磁性镊子的扭曲和扭矩的测量

磁镊子，一个强大的单分子操纵技术，可以适用于扭曲的直接测量（使用一种称为自由轨磁镊子配置）和扭矩中的生物大分子（使用被称为磁转矩镊子的结构）。指引进行这种测量，给出了包括应用DNA和相关的核蛋白丝的研究。

本实验的总体目标是在单分子水平上直接测量双链 DNA 分子的扭转应变或扭曲变化。这是在第一次测定中使用两种测定来完成的，称为自由轨道磁镊或重击。单个功能化的 DNA 分子被拴在磁珠和玻璃表面之间。

当圆柱形磁体施加拉伸 DNA 的力时，磁珠的角度位置仅受栓系 DNA 的约束，而不受磁体的限制，从而允许磁珠旋转（如红色箭头所示）报告 DNA 旋转的扭曲变化磁珠的热波动原因。它的 XY 位置位于 A 圆形环或甜甜圈上。将这个 XY 位置转换为旋转角度使得可以在称为磁矩镊子的第二个相关测定中监测栓系 DNA 扭曲的变化，或者将 MTTA 侧磁铁添加到主圆柱形磁铁上以限制磁珠的角度运动。

使用这种磁体配置，可以通过简单地旋转磁体组件将外部扭矩施加到栓系的 DNA 分子上，测量磁珠在施加数圈后的角度位置与其初始扭转松弛配置相比的偏差，以及校准限制磁珠的磁阱的刚度， 角运动可以量化 DNA 中扭矩的积累。与传统磁镊相比，使用 font 和 MTT 的主要优点是我们可以直接测量核酸扭曲的扭矩和变化。这种方法可以帮助我们绘制出它们对外力和扭矩的响应，从而帮助回答有关 DNA 和 RNA 力学的关键问题。

这项技术的意义延伸到探测 DNA 与蛋白质的相互作用。例如，负责 DNA 修复、储存或转录的蛋白质 这种方法的视觉演示表明，可以多么容易地修改传统的磁镊设置以赋予其新功能。用于以下实验的设置基于传统的磁镊设置。

其中心是一个流通池，由 LED 从顶部照亮，并通过显微镜物镜和 CCD 相机从下方成像。流通池上方是一个磁头，可以使用计算机控制的电机上下移动和旋转。通过自定义实验室视图软件实时分析来自 CCD 相机的图像，以确定 DNA 栓系磁珠的 X、Y 和 Z 位置。

作者可应要求提供定制实验室视图软件。制备带有 DNA 栓系磁珠的流通池后，将其安装在常规磁镊上，并选择固定在参比磁珠上的表面和栓系适当长度的单个 DNA 分子的磁珠。设置可以转换为字体模式。

首先手动拧下固定传统镊子配置的磁铁的完整磁头。将其替换为固定圆柱形磁铁的磁头。将用于 F 的圆柱形磁体放入磁头时，请务必将选定的 DNA 系绳保持在视野内。

此过程最困难的方面是正确对齐形状几何形状的磁体。通过系统地移动磁体并在每一步后测试对准情况，可以实现良好的对准，我们将对此进行演示。现在，使用位置阶段在字体中对磁体进行路线对齐，以在 lab view 软件中手动移动磁体。

单击记录按钮以测量 XY 位置的波动或偏移。记录的轨迹实时显示在屏幕上，并保存为包含 X、Y、Z 位置信息的文本文件。如果 XY 偏移遵循此处所示的弧线，则圆柱形磁体未正确对准，请继续沿适当的方向移动圆柱形磁体并进行测量，直到 XY 波动勾勒出完整的圆形图案，这表明实现了航向对准。下一个。

如果需要进一步实验，使用高分辨率自动载物台移动流通池，将圆柱形磁体对准磁珠约 10 微米，从而在字体中进行精细对准。然后像以前一样，记录 XY 偏移。继续移动载物台并记录偏移，直到圆形环上的波动几乎均匀。

