GFP的表达和使用的大里基于图像流式细胞仪的可行性评估
2011年11月17日
本协议描述了如何使用的大里基于图像流式细胞仪进行细胞活力和荧光表达分析。
该视频演示了使用基于 tally 图像的细胞仪测定表达 GFP 的细胞活力的程序。使用 Tally 活力检测试剂盒对 GFP 转导的细胞进行染色 死细胞红，该试剂盒用碘化丙啶将所有死细胞染成红色，将细胞移液到 Tally 细胞分析玻片中并加载到细胞仪中，该细胞仪采集并分析明场和红色和绿色荧光图像。然后生成直方图以显示与传统流式细胞术相比的细胞计数、细胞大小、PI 荧光强度和 GFP 荧光强度。
Tali 可以提供有关细胞活力和表达的类似数据。然而，这种基于图像的细胞术提供了有关正在检查的细胞群的额外视觉信息。与流式细胞术或荧光显微镜等现有方法相比，该技术的主要优势在于，基于 Tally 图像的细胞仪可同时提供有关细胞样品的定量和视觉信息。
此外，与流式细胞仪或荧光显微镜相比，Tally 仪器更易于使用、成本更低且占地面积更小。这使研究人员能够在工作台上快速进行定量分析，例如表达 GFP 的细胞的活力。在本程序中，用核靶向细胞轻 GFP 病毒构建体转导浓度为 1 倍 10 至每毫升 6 个细胞的 U2 OS 细胞，以维持死细胞，碘化丙啶将 100 微升细胞悬液转移到新的微量离心管中。
请注意，建议检测浓度为 1 乘以 10 至 5 至 1 乘以 10 至第 7 个细胞/毫升，但浓度不必精确。接下来，加入 1 μL Tally 死细胞红试剂。然后短暂涡旋混合，将染色试剂和细胞混合物在室温下避光孵育 1 至 5 分钟。
孵育后，立即在基于 tally 图像的细胞仪上进行分析。该计数使用专为该仪器设计的一次性塑料细胞分析玻片。始终确保握住载玻片的边缘以加载载玻片。
将 25 μL 样品缓慢移液到半月形样品装载区域之一。在这里，将未染色的非转导对照细胞加载到腔室 A 中，将染色的 GFP 表达细胞加载到腔室中 B.To 在 GFP 表达细胞中进行活力测定，触摸细胞仪主屏幕上的 G-F-P-R-F-P。然后，检测选项将出现在右侧，选择 GFP plus viability。
然后，仪器将询问是否应该命名样本系列来命名样本系列。立即按 name。然后使用触摸屏输入样品系列的名称并按下保存，Tally 细胞仪将自动前进到测量屏幕。
接下来，要测量背景荧光，请按测量屏幕右下角的背景选项卡，如图所示。默认设置表示将对 9 个单元格字段进行成像。现在，将对照样品背对仪器，将玻片插入加载端口直至停止。
不要在背景屏幕上用力，触摸按下以插入新的未染色细胞对照。玻片将自动拉入仪器中，细胞的实时图像将显示在屏幕上。使用聚焦旋钮，在聚焦时将单元格置于适当的视图平面中。
将红色缩放按钮滑动至 4 倍或 16 倍。为了更好地观察细胞群，细胞应均匀变暗，每个细胞周围都有一个明亮的光晕。如此处所示，当背景和单元格边缘之间的过渡模糊时，单元格可能会计数不足，因此单元格边界没有明确定义。
当细胞的中心明亮而周边较暗时，细胞可能会被过度计数。一旦细胞聚焦，触摸、按压以运行未染色的细胞对照。为了测量背景荧光，细胞仪将自动捕获图像并显示每个视野的缩略图。
进度条提供分析的持续更新。图像捕获完成后，细胞仪会自动弹出载玻片并提供来自捕获图像分析的数据。存储的数据显示在 background 选项卡的下拉菜单中。
将为背景对照样品分配与实验相同的名称。要运行 PI 染色的 GFP 转导样品，请从仪器中取出载玻片，将其翻转并重新插入，使转导的样品背对仪器。按下 sample 选项卡，然后触摸 press 以插入新 sample。
当图像出现在屏幕上时，使用对焦旋钮使单元格成为焦点。和以前一样，然后触摸 press 以运行样品。图像捕获完成后，分析数据显示在样品选项卡下，细胞仪会自动适当弹出玻片。
丢弃 Tally 细胞分析载玻片。作为生物危害性废物，这些玻片不能重复使用。运行样本后，可以将阈值应用于样本。
为了在此处分析特定的细胞群，我们将调整阈值以确定活细胞和死细胞的百分比。在样品选项卡下的 GFP 表达细胞中，表达 GFP 的活细胞和表达 GFP 总活力的死细胞的数量和百分比。显示平均细胞大小、计数的细胞数和细胞浓度。
此外，显示细胞大小、绿色荧光和红色荧光的直方图显示在屏幕底部。要设置像元大小门控，请触摸像元大小缩略图以打开像元大小直方图以排除任何碎片。移动蓝色滑块以排除大型和小型事件。
触摸 apply 以包括门内的单元格。接下来，要将 GFP 荧光添加到分析中，请触摸 GFP 直方图缩略图。打开它。
移动蓝色滑块，将阈值设置在最暗峰值的右侧。使用对照样品作为指导。这允许分析包括 GFP 阳性细胞，但排除自发荧光细胞。
当细胞内的生物分子 excel 触摸应用确认并返回上一个屏幕时，经常会观察到自发荧光。样品选项卡下显示的数据现在应反映为两个荧光通道设置的门和阈值。接下来，要将 PI 染色细胞与自发荧光或样品中存在的任何背景分开，请按 PI 直方图缩略图再次打开它。
对照样品峰将在直方图上显示为灰色峰。红色峰是样品荧光。在本仪器上，背景荧光显示为最接近零 RFU 值的峰。
要消除 PI 通道中的背景荧光，请移动蓝色滑块以调整阈值。要排除此峰，请使用对照样品中的灰色峰作为参考。当 PI 通道中的阈值设置合理后，点击应用确认并返回上一屏幕，Tally 仪器将再次自动重新分析数据并在样品选项卡中更新结果。
接下来，要直观地确认每个单元格都已正确分配，请按缩放选项卡，然后按图像的缩略图选择捕获的视野以供查看。然后按 layers 选项卡。接下来，按 GFP 或 PI 按钮显示通过该通道捕获的图像。
再次按下相同的按钮可从显示中删除图层或叠加图层，触摸对应于每个通道的按钮以识别如何通过特定通道对细胞进行计数。触摸圈仅通过明场通道计数的细胞，不表达荧光的细胞将用蓝色圈出。这表明特定细胞是在绿色通道中表达的活细胞。
GFP 将在红色通道中表达的绿色细胞中圈出。用 pi 染色的细胞将用红色圈出，并且在两者中都计数为死细胞。红色和绿色通道将用黄色圈出。
这表明该细胞表达 GFP，但也被 pi 染色，因此是死亡的。屏幕上偶尔会出现一个黑色圆圈。这些是已识别但已根据像元大小从分析中排除的对象。
使用刚才描述的步骤继续微调荧光直方图上的阈值，直到每个表达荧光的细胞都用适当的颜色圈出。所有分析参数都会自动保存到仪器中。在数据点击下。
