Name: GFP的表达和使用的大里基于图像流式细胞仪的可行性评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 学习使用Tali图像流式细胞仪评估GFP表达细胞的存活率。该方法结合定量数据与可视化图像，为细胞生物学研究提供经济高效的台式分析方案。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. 使用 Tali 细胞活力检测试剂盒 - 死细胞红色染料对细胞进行染色
<ol>
 <li>使用 CellLight Nucleus-GFP *BacMam 2.0* 转导的 U2OS 细胞（美国模式培养物集存库）开始本实验。（注意：也可将细胞离心后重悬于培养基或 PBS 中）。</li>
 <li>为用 PI 染色死细胞，取 100 μL 细胞悬液转移至新的微量离心管中。建议本检测中细胞浓度为 1 × 105 至 1 × 107 个细胞/mL，但浓度无需精确。</li>
 <li>接着，加入 1 μL 基于 PI 的 Tali 死细胞红色试剂以染色死细胞。短暂涡旋混匀。将 Tali 死细胞红色试剂与细胞混合物在室温避光孵育 1–5 分钟。</li>
 <li>孵育结束后，立即进行 Tali 基于图像的细胞仪对样品的分析。</li>
</ol>
2. 使用基于图像的 Tali 细胞仪进行细胞活力检测
<ol>
 <li>Tali 细胞仪使用一次性塑料 Tali 细胞分析载片，该载片专为细胞仪设计，可牢固插入仪器中，并在两个独立的封闭腔室（A 和 B）中各容纳 25 μL 样本。操作载片时，务必始终从两侧持握。</li>
 <li>加载样本时，用移液器缓慢将 25 μL 样本加入半月形的样本加载区，注意避免产生气泡或回溅。切勿过量或不足量填充。</li>
 <li>此处，对照细胞（未染色、非转导）加载于腔室 A，而染色的 GFP 表达细胞则加载于腔室 B。对照样本有助于在数据分析时确定自发荧光水平。</li>
 <li>进行活率检测时，点击细胞仪主屏幕上的 GFP/RFP。检测选项将显示在右侧，选择 GFP + Viability。</li>
 <li>接下来，点击 Name Now 以命名样本系列。然后通过触摸屏输入样本系列名称，并点击 Save。（注意：Select Name Later 可按日期和时间自动为每个样本系列分配名称。）</li>
 <li>命名样本后，Tali 细胞仪将自动进入 Measure 屏幕。点击 Measure 屏幕右下侧的 Background 标签。</li>
 <li>接下来，将对照样本（A）朝向远离细胞仪的方向，将载片插入加载口直至无法再推进。切勿用力过猛。</li>
 <li>在背景屏幕上，点击 Press to Insert New Unstained Cell Control。载片将自动被拉入细胞仪，屏幕上将实时显示细胞图像。</li>
 <li>使用调焦旋钮，将细胞调整至合适的焦平面。细胞应呈现均匀暗色，每个细胞周围有明亮的光晕（图 1，左）。</li>
 <li>当背景与细胞边缘之间的过渡模糊，导致细胞边界不清晰时，可能导致细胞计数偏低（图 1，中）。当细胞中心明亮而边缘暗淡时，可能导致细胞计数偏高（图 1，右）。</li>
 <li>为在调焦过程中更清晰地观察细胞群体，可滑动红色的 Zoom 指示按钮至 4X 或 16X。</li>
 <li>当细胞已调至清晰对焦后，点击 Press to Run Unstained Cell Control 以测量背景荧光。</li>
 <li>细胞仪将自动捕获并分析样本图像。在默认（9 幅图像）模式下，图像捕获与分析约需 1 分钟。</li>
 <li>每幅视野的缩略图将在捕获过程中依次显示，进度条提供实时更新。图像捕获完成后，细胞仪将自动弹出载片，并显示基于所捕获图像的分析数据。</li>
 <li>存储的数据将显示在细胞仪 Background 标签的下拉菜单中。背景对照样本将被赋予与实验相同的名称，并导入下拉菜单中。注意：若未运行背景对照，细胞仪将自动设定荧光阈值。该阈值可在检测完成后手动调整。</li>
 <li>运行经 PI 染色的转导样本时，从细胞仪中取出载片，将其翻转，并重新插入，使转导样本朝向远离仪器的方向。</li>
 <li>点击 Sample 标签，然后点击 Press to Insert New Sample。当屏幕显示图像后，使用图像调节旋钮如前所述将细胞调至对焦清晰，然后点击 Press to Run Sample。</li>
 <li>图像捕获完成后，分析数据将显示在 Sample 标签下，细胞仪将自动弹出载片。</li>
 <li>将 Tali 细胞分析载片作为生物危害废弃物妥善处理。Tali 细胞分析载片不可重复使用。</li>
</ol>
3. 设置阈值与门控
<ol>
 <li>样品运行完成后，现在可对样品设置阈值，以聚焦特定的细胞群体。此处，我们将调整阈值以确定GFP转导细胞中活细胞与死细胞的百分比。</li>
