通路活性的实验方案。...

通过单细胞荧光显微镜定量测定胞葬作用

此处使用裂殖酵母作为异源宿主，表达与GFP构成融合蛋白的细菌细胞骨架蛋白（如FtsZ和MreB），以观察其聚合行为。同时，通过荧光显微镜成像鉴定影响这些蛋白聚合的化合物。...

以裂殖酵母作为靶向细菌细胞骨架蛋白的抗菌药物筛选平台

本方案详细介绍了两种酵母细胞周期阻滞及可选释放的方法，并阐述了如何利用荧光显微镜研究酿酒酵母（S.

芽殖酵母中细胞周期依赖性过程的操作与分析

学习利用超折叠pHluorin荧光蛋白和流式细胞术定量分析芽殖酵母细胞内吞途径中的囊泡运输事件。该方法可直接测量荧光标记货物的强度变化，为研究蛋白质突变对运输效率的影响提供高通量分析工具。

pHluorin在芽殖酵母内吞作用的定量、动力学及高通量分析中的应用

探索更多视频