该计数可以存储 500 次样品运行的数据文件。存储在 data 选项卡中的每个文件都可用于重新分析。通过从数据选项卡中选择文件，该文件将被重新打开，并且所有直方图和图层都将变为活动状态，以存档数据并生成报告。
存储在仪器中的数据可以使用 USB 驱动器传输到计算机。用细胞核靶向细胞光转导四种代表性细胞类型，GFP 病毒构建体使用死细胞红试剂用 Tally 活力试剂盒染色，并在流式细胞仪中通过 Tally 分析，如图所示。两种方法都报告了每种细胞类型中表达 GFP 的群体百分比大致相同，以及活细胞群中表达 GFP 的总细胞群百分比。
这些数据表明，Tali 细胞仪能够区分细胞群中的 GFP 总表达和活细胞群中的 GFP 表达。我们刚刚演示了如何使用基于 Tally 图像的细胞仪来评估细胞样品中的荧光表达和活力。这项技术弥合了个体细胞研究和群体细胞研究之间的差距。
使用基于 Tally 图像的细胞仪，您可以收集有关单个细胞以及更大细胞群的定量和定性视觉信息。使用相同的程序，可以进行其他几种检测，包括细胞凋亡、RFP 表达和细胞活力对于非表达细胞，潜在应用包括基因表达评估到药物疗效研究。
概览
本协议描述了如何使用Tali图像基因组仪进行细胞活力和荧光表达检测。该方法允许研究人员通过定量和可视化数据分析细胞群体。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 荧光显微镜
- 细胞计数
背景
- Tali图像基因组仪为传统流式细胞术提供了一种替代方法。
- 它允许同时获取定量和可视化数据。
- 该方法用户友好且具有成本效益。
- 适用于分析表达GFP的细胞。
研究目的
- 评估表达GFP的细胞的活力。
- 展示基于图像的细胞计数相对于传统方法的优势。
- 提供使用Tali图像基因组仪的详细协议。
使用的方法
- 用GFP转导U2 OS细胞。
- 用Tali死细胞红色试剂染色。
- 将样本装载到Tali细胞分析载玻片中。
- 使用Tali图像基因组仪进行分析。
主要结果
- 关于细胞活力和GFP表达的定量数据。
- 细胞群体的可视化表示。
- 显示细胞大小和荧光强度的直方图。
- 与传统流式细胞术结果的比较。
结论
- Tali图像基因组仪有效用于评估细胞活力。
- 它提供了关于细胞群体的额外可视化洞察。
- 该方法适用于研究环境中的台式使用。
常见问题
Executive Industry Relevance
The Tali Image-Based Cytometer bridges the gap between flow cytometry and fluorescence microscopy by delivering simultaneous quantitative and visual data for cell viability and GFP expression assays. This dual-output capability supports early discovery workflows where phenotypic confirmation and mechanistic de-risking require both population-level metrics and single-cell visualization. Its benchtop footprint, lower cost, and simplified operation enable decentralized use across discovery biology and assay development teams, reducing reliance on core facilities and accelerating go/no-go decisions in target validation pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating GFP expression with viability status in live-cell populations.
- Operational Value: Provides visual confirmation of transfection efficiency and protein localization alongside quantitative viability readouts.
- Predictive Value: Supports target confidence by distinguishing total GFP expression from expression in viable cells, reducing false-positive leads.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized histograms for cell size, PI fluorescence, and GFP intensity, enabling threshold-based gating for reproducible population analysis.
- Scalability: Processes thousands of cells per sample with consistent imaging and algorithmic analysis, supporting medium-throughput screening campaigns.
- Workflow Integration: Outputs are compatible with downstream analytics for hit selection and lead optimization in phenotypic screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains assay consistency from discovery validation to preclinical models by providing comparable viability and expression data to flow cytometry.