 <li>在样品选项卡下，将显示表达GFP的细胞数量与百分比、表达GFP的活细胞与死细胞、总存活率、平均细胞大小、计数的细胞总数以及细胞浓度。</li>
 <li>此外，屏幕底部还会显示细胞大小、绿色荧光和红色荧光（PI）的直方图。</li>
 <li>要设置细胞大小门控，轻触细胞大小缩略图以打开细胞大小直方图。尽管培养的细胞中极少含有碎片，但其他样品可能含有比细胞更大或更小的碎片。</li>
 <li>为排除这些碎片，滑动滑动条上的蓝色按钮，以排除过大和过小的事件。然后，轻触应用以重新分析数据并更新结果。</li>
 <li>接下来，为将GFP荧光加入分析，轻触GFP直方图缩略图以打开该直方图。滑动蓝色条，将阈值设置在最弱峰右侧附近，并以对照样品作为参考。</li>
 <li>这使得分析可包含GFP阳性细胞，同时排除自发荧光细胞。当细胞内的生物分子被激发时，常可观察到自发荧光现象。</li>
 <li>轻触应用以确认并返回上一屏幕。此时样品选项卡下显示的数据应已反映为两个荧光通道所设定的门控与阈值。</li>
 <li>接下来，为将PI染色的细胞与自发荧光区分开，按下PI直方图缩略图以打开PI直方图。</li>
 <li>对照样品的峰将以灰色峰的形式显示在直方图上。红色峰为样品的荧光信号。背景荧光在此流式细胞仪中显示为最接近0 RFU值的峰。</li>
 <li>为消除PI通道中的背景荧光，移动滑动条上的蓝色按钮，调整阈值以排除代表背景荧光的峰，并以对照样品的灰色峰作为参考。轻触应用以确认并返回上一屏幕。</li>
 <li>接下来，为直观确认每个细胞是否被正确分配，通过按下缩放选项卡中的图像缩略图，再按下图层选项卡，选择一个已捕获的视野进行查看。</li>
 <li>接着，按下GFP或PI按钮，以显示通过该特定通道捕获的图像。再次按下同一按钮可从显示中移除该图层；或通过按下多图层按钮，实现图层叠加。</li>
 <li>为识别细胞如何通过特定通道被计数，轻触圆圈。仅通过明场通道计数且不表达荧光的细胞将以蓝色圆圈标出。这表明该细胞为活细胞（即PI阴性）。</li>
 <li>表达GFP的细胞将在GFP通道中可见，并以绿色圆圈标出。经Dead Cell Red染色的死细胞将在PI通道中可见，并以红色圆圈标出。</li>
 <li>在红色和绿色通道中均被计数的细胞将以黄色圆圈标出，这表明该细胞表达GFP，但也被PI染色，因此为死细胞。</li>
 <li>偶尔，屏幕上会出现黑色圆圈，这些是已被识别但因细胞大小不符合条件而被排除在分析之外的物体。</li>
 <li>继续使用上述步骤微调荧光直方图中的阈值，直至每个表达荧光的细胞均被相应颜色的圆圈正确标记。</li>
 <li>所有分析参数将自动保存在数据选项卡下。Tali流式细胞仪可存储约500次样品运行的数据文件。</li>
 <li>数据选项卡中存储的每个文件均可用于重新分析。通过从数据选项卡中选择文件，即可打开该文件，所有直方图和图层将恢复为可操作状态。</li>
 <li>为归档数据和生成报告，可使用U盘将细胞仪中存储的数据传输至计算机。</li>
</ol>
4. 典型结果：
采用Tali图像细胞仪检测经核定位GFP BacMam 2.0表达载体转导的细胞中荧光蛋白的表达水平。实验中对四种代表性细胞类型进行了转导（U2OS、293MSR、HEKn和CHO-S）。对于这些细胞系，Tali细胞仪报告了表达GFP的细胞数量，并与同一标本在流式细胞仪上获得的数据进行比较。此外，使用Tali活力检测试剂盒中的Dead Cell Red试剂对细胞进行染色，以在Tali细胞仪和流式细胞仪上识别死细胞群体。
图2中的图形表示展示了每种细胞类型中表达GFP的细胞占总细胞群体的百分比。这些数据表明，Tali细胞计数仪产生的结果与流式细胞仪生成的数据具有可比性。
<img alt="细胞计数对焦对比示意图，显示正确与错误对焦状态下的准确分析效果。" src="/files/ftp_upload/3659/3659fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 分析前细胞应正确对焦。 使用适合分析的Tali细胞分析载片，细胞浓度适宜（推荐细胞数量为1 × 105 至 1 × 107 个细胞）。（左） 对焦准确的细胞在整个细胞区域内呈均匀深色，每个细胞周围有明亮的光晕。（中） 当背景与细胞边缘之间的过渡模糊、细胞边界不清晰时，可能导致细胞计数偏低。（右） 当细胞中心过亮而边缘过暗时，可能导致细胞计数偏高。
<img alt="细胞活力分析；GFP表达柱状图；基于图像与流式细胞术的比较。" src="/files/ftp_upload/3659/3659fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. Tali 基于图像的细胞仪获得的荧光蛋白表达数据与流式细胞术结果相当。 对4种不同细胞系中活细胞的GFP表达量计算结果进行并列比较。

