警队复用单分子蛋白水解测量磁性镊子
July 25th, 2012
在这篇文章中，我们描述了利用磁性镊子，在一个高度并行的方式在单分子水平研究的酶水解的影响力。
该程序的总体目标是以高度平行且具有成本效益的方式研究机械负荷对单个蛋白质蛋白水解切割的影响。在这个演示中，第一步检查基质金属蛋白酶 1 对胶原蛋白的切割，将胶原蛋白修剪器连接到流通池的玻璃盖玻片上，然后将微米大小的磁珠连接到单个胶原蛋白分子上。第二步是将流通池安装到磁镊装置中，并检查是否已从盖玻片表面去除非特异性连接的微珠。
接下来，将蛋白酶添加到流动池中。最后一步是通过实时监测微珠分离来确定蛋白水解速率。通过测量不同蛋白酶浓度和力下的微珠脱落率，可以使用微量的底物和蛋白酶得出标准的动物动力学参数。
此外，该技术还提供了有关机械力对蛋白水解速率和伴随切割的底物蛋白结构变化的影响的独特信息。与光学 T 痕和原子力显微镜等其他方法相比，该技术的主要优点是该技术具有高通量和成本效益。虽然这种方法可以深入了解对单个蛋白质蛋白水解切割的有效力，但该仪器和技术可应用于广泛的生物物理问题，包括力对蛋白质折叠和确认的影响。
通过使用超声处理清洁盖玻片开始流通池制备。将盖玻片添加到能够容纳它们并放入 ator 的小玻璃容器中。用异丙醇填充容器，并在浴槽中对异丙醇进行超声处理 20 分钟，然后用大量去离子水冲洗盖玻片。
将容器装满水并超声处理 20 分钟。超声处理干燥后，盖子在过滤后的无尘空气流中滑落。检查盖玻片，只使用没有污迹的盖玻片。
轻轻地将盖玻片燃烧几秒钟，以通过盖板清除任何残留的灰尘和湿气。通过本生灯产生的燃气火焰滑落，注意不要因过热而使盖玻片翘曲。此步骤可去除残留的表面污染物。
接下来，使用双面透明胶带将两个盖玻片固定在一起。首先将胶带剪成大约 3 厘米长、0.3 厘米宽，然后将胶带贴在 22 x 40 毫米的盖玻片上，在中间留出一个 1.6 厘米的通道。使用移液器吸头轻轻按压盖玻片，以确保胶带已正确粘附。
该实验室使用带有 1 毫米直径针孔的铝制 L 型支架构建了磁镊装置，并安装在垂直 Z 转换器上以调节镊子的高度。两个永久稀土磁铁连接到针孔两侧的支架上，以产生磁场梯度。正确校准磁阱对于此过程至关重要。
为了确保成功，我们使用本节中概述的两种不同方法。校准磁阱：使用先前制备的 Lambda 噬菌体的 DNA，如书面方案中所述，在其 5 个引物和 3 个引物末端用生物素和 doxygen 标记。要先将 DNA 连接到流动槽上，请用抗 D 氧和抗体溶液填充流动槽，并让抗体粘附在玻璃表面 15 分钟。
接下来，通过向流通池中添加 BSA 溶液来吃掉流通池表面，以防止 DNA 非特异性粘附。请注意，对于此步骤和所有后续步骤，添加到流通池中的试剂体积应至少增加两倍。流通池的体积为 75 μL，在室温下孵育流通池 45 分钟。
重复此步骤后，加入 50 皮摩尔的功能化 lambda DNA，使其附着在盖玻片上 15 分钟，用一个 XPBS 洗去多余的 DNA。最后，加入链霉亲和素包被的超顺磁性微珠，让它们附着在固定的 DNA 上 15 分钟。在本演示中，使用了 2.8 微米的微珠。
用一个 XPBS 洗去多余的珠子。接下来，通过将永磁体移动到远离样品表面的位置来执行磁镊校准。然后将准备好的流通池放入显微镜中。
将永磁体移动到流通池上方的位置。通过聚焦远离两个玻璃表面的磁珠来选择 Lambda DNA 功能化磁珠的焦平面。正确的焦平面是所需微珠具有明亮中心的焦平面。
拍摄一个珠子运动的视频，其中 80 赫兹在 500 帧中更大。将磁力架移近样品表面，并记录每个位置的磁珠运动视频。对于超过 5 毫米的距离，对于 1 到 5 毫米之间的距离，请以 1 毫米为增量移动。
对于小于 1 毫米的距离，以 0.5 毫米的增量移动，以 0.25 毫米的增量移动对于每个数据集，使用 2D 高斯拟合跟踪微延筋的中心。按照书面程序中的说明通过布朗涨落计算力。通过功率谱 Lian 拟合检查力计算来确认力的准确性。
为了找到滚降频率，可以在胶原蛋白肽附着到流槽、表达和纯化胶原蛋白肽和 MMP one 蛋白之前的文本中找到施加的力和滚降频率之间的关系。首先将抗麦克风抗体溶液添加到流动槽中，并在室温下孵育 20 分钟，让抗麦克风附着在流动槽中，以防止蛋白质非特异性附着，每毫升 5 毫克。BSA 添加 150 皮摩尔胶原蛋白肽，使其通过 M ttag 附着在抗体上 45 分钟。
在向流通池中加入 2.8 微米微珠之前，使用 PBS 缓冲液洗去多余的胶原蛋白。应使用强磁铁将它们与链球菌分离和包被的珠子溶液中，然后重悬于 PBS 中。此过程应重复 3 次。
此步骤对于使 2.8 微米珠子与表面固定的胶原蛋白肽结合至关重要。接下来，添加链球菌分离链霉亲和素包被的超级顺磁性珠子，让它们附着在胶原蛋白分子上 45 分钟。将流通池与胶原蛋白肽和磁珠组装在一起后，在磁阱中对流通池进行成像。
在低力下，珠子的亚群有时很弱，以非特异性方式粘附在表面。施加适度的力可确保这些珠子被释放。将活化的酶添加到流动池中。
在这种情况下，通过添加 3.5 毫摩尔 A PMA 预激活 MMP one，并在 37 摄氏度下孵育 3 小时。一旦将流通池重新引入磁镊装置中，立即录制一个跨越几个视野的视频，通常会产生数百个附着的微珠。此测量值对应于时间等于零。
重复相同的过程，在固定的时间点记录多个视野，直到所有珠子分离或无法辨别进一步的蛋白水解。磁镊校准为 1 微米和 2.8 微米珠子。在强制蛋白水解实验中，使用观察到的布朗涨落的大小和不同磁体位置的滚降频率的计算，可以将剩余珠子的归一化数量绘制为时间的函数，以找到蛋白水解速率。
对于不同的酶浓度和力，可以重复此过程。蛋白水解速率取决于施加的力。蛋白水解速率测定为 1 皮牛顿、6.2 皮科牛顿和 13 皮科牛顿。
