pHluorin的申请在芽殖酵母细胞内吞的定量，动力学和高通量分析
2016年10月23日
囊泡运输事件的准确定量通常为特定蛋白质的作用和突变的影响提供关键见解。本文介绍了使用超黄道 pHluorin（一种 pH 敏感的 GFP 变体）作为使用定量荧光显微镜和流式细胞术定量活细胞中内吞事件的工具的方法。
该程序的总体目标是量化活细胞内吞途径中的囊泡运输事件。这种方法可以帮助回答囊泡运输领域的关键问题，例如蛋白质表达的突变或变化如何影响运输事件的速率和效率。该技术的主要优点是它允许通过测量荧光标记的货物蛋白的强度来直接定量内吞运输和活细胞。
根据文本方案制备溶液和培养基后，在 5 毫升 YNB 培养基中接种 2 至 3 个酵母细胞菌落，缺乏维持质粒选择的额外营养物质。在 30 摄氏度下振荡培养物 16 至 24 小时。成像前大约三小时，测量每个过夜培养物的 OD 600。
然后在 YNB 培养基中以 OD 600 为 0.35 至 0.4 制备 5 毫升稀释液，缺乏用于质粒维持的额外营养物质，并在 30 摄氏度下摇动生长 3 小时。在孵育过程中，将显微镜环境室或加热台预平衡至 30 摄氏度。根据文本方案准备用于成像的罐装八孔玻璃罐和腔室载玻片后，向每个孔中加入 200 微升缺乏额外营养物质的 YNB 培养基用于血浆选择。
培养物准备好后，将 1 毫升转移到微型冷藏管中，并以 8， 000 RPM 的转速沉淀细胞 2 分钟。然后去除 975 μL 的上清液。将细胞沉淀重悬于剩余的上清液中。
然后将 2.5 μL 细胞悬液滴入 8 孔板每个孔的中心。上下移液以分散细胞，让细胞静置 5 到 10 分钟。将腔室载玻片放在平衡至 30 摄氏度的倒置荧光显微镜上。
然后，使用明场照明定位细胞区域。将 50 微升预热的 YNB 培养基（每毫升含有 100 微克蛋氨酸）添加到孔中的 200 微升培养基中，以获得每毫升 20 微克的最终蛋氨酸浓度。在开始成像之前，让细胞平衡 2 分钟。
然后在成像之前，将显微镜调整到所需的焦平面。每隔 5 分钟采集明场或 DIC 图像中的 GFP，持续 45 至 60 分钟。对时间序列中的所有图像使用相同的采集参数。
有关其他详细信息，请参阅文本协议。量化每个时间点单个细胞的荧光强度，并将值表示为第一张图像初始强度的百分比。根据图像 j 中的文本协议导出图像后，使用 Open 选项在文件菜单中打开文件。
使用荧光图像进行定量，使用明场或 DIC 图像作为参考来识别细胞的位置。排除存在的死细胞，当通过 DIC 观察时，这些死细胞看起来比活细胞更暗，并且在 GFP 通道下发出自发荧光。对于 Process （处理） 菜单中背景不均匀的图像，请选择背景减法算法并选择默认设置。
采集图像后，在进行定量程序之前进行背景扣除非常重要。此步骤尤为重要，因为背景信号可能会掩盖或抑制样品之间的差异。使用手绘选择工具，勾勒出单元格的轮廓，确保包含整个单元格，但尽可能少地包含单元格外部的区域。
然后在 Analyze 菜单下，使用 set measurements 函数测量面积、积分密度和平均灰度值。通过单击 Analyze（分析），然后单击 Tools（工具）打开 ROI Manager。在 ROI Manager 窗口中，单击 Add 按钮以输入突出显示的区域作为新的 ROI。
对图像中的其余单元格重复轮廓和测量，不包括任何死单元格或接触图像边缘的单元格。通过单击测量按钮将选定的 ROI 保存为 zip 文件，该按钮将在新窗口中显示测量值。然后单击 more 按钮并将所有测量值导出到电子表格或统计分析软件。
接种 2 到 3 个酵母细胞菌落和 0.5 mLYNB 培养基，缺乏维持质粒选择的额外营养物质。在 30 摄氏度的滚筒上培养细胞 16 至 24 小时。加入 1 毫升缺乏额外营养物质的 YNB 培养基以维持质粒，并额外生长 3 小时。
接下来，将 1 毫升细胞转移到两个 5 毫升圆底管中。然后将 0.25 毫升 YNB Met 培养基添加到第一管中，将 0.25 毫升含有每毫升蛋氨酸 100 微克的 YNB 培养基添加到第二管中，最终浓度为 20 微克/毫升。对于大量样品，请错开蛋氨酸的添加时间，以便为事实分析留出时间。
我们的流式细胞仪每次运行可测量多达 40 个样品。我们分批添加蛋氨酸。每 5 分钟 8 个样品。
这可确保在添加蛋氨酸后 45 至 50 分钟之间测量所有样品。将细胞孵育 45 分钟。然后通过流式细胞术分析细胞，选择前向散射或 FS 作为细胞大小的量度，并从 FITC 滤光片绘制一个流动荧光强度作为货物内化的量度。
在 45 分钟的孵育过程中，使用滑动按钮调整 FS 和 FITC 通道的电压，以优化对所用酵母细胞的大小范围和荧光强度的检测。测量来自每种条件的 10， 000 个细胞的 FS 和荧光强度。使用高流速设置，通过单击添加图形生成 FS 与荧光强度的散点图。
然后选择 FITC 作为 x 轴，选择 FS 作为 y 轴，并绘制 1000 个点。使用门函数和野生型 Met 条件，分配一个垂直门，以便大约 5% 的最亮细胞落在门的右侧。将此门控用于实验中的所有其他条件。
如图所示，在不存在或存在蛋氨酸的情况下，每隔 5 分钟对细胞进行延时成像，以监测 GFP 或氟标记的 Mup1 内化和荧光变化。正如预期的那样，在没有蛋氨酸的情况下，GFP 和氟标记的 Mup1 保留在质膜上。相比之下，在蛋氨酸存在下成像的细胞显示细胞表面荧光信号的进行性消耗，与货物内化一致。
然而，与 pHlourin Mup1 细胞相比，Mup1 GFP 细胞在蛋氨酸存在下丢失的荧光动力学延迟。这些散点图比较了在应用垂直门后存在或不存在蛋氨酸的情况下野生型或四个 delta ENTH1 细胞的荧光强度。4% 的野生型 Met 细胞包含在门的右侧，对应于群体中最亮的细胞，而 65% 的未处理野生型细胞包含在门中。
相比之下，四个 delta ENTH1 细胞在明亮细胞与暗淡细胞的分布上没有差异，这与内吞作用缺陷一致。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在三到四个小时内完成。在尝试此过程时，重要的是要记住错开执行同时实验的开始时间，以便可以在所有样品的相同处理时间后收集终点数据。
按照这个程序，可以执行其他方法，如花遗传筛选，以回答其他问题，例如哪些新因素导致囊泡运输。开发后，该技术为囊泡运输领域的研究人员探索内体损耗的各个方面以及出芽酵母中新发现的网格蛋白非依赖性和酸性途径铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何使用 florent 型货物来量化活细胞中的内吞事件有很好的了解。
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概述
本研究提出了一种使用超椭圆pHluorin（一种pH敏感的GFP变体）来定量测量活细胞中的囊泡运输事件的方法。该技术使研究人员能够通过定量荧光显微镜和流式细胞术来研究突变和蛋白表达变化对内吞过程的影响。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 荧光显微镜
背景
- 囊泡运输对细胞功能至关重要。
- 理解运输可以揭示蛋白质作用的见解。
- 突变可能影响运输效率。
- 需要定量方法进行准确分析。
研究目的
- 定量测量活细胞中的内吞运输事件。
- 评估蛋白质突变对运输的影响。
- 提供一种研究囊泡动力学的可靠方法。
使用的方法
- 使用超椭圆pHluorin进行荧光标记。
- 定量荧光显微镜用于成像。
- 流式细胞术用于分析运输事件。
- 准备实验用酵母培养物。
主要结果
- 实现了内吞事件的直接定量。
- 该方法对蛋白表达变化表现出灵敏度。
- 提供了关于囊泡运输动力学的见解。
- 适用于各种细胞背景。
结论
- 该技术为研究囊泡运输提供了强大的工具。
- 它增强了对蛋白质在细胞过程中功能的理解。