<ol><li>Godfrey, W. L., Hill, D. M., Kilgore, J. A., Buller, G. M., Bradford, J. A., Gray, D. R., Ignatius, M. J., Janes, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementarity+of+Flow+Cytometry+and+Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Complementarity of Flow Cytometry and Fluorescence Microscopy.</a> Microsc. Microanal. 11, 246-247 (2005).</li>
<li>Mittag, A., Pinto, F. E., Endringer, D. C., Tarnok, A., Lenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+analysis+by+open-source+software+for+affordable+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Cellular analysis by open-source software for affordable cytometry.</a> Scanning. 33, 33-40 (2011).</li>
<li>Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+green+fluorescent+protein+and+its+mutants+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2782-2790 (1997).</li>
<li>Smyth, P. G., Berman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+apoptosis%3A+methods+for+elucidating+the+mechanism+of+apoptotic+cell+death+from+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system.</a> Biotechniques. 32, 648-654 (2002).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
<li>Koopman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+V+for+flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+B+cells+undergoing+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis.</a> Blood. 84, 1415-1420 (1994).</li>
<li>Tanke, H. J., van der Linden, P. W., Langerak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+fluorochromes+to+ethidium+bromide+for+automated+read+out+of+cytotoxicity+tests%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Alternative fluorochromes to ethidium bromide for automated read out of cytotoxicity tests.</a> J. Immunol. Methods. 52, 91-916 (1982).</li>
<li>King, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+dead+cells+and+measurement+of+cell+killing+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 243, 155-166 (2000).</li>
<li>Jones, K. H., Kniss, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propidium+iodide+as+a+nuclear+counterstain+for+immunofluorescence+studies+on+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Propidium iodide as a nuclear counterstain for immunofluorescence studies on cells in culture.</a> J. Histochem. Cytochem. 35, 123-125 (1987).</li>
<li>Dell'Arciprete, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+expression+gene+cloning+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">High-efficiency expression gene cloning by flow cytometry.</a> J. Histochem. Cytochem. 44, 629-640 (1996).</li>
<li>Lamm, G. M., Steinlein, P., Cotten, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+quantitative+and+inexpensive+method+for+detecting+apoptosis+by+flow+cytometry+in+transiently+transfected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid, quantitative and inexpensive method for detecting apoptosis by flow cytometry in transiently transfected cells.</a> Nucleic. Acids. Res. 25, 4855-4857 (1997).</li>
<li>Perfetto, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine+reactive+dyes%3A+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).</li>
</ol>