unpro 微珠的分数大于 15 分钟，在不同的实验中大致保持在 0.25 的恒定水平。在我们的例子中，该分析使我们能够测量 MMP one 的催化效率与施加的力的函数关系。通过分析数据，我们发现胶原蛋白三螺旋必须在蛋白水解之前局部解开。
一旦掌握，如果作正确，这项技术可以在 5 到 6 小时内完成。重要的是要记住，每个燃料视图至少需要 30 到 50 个珠子才能获得良好的数据统计显着性。不要忘记 PMA 可能非常危险，因此在进行此实验时应始终使用手套、实验室外套和口罩等预防措施。
看完这个视频，你应该对如何使用磁镊测量力对单个蛋白质蛋白水解切割的影响有一个很好的了解。磁镊是理解单分子生物物理实验的绝佳工具。该技术可以扩展到其他蛋白酶和底物组合。
此外，类似的技术可用于了解蛋白质结构动力学以及了解结合或修饰 RNA 和/或 DNA 的其他蛋白质。
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概述
本文描述了使用磁镊研究机械负载对单分子水平酶解蛋白质的影响。研究主要关注以高度并行和成本效益的方式分析基质金属蛋白酶对胶原蛋白的切割。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 生物物理学
- 蛋白质组学
背景
- 蛋白水解是一个关键的生物过程。
- 了解机械力对蛋白水解的影响可以提供对各种生物功能的洞察。
- 磁镊允许在单分子水平上进行精确的操作和测量。
- 这种方法可以应用于研究各种蛋白质和酶。
研究目的
- 检查机械负载对单个蛋白质的蛋白水解切割的影响。
- 使用最少量的底物和蛋白酶推导标准的动物学动力学参数。
- 增强对酶活性在力作用下的理解。
所用方法
- 将胶原蛋白三聚体固定在流动池中的玻璃盖片上。
- 使用微米级的磁性微珠固定在单个胶原蛋白分子上。
- 将流动池安装到磁镊装置中。
- 实时监测微珠的脱离以确定蛋白水解速率。
主要结果
- 成功附着胶原蛋白和磁性微珠以进行观察。
- 实时监测使得能够确定蛋白水解速率。
- 蛋白酶浓度和力的变化提供了有价值的动力学数据。
- 获得了机械负载和酶活性之间关系的洞察。
结论
- 该研究证明了磁镊在蛋白水解研究中的有效性。
- 机械力显著影响单分子水平的酶活性。
- 该方法可以应用于未来的其他蛋白水解研究中。
常见问题
Executive Industry Relevance
Measuring force-dependent proteolysis at the single-molecule level enables mechanistic de-risking of protease targets by revealing how mechanical microenvironment influences catalytic efficiency. This approach supports target validation in fibrosis, cancer metastasis, and atherogenesis where extracellular matrix remodeling under load is pathophysiologically relevant. The magnetic tweezers assay provides quantitative, reproducible kinetic data using minimal reagent, informing go/no-go decisions in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypothesis by quantifying how mechanical force alters protease-substrate kinetics, de-risking targets implicated in force-sensitive pathologies.
- Operational Value: Enables parallel measurement of dozens of single-molecule events, increasing statistical power while minimizing protease and substrate consumption.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates force-proteolysis rate curves that serve as quantitative, mechanism-based readouts for protease inhibitor screening under physiologically relevant mechanical conditions.
- Operational Value: Adaptable to diverse protease-substrate pairs, allowing reuse of the magnetic tweezers platform across target families without major reengineering.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges molecular mechanism to tissue-level phenotypes by linking extracellular matrix proteolysis rates to cellular traction forces in disease-relevant microenvironments.