要验证最终对齐，请使用作者应要求提供的 MATLAB 脚本来绘制直方图或热谱图中的波动并检查其均匀性。要测量 DNA 扭矩，请移除用于字体的圆柱形磁铁，并将其替换为圆柱形磁铁和永磁体。对于 MTT，确保所选的 DNA 系绳保持在视野内。

在控制实验室视图软件的相应面板中输入磁匝数和磁匝数。这里。圈数设置为 5，速率设置为 0.1 赫兹。这将导致磁体在测量过程中缓慢旋转。

接下来，在 MATLAB 中，使用基于监控 XY 位置的角度跟踪脚本，该脚本可应要求从作者处获得。将显示将角度波动显示为时间函数的绘图，θ T 将出现。在实验室视图中设置完所有内容后，单击"录制"按钮。

跟踪将像以前一样实时显示。在 MATLAB 中，使用 MATLAB 脚本在屏幕上生成 T 迹线的角度 theta T 和焊缝高度 Z 的绘图，并对角度信号进行高斯拟合，以确定角度波动的标准差。Sigma theta.

该脚本根据角度波动的变化直接确定扭力陷阱的刚度。Sigma theta 以弧度为单位的平方。使用此处显示的公式，请注意，在 MTT 中，通常可以实现每弧度 10 至 1000 皮牛顿纳米的旋转陷阱刚度，这比传统的磁镊子要低得多。

例如，在这里，我们确定旋转陷阱刚度约为每弧度 52 pig 纳米。与传统磁力镊相比，磁力矩镊子的旋转陷阱刚度使其适用于测量单分子扭矩，但也意味着可以施加的最大扭矩降低。这意味着 MTT 无法抵消由快速旋转引起的阻力矩。

因此，必须注意不要旋转得太快。我们通常以大约 0.1 赫兹的速率旋转。接下来，通过缓慢旋转磁体（一定圈数）来压倒 DNA 系绳，并通过记录另一条角度波动的痕迹，将磁体圈数和圈数再次输入到控制实验室视图软件的相应面板中。

此处，圈数设置为 40，速率设置为 0.1 赫兹。这将导致磁体在测量过程中缓慢旋转，以确定核酸系绳中累积的扭矩。转 N 圈后，我们使用此处显示的公式，其中尖括号表示平均值和 theta 零。

和 θ N 分别是对应于扭转松弛系绳和匝数的零匝处的角度。重复磁体旋转的步骤，并根据需要记录角度波动的高原，以便在一次测量运行中完全确定分子的 toque 响应。测量修复蛋白 RAD 51 诱导的 DNA 扭曲的变化，该修复蛋白与双链 DNA 的结合既延长又解旋。

将 DNA rad 51 添加到栓系在字体中的 DNA 分子中。如此处所示，拉延筋勾勒出螺旋状的轨迹。这种运动可以解耦为描述 DNA 如何随时间延长和展开的成分。

为了使用 MTT 测量储存在 DNA 中的扭矩，测量了系统地过度和欠绕的分子以及每次应用圈数的角度波动。报告角度陷阱刚度的角度波动的标准差应与施加的匝数无关。这里，标准差大约是 9 度，如图所示。

角度位置的平均值使用恒定的角度陷阱刚度随施加的匝数系统地变化。平均角度的变化被转换为扭矩，产生存储在 DNA 中的扭矩与施加的转弯。同时记录磁珠 Z 位置可产生 DNA 的长度与施加的转数。

这两条曲线一起产生了 DNA 对过度缠绕和欠缠绕的完整机械响应。观看此视频后，您应该对如何使用自由轨道磁镊和磁力矩镊子对生物分子进行测量、扭曲和扭矩，以用于传统磁镊可以轻松适应的新型单分子检测。这些技术的发展为生物物理学领域的研究铺平了道路，例如，研究 DNA 或 RNA 的扭转特性以及观察 DNA 压缩和修复等过程。字体和 MTT 技术可以通过荧光检测等其他方法得到增强，以回答其他问题，例如确定蛋白质在栓系 DNA 上的特定位置。