Krissy Remple 和 Laurel Stone 是 Life Technologies 的员工，该公司生产了本文所使用的仪器。Life Technologies 赞助了本视频文章的制作。

我们刚刚详细介绍了一种使用基于图像的Tali细胞计数仪进行活力计数和评估GFP表达的操作流程。采用相同的操作流程，该细胞计数仪还可用于执行多种其他检测，包括：细胞凋亡、RFP分析以及使用未转导细胞进行的细胞活力分析。
细胞活力、基因表达和细胞凋亡的荧光测定法已成为生物医学研究中的关键技术方法7-12。过去，研究人员需使用不同的仪器分别获取细胞的定量数据和可视化信息。虽然通过流式细胞术可以获得异质细胞群体中细胞的定量信息1-4，但视觉或定性信息则主要依赖荧光显微镜获取。本文介绍一种连接群体细胞与单细胞研究之间差距的技术。利用基于图像的 Tali 细胞分析仪，可同时获取单个细胞或细胞群体的定量数据和可视化细胞图像数据。Tali 仪器可用于多种应用，包括基因表达评估、细胞凋亡检测、药物疗效研究以及疾病进展评估。
Tali 图像细胞仪可捕获并分析明场、红色荧光和绿色荧光图像，从而获取有关细胞亚群的信息。例如，在本实验中，我们利用死细胞红色染料（Dead Cell Red dye）在表达 GFP 的细胞群体中区分出死细胞与活细胞。这提高了对表达 GFP 的活细胞定量的准确性，并可识别出可用于后续实验操作的细胞群体。需要注意的是，细胞群体中的死细胞可能来源于多种因素，包括培养过程中的正常细胞死亡，或由环境条件引起的细胞死亡（例如胰蛋白酶消化处理，或转染/转导方法所诱导的细胞死亡）。
在此，我们展示了使用 Tali 细胞仪对 U2OS 细胞进行检测的方法。类似的方法也可用于大多数哺乳动物和昆虫细胞。对于每种细胞系，Tali 细胞仪均可获得定量的 GFP 表达数据，而使用标准荧光显微镜对细胞进行目视观察则无法实现这一结果。尽管这些结果与流式细胞术相当，但数据采集所需时间仅为后者的一小部分。该细胞仪能够准确计数直径在 5 μm 至 60 μm 之间的细胞，理想浓度范围为 1 × 105 至 1 × 107 个细胞/mL。
需要指出的是，大多数标准染色方案（包括此处所述的死细胞红色染色方案）均使用碘化丙啶（propidium iodide）来区分活细胞与死细胞。然而，在对经透化处理以标记细胞内标志物的细胞进行活力评估时，这种方法会带来挑战，因为碘化丙啶可对任何细胞膜受损的细胞进行染色。由于Tali基于图像的细胞仪能够检测绿色或红色荧光通道的任何荧光染料或蛋白，未来的研究可探索使用其他替代性染料，例如胺反应性活力染料4。Perfetto et al.12 在2006年的一项研究中发现，这类染料在区分活细胞与死细胞群体时操作简便且结果可重复。


请注意，Tali 在可执行的检测类型方面存在一定的局限性。例如，由于仪器使用的物镜为 4X，计数操作仅限于较大的细胞类型：亚细胞结构（如线粒体或囊泡）以及细菌细胞无法被定量。还需注意，Tali 的检测通道仅限于可在其通道内激发和发射荧光的荧光染料。虽然 YFP 和强荧光的 mCherry 信号可以被检测到，但较弱的 mCherry 信号则无法检测。最后，Tali 仅能分析悬浮状态的细胞，无法准确计数贴附在载玻片上的细胞。此外，对于形态不规则的细胞（包括某些酵母细胞和原代细胞），其计数能力也十分有限。