- Operational Value: Supports preclinical model selection by identifying protease targets whose activity is significantly modulated by biomechanical cues present in fibrotic or tumor stroma.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing mechanistic insights that inform assay design and compound screening cascades.
- Discovery Biology: Tests how force influences proteolytic cleavage, clarifying whether target engagement depends on microenvironmental mechanics.
- Screening: Delivers kinetic parameters (e.g., catalytic efficiency) under defined force, enabling structure-activity relationship studies that account for biophysical context.
- Analytics: Outputs time-resolved bead detachment data, facilitating calculation of proteolysis rates and force-dependent Michaelis-Menten parameters.
- Translational Research: Connects single-molecule proteolysis dynamics to tissue remodeling processes only when supported by correlative force measurements in disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, cost-effective force spectroscopy capability applicable to multiple protease targets across discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by revealing force-dependent conformational changes in substrate preceding cleavage, increasing confidence in target mechanism of action.
- Operational Value: Delivers high-throughput, reproducible single-molecule measurements with low reagent cost, improving assay efficiency.
- Strategic Value: Informs prioritization of protease targets by quantifying how biomechanical variables affect hit translation from biochemical to cellular assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by identifying targets whose activity is robust versus sensitive to mechanical noise in vivo.
Implementation Considerations
- Expertise in single-molecule biophysics, magnetic tweezers operation, and protein surface chemistry.
- Instrumentation for force calibration, video tracking, and flow cell assembly with precise flow control.
- Standardization of bead immobilization, force calibration protocols, and data analysis pipelines across teams.
- Adaptation considerations for varying substrate size, charge, and linkage chemistry to magnetic beads.
- Practical limitations include force range (~1-100 pN) and requirement for tethered, soluble protein substrates amenable to surface attachment.