- Mechanistic De-risking: Visual layering of brightfield, GFP, and PI signals confirms co-localization of transgene expression and cell death, clarifying mechanism of action.
- Predictive Confidence: Enables risk-adjusted advancement decisions by quantifying the fraction of live, transgene-expressing cells in heterogeneous populations.
Pipeline & Workflow Integration
The Tali cytometer fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification, where simultaneous viability and reporter gene assessment informs compound effects on cellular health and target engagement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking GFP reporter activity to cell survival, clarifying on-target versus off-target effects.
- Screening: Delivers quantitative fluorescence and viability outputs with visual validation, enhancing assay reproducibility and hit confirmation.
- Analytics: Provides histogram-based readouts for cell size, GFP intensity, and PI intensity, enabling statistical comparison across conditions and replicates.
- Translational Research: Ensures data continuity with preclinical workflows by mirroring flow cytometry outputs while adding visual context for mechanistic interpretation.
- Enterprise Reuse: Functions as a shared benchtop platform for multiple assays (viability, GFP/RFP expression, apoptosis), maximizing instrument utilization across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through correlated visual and quantitative data.
- Operational Value: Standardizes assay execution via disposable slides and automated image analysis, improving reproducibility and reducing user variability.
- Strategic Value: Accelerates discovery timelines by enabling rapid benchtop iteration without flow cytometry scheduling constraints.
- Portfolio Impact: Supports risk-based prioritization by quantifying live, transgene-positive cells, improving the quality of advancement candidates.
Implementation Considerations
- Requires basic training in fluorescence microscopy principles and threshold gating for fluorescence and scatter parameters.
- Depends on the Tali Image-Based Cytometer, Tali Cellular Analysis Slides, and Tali Viability Kit - Dead Cell Red reagent for PI-based viability detection.
- Necessitates standardization of staining protocols, incubation times, and focus procedures across users and sites for consistent results.
- Adaptation to other model systems may require optimization of cell concentration and staining conditions due to variations in size and autofluorescence.
- Practical limitations include inability to perform multi-parameter immunophenotyping beyond three channels and incompatibility with adherent cell assays without dissociation.