此外，未来的研究可能会探讨该系统在评估细胞内标志物表达方面的应用。可使用 Invitrogen 的在线 SpectraViewer 工具（<a href="http://www.invitrogen.com/spectraviewer">www.invitrogen.com/spectraviewer</a>）检查单个染料与相邻通道之间是否存在光谱重叠。鉴于该技术尚属新兴，其全部应用范围仍有待探索。
综上所述，本文展示的Tali基于图像的细胞仪呈现了一种新技术，可同时对细胞群体进行可视化和分析，能够在紧凑的格式下通过简单的操作流程，实现对单个细胞以及细胞群体的评估。

<table><tbody><tr><td>基于图像的Tali细胞仪</td><td>Invitrogen</td><td>T10796</td><td></td></tr><tr><td>Tali细胞分析载玻片，50片</td><td>Invitrogen</td><td>T10794</td><td></td></tr><tr><td>Tali细胞分析载玻片，500片</td><td>Invitrogen</td><td>T10795</td><td></td></tr><tr><td>Tali细胞活力检测试剂盒 - 死细胞红色</td><td>Invitrogen</td><td>A10786</td><td></td></tr><tr><td>Tali细胞活力检测试剂盒 - 死细胞绿色</td><td>Invitrogen</td><td>A10787</td><td></td></tr><tr><td>Tali细胞凋亡检测试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>A10788</td><td></td></tr><tr><td>U2OS细胞</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

基于图像的 tali 细胞仪评估 gfp 表达与细胞活力

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

单细胞和群体信息通常通过流式细胞术或荧光显微镜获得。然而，这两种方法提供的信息不同。流式细胞术可提供有关物理特性以及染色或表达情况的定量多参数信息，但无法实现可视化观察；而独立的荧光显微镜可提供可视化数据，却难以进行直接的定量测量1。
基于图像的细胞计数技术弥合了这两种方法之间的差距，能够快速可视化并同时对异质细胞群体中的数千个细胞进行定量分析2。本文介绍了一种利用Tali基于图像的细胞计数仪进行细胞活力和绿色荧光蛋白（GFP）表达检测的方法3。Tali仪器是一种三通道（明场、绿色荧光、红色荧光）台式检测平台，相较于流式细胞术和荧光显微镜具有多项优势。Tali细胞计数仪成本更低，占用实验台空间更小，维护需求更少，且工作流程已简化，使得操作和分析更加简便快捷。Tali细胞计数仪可执行多种悬浮细胞检测，包括GFP和红色荧光蛋白（RFP）表达检测、凋亡4-6以及使用碘化丙啶（PI）进行的细胞活力分析7-11。
本文演示了使用 Tali 仪器对表达 GFP 的细胞进行细胞活力检测的方法。将经 GFP 转导的细胞利用 Tali 活性检测试剂盒（死细胞红色染料）进行染色，随后通过移液将细胞加入 Tali 细胞分析载玻片，并将其装载至细胞仪中。仪器采集明场、红色荧光和绿色荧光图像，并利用特定检测算法进行分析。随后生成直方图，以显示细胞大小、碘化丙啶（PI）荧光强度以及 GFP 荧光强度。通过对这些参数设定阈值，可进一步聚焦于特定的细胞群体。
Tali图像型细胞计数仪与传统流式细胞术的并行比较表明，这两种方法在细胞活力和蛋白质表达方面提供的数据具有可比性。然而，Tali仪器能够提供有关细胞群体的额外可视化信息，而这些信息是使用流式细胞仪无法获得的。