- 未来的应用可能扩展到其他细胞类型和条件。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantifying endocytic trafficking in living cells enables mechanistic de-risking of target validation by linking protein function to vesicular dynamics. The pHluorin-based method provides predictive confidence in early discovery by directly measuring cargo internalization kinetics and efficiency. This supports go/no-go decisions in lead identification by reducing ambiguity in trafficking phenotypes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying how mutations or expression changes affect endocytic rates.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct measurement of cargo trafficking in live yeast.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing trafficking-competent from defective variants.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated pHluorin-tagged cargo systems for quantitative fluorescence and flow cytometry.
- Reproducibility: Standardizes endocytosis measurement via background-subtracted intensity tracking and gated FITC/FS analysis.
- Scalability: Supports high-throughput screening through flow cytometry capable of 40 samples per run with methionine batch addition.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses budding yeast as a disease-relevant system to model conserved endocytic mechanisms.
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation by quantifying trafficking defects in genetic mutants like four delta ENTH1.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs decisions by showing delayed fluorescence loss in trafficking-defective strains.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing quantitative trafficking data that informs lead optimization and mechanistic de-risking prior to mammalian validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring how protein perturbations alter endocytic efficiency in live cells.
- Screening: Delivers assay-ready systems with quantitative outputs compatible with flow cytometry and microscopy.
- Analytics: Generates fluorescence intensity and scatterplot data enabling statistical comparison of trafficking conditions.
- Translational Research: Connects yeast endocytic mechanisms to higher eukaryotes through conserved vesicular trafficking principles.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for trafficking analysis across genetic backgrounds and compound treatments.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by directly linking cargo fluorescence quenching to endocytic progression.
- Operational Value: Ensures standardization via identical acquisition parameters and background subtraction protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid screening of trafficking phenotypes.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization through quantifiable internalization kinetics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast culture maintenance and fluorescence microscopy.
- Needs inverted microscope with environmental chamber and flow cytometer with FITC detection.
- Demands cross-team standardization of methionine timing and gating strategies.
- Involves adaptation considerations for different cargo-pHluorin fusions and genetic backgrounds.
- Includes practical limitations such as photobleaching during long acquisitions and background fluorescence in autofluorescent strains.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:34
Kinetic Assay for Quantification of Endocytosis of Cargos that Undergo Regulated Endocytosis
3:17
Post-acquisition Analysis
5:15
Population Analysis of Mup1-pHluorin Endocytosis by Flow Cytometry
7:37
Results: Quantitative, Kinetic, and High-throughput Analysis of Endocytosis of pHluorin-tagged Proteins
9:03
Conclusion
