pHluorin在芽殖酵母内吞作用的定量、动力学及高通量分析中的应用

本实验的总体目标是定量分析活细胞内吞途径中的囊泡运输事件。该方法有助于回答囊泡运输领域中的关键问题，例如基因突变或蛋白表达水平变化如何影响运输事件的速率和效率。该技术的主要优势在于，可通过检测荧光标记的货物蛋白的荧光强度，实现对活细胞内吞运输过程的直接定量分析。

根据文本方案配制溶液和培养基后，取两到三个酵母菌落接种于5毫升YNB培养基中，该培养基不含有用于维持质粒筛选的额外营养成分。将培养物在30摄氏度条件下振荡培养16至24小时。成像前约3小时，测定各过夜培养物在600 nm处的光密度（OD 600）。

然后在缺乏质粒维持所需额外营养的 YNB 培养基中，制备 5 毫升、OD600 为 0.35 至 0.4 的稀释菌液，并在 30 摄氏度下振荡培养 3 小时。在孵育期间，预先将显微镜的环境培养室或加热载台平衡至 30 摄氏度。根据文本方案准备经处理的八孔玻璃底培养板及腔室载玻片用于成像后，向每孔加入 200 微升缺乏质粒筛选所需额外营养的 YNB 培养基。

当培养物准备就绪后，取一毫升转移至微量离心管中，在8,000 RPM条件下离心两分钟以收集细胞沉淀。随后移除975微升上清液。用剩余的上清液重悬细胞沉淀。

然后将2.5 µL细胞悬液滴加到八孔板每个孔的中央。用移液器轻轻吹打混匀以分散细胞，静置5至10分钟使细胞沉降。将培养腔室载玻片置于已平衡至30°C的倒置荧光显微镜上。

然后，使用明场照明定位一片细胞。向孔中200微升的培养基加入50微升预热的YNB培养基，其中含有100微克/毫升的甲硫氨酸，使最终甲硫氨酸浓度为20微克/毫升。在开始成像前，让细胞平衡2分钟。

然后在成像前立即调整显微镜至所需的焦平面。以5分钟为间隔，采集45至60分钟内的GFP荧光、明场或微分干涉相差（DIC）图像。同一时间序列中的所有图像须采用相同的采集参数。

有关更多详细信息，请参阅文字版实验方案。量化每个时间点单个细胞的荧光强度，并将数值表示为第一张图像初始强度的百分比。在根据文字版实验方案在 ImageJ 中导出图像后，使用“文件”菜单中的“打开”选项打开文件。

使用荧光图像进行定量分析，并利用明场或微分干涉差（DIC）图像作为参考以确定细胞位置。在DIC下观察时，死亡细胞比活细胞更暗，且在GFP通道下表现出自发荧光，若存在此类细胞应予以排除。对于背景不均匀的图像，在“Process”菜单中选择背景减除算法，并采用默认设置。

获取图像后，在进行定量分析之前，必须执行背景扣除。此步骤尤为重要，因为背景信号可能掩盖或减弱样本间的差异。使用自由选择工具勾勒出一个细胞，确保包含整个细胞，同时尽可能减少细胞外区域的选中范围。

然后在“分析”菜单下，使用“设置测量”功能来测量面积、积分密度和平均灰度值。通过点击“分析”，然后选择“工具”，打开 ROI 管理器。在 ROI 管理器窗口中，点击“添加”按钮，将高亮区域作为新的感兴趣区域（ROI）输入。

对图像中其余细胞重复上述轮廓勾画和测量操作，排除任何已死亡的细胞或与图像边缘接触的细胞。单击“measure”按钮，将选定的感兴趣区域（ROIs）保存为压缩文件，该操作将在新窗口中显示测量值。然后单击“more”按钮，将所有测量数据导出至电子表格或统计分析软件中。

接种两到三个酵母菌落及0.5毫升缺乏维持质粒筛选所需额外营养成分的YNB培养基。将细胞置于30摄氏度的旋转滚筒中培养16至24小时。加入1毫升缺乏质粒维持所需额外营养成分的YNB培养基，继续培养额外3小时。

接下来，将一毫升细胞转移至两个五毫升圆底试管中。然后向第一个试管中加入0.25毫升YNB Met培养基，向第二个试管中加入0.25毫升含有100微克/毫升甲硫氨酸的YNB培养基，使最终浓度为20微克/毫升。对于大量样本，可错开添加甲硫氨酸的时间，以便为事实分析留出足够时间。

我们的流式细胞仪每次运行最多可检测40个样本。我们分批加入甲硫氨酸，每5分钟加入8个样本。

这确保所有样品均在添加甲硫氨酸后45至50分钟内完成测量。将细胞孵育45分钟，随后通过流式细胞术分析细胞，以前向散射（FS）作为细胞大小的指标，并选取FITC滤光片检测的荧光强度作为货物内化程度的指标。

在45分钟孵育期间，使用滑块按钮调节FS和FITC通道的电压，以优化适用于所用酵母细胞大小范围和荧光强度的检测效果。从每种条件下采集10,000个细胞的FS和荧光强度数据。使用高流速设置，点击“添加图表”生成FS与荧光强度的散点图。

然后选择 FITC 作为横轴，FS 作为纵轴，并绘制 1000 个数据点。利用门控功能和野生型 Met 条件，设置一个垂直门控，使约 5% 最亮的细胞位于门控右侧。该门控设置应应用于实验中所有其他条件。

如图所示，在无甲硫氨酸或有甲硫氨酸的条件下，以每5分钟一次的时间间隔对细胞进行延时成像，以监测GFP或氟标记的Mup1的内化过程及其荧光信号的变化。预期结果表明，在无甲硫氨酸时，GFP和氟标记的Mup1保留在质膜上。相比之下，在有甲硫氨酸条件下成像的细胞中，细胞表面的荧光信号逐渐减弱，与货物蛋白的内化过程一致。

然而，在添加甲硫氨酸的情况下，Mup1-GFP细胞的荧光丢失动力学相较于pHlourin-Mup1细胞有所延迟。这些散点图比较了野生型或四种ΔENTH1细胞在有或无甲硫氨酸处理并施加垂直门控后的荧光强度。在门控右侧（对应于群体中最亮的细胞）中，仅有4%的野生型Met处理细胞位于该区域，而65%的未处理野生型细胞位于门控内。

相比之下，四种 delta ENTH1 细胞在亮细胞与暗细胞的分布上无差异，这与内吞作用缺陷一致。一旦掌握，若操作得当，该技术可在三到四小时内完成。在进行该实验时，重要的是要记住错开同时进行的实验起始时间，以便所有样本在相同处理时间后收集终点数据。

采用此方法后，还可进行其他实验，例如花卉遗传筛选，以回答更多问题，如哪些新因子参与了囊泡运输。该技术建立后，为囊泡运输领域的研究人员探索内体损耗机制以及芽殖酵母中一种新发现的、不依赖网格蛋白且依赖酸性的运输途径铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用弗洛瑞特型（florent-type）货物蛋白在活细胞中定量内吞事件。