本方案介绍了如何使用Tali图像型细胞仪进行细胞活力和荧光表达检测。

基于图像的 Tali 细胞仪评估 GFP 表达与细胞活力

单细胞和群体信息通常通过流式细胞术或荧光显微镜获得。然而，这两种方法所提供的……

本视频演示了使用基于成像的 Tally 细胞计数仪测定表达 GFP 的细胞活力的方法。将经 GFP 转导的细胞使用 Tally 活力检测试剂盒中的死细胞红色染料（含碘化丙啶）进行染色，所有死细胞均被染成红色；随后将细胞悬液移入 Tally 细胞分析载玻片中，并加载至细胞计数仪。该仪器采集并分析明场、红色荧光和绿色荧光图像，生成直方图以显示细胞数量、细胞大小、碘化丙啶荧光强度以及 GFP 荧光强度，结果可与传统流式细胞术进行比较。Tali 可提供与细胞活力和表达相关的类似数据。然而，这种基于图像的细胞计数技术可提供关于待测细胞群体的额外视觉信息。与现有的流式细胞术或荧光显微镜等方法相比，该技术的主要优势在于，Tali 基于图像的细胞计数仪可同时提供关于细胞样本的定量和视觉信息。此外，计数仪比流式细胞仪或荧光显微镜更易于使用、成本更低且占用空间更小。这使得研究人员能够在实验台上快速进行定量检测，例如对表达GFP的细胞进行活力分析。在此实验步骤中，将浓度为1 × 10⁶ 个细胞/毫升的U2 OS细胞用靶向细胞核的CellLight GFP病毒载体进行转导，以持续标记死亡细胞；随后加入碘化丙啶，将100 µL细胞悬液转移至新的微量离心管中。请注意，建议检测时细胞浓度为每毫升1×10⁵至1×10⁷个细胞，但浓度无需完全精确。接下来，加入1 µL的Tally Dead Cell Red试剂。然后短暂涡旋混匀，将染色试剂与细胞混合物在室温避光条件下孵育1至5分钟。孵育结束后，立即在基于计数图像的细胞计数仪上进行分析。该计数仪使用专为该仪器设计的一次性塑料细胞分析载片。加载载片时，务必始终捏住载片边缘。将25微升样品缓慢移液至其中一个半月形加样区域。此处，未染色的非转导对照细胞加样于A室，而染色的表达GFP的细胞加样于B室。如需在表达GFP的细胞中进行活力检测，请触控细胞仪主屏幕上的G-F-P-R-F-P。随后在右侧出现检测选项，选择GFP加活力检测。仪器将提示是否需要为样本系列命名。请按“立即命名”。然后使用触摸屏输入样本系列的名称，并按“保存”，计数仪将自动进入测量界面。接下来，为了测量背景荧光，请按下测量界面右下角的“背景”标签，如图所示。默认设置为将拍摄九个视野的细胞图像。现在，将对照样品朝向远离仪器的方向，将载玻片插入加载口直至无法继续推进。请勿用力按压背景屏幕以插入新的未染色细胞对照。载玻片将自动被拉入仪器中，细胞的实时图像将显示在屏幕上。使用调焦旋钮，在聚焦的同时将细胞调整至合适的观察平面。将红色缩放按钮滑动至 4 x 或 16 x。为了更清晰地观察细胞群体，细胞应呈现均匀的深色，每个细胞周围有明亮的光晕。如图所示，当背景与细胞边缘之间的过渡模糊，导致细胞边界不清晰时，可能导致细胞计数偏低。当细胞具有明亮的中心和较暗的边缘时，可能导致细胞计数偏高。一旦将细胞调至清晰对焦，轻触并按压以运行未染色细胞对照。为测量背景荧光，流式细胞仪将自动捕获图像，并显示每个视野的缩略图。进度条可实时更新分析进程。图像采集完成后，细胞仪会自动弹出载玻片，并提供对所采集图像的分析数据。存储的数据将显示在背景选项卡的下拉菜单中。背景对照样本将被赋予与实验相同的名称。要运行经PI染色的GFP转导样本，请将载玻片从仪器中取出，翻转后重新插入，使转导样本面背向仪器。按下样本标签，然后触摸按压以插入新样本。当图像出现在屏幕上时，使用调焦旋钮将细胞调至清晰。与之前相同，然后触摸按压以运行样本。图像采集完成后，分析数据将显示在样本标签下，细胞计数仪会自动适当地弹出载玻片。将计数细胞分析玻片作为生物危害性废弃物处理，这些玻片不可重复使用。样本运行完毕后，可对样本应用阈值。为了分析此处的特定细胞群体，我们将调整阈值以确定活细胞和死细胞的百分比。在样本标签页的 GFP 表达细胞中，将显示表达 GFP 的活细胞数量和百分比、表达 GFP 的死细胞数量和百分比、总活力。同时显示平均细胞大小、计数的细胞数量以及细胞浓度。此外，屏幕底部会显示细胞大小、绿色荧光和红色荧光的直方图。要设置细胞大小门控，请触摸细胞大小缩略图以打开细胞大小直方图，从而排除任何碎片。移动蓝色滑动条，以排除过大和过小的事件。点击以选中门控范围内的细胞。接下来，要将GFP荧光加入分析，请点击GFP直方图缩略图以打开它。移动蓝色滑块条，将阈值设置在最微弱峰的右侧。以对照样品作为参考。这样可使分析包含 GFP 阳性细胞，同时排除自发荧光细胞。当细胞内的生物分子被激发时，常会观察到自发荧光现象。轻触“确认”并返回上一屏幕。此时，样本标签页下显示的数据应已反映为两个荧光通道所设置的门控和阈值。接下来，为了将PI染色的细胞与样本中的自发荧光或任何背景信号区分开，可点击PI直方图缩略图以再次打开它。对照样品的峰将以灰色峰形显示在直方图上。红色峰代表样品的荧光信号。背景荧光在此仪器上显示为最接近零相对荧光单位（RFU）值的峰。为了消除 PI 通道中的背景荧光，请移动蓝色滑动条以调整阈值。为排除此峰，请以对照样本的灰色峰作为参考。当 PI 通道中的阈值设置适当时，点击“应用”以确认并返回上一界面，计数仪器将再次自动重新分析数据，并在样本标签页中更新结果。接下来，为了直观确认每个细胞都被正确分配，请按下缩放选项卡，然后通过点击图像的缩略图来选择一个已捕获的视野进行查看。接着按下图层选项卡。随后，按下 GFP 或 PI 按钮，以显示通过该通道捕获的图像。再次按下同一按钮可从显示中移除该图层，或叠加图层；触摸对应各通道的按钮，以确定细胞如何通过特定通道被计数。触摸仅通过明场通道计数的细胞，不表达荧光的细胞将以蓝色圈出。这表示特定细胞为在绿色通道中表达的活细胞。表达于红色通道中的绿色荧光蛋白将用绿色圆圈标出。经碘化丙啶染色的死亡细胞用红色圆圈标出，并在红、绿两通道中均被计数。红绿双通道信号重叠的细胞将用黄色圆圈标出。这表明该细胞表达GFP，但也被PI染色，因此是死亡细胞。偶尔屏幕上会出现黑色圆圈，这些是已被识别但根据细胞大小被排除在分析之外的物体。继续使用上述步骤微调荧光直方图的阈值，直到每个表达荧光的细胞都被相应颜色的圆圈标记为止。所有分析参数将自动保存至仪器中。位于数据选项卡下。该计数设备可存储500次样本运行的数据文件。数据标签页中存储的每个文件均可用于重新分析。通过从数据标签页中选择文件，即可重新打开，所有直方图和图层将恢复活动状态，以便归档数据并生成报告。可使用U盘将仪器中存储的数据传输至计算机。四种代表性细胞类型被转导了带有核靶向的CellLight GFP病毒载体，并用Tally活力检测试剂盒中的死细胞红色试剂染色，随后在此处所示的流式细胞仪中通过Tally系统进行分析。两种方法报告的每种细胞类型中表达GFP的细胞百分比相近，同时报告了总细胞群中既具有活力又表达GFP的细胞百分比。这些数据表明，Tali 流式细胞仪能够区分细胞群体中的总 GFP 表达与活细胞群体中的 GFP 表达。我们刚刚展示了如何使用 Tali 图像式细胞仪来评估细胞样品中的荧光表达和细胞活力。该技术弥合了单个细胞研究与群体细胞研究之间的差距。利用计数图像式细胞仪，您可以获取有关单个细胞以及更大细胞群体的定量和定性视觉信息。采用相同流程，还可进行多种其他检测，包括细胞凋亡、RFP 表达和细胞活力检测。对于不表达特定标记的细胞，其潜在应用包括基因表达分析以及药物疗效研究。

assessment-gfp-expression-viability-using-tali-image-based

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

GFP的表达和使用的大里基于图像流式细胞仪的可行性评估

我们报道了一种在植物细胞中引入、追踪和定量分析GFP表达的方法。该方法利用自行设计的机器人系统，对大量样品进行随时间推移的半连续图像采集。我们还展示了使用ImageJ和ImageReady对图像序列进行分析的方法。...

用于植物组织基因表达研究的机器人技术与动态图像分析

本方案描述了如何利用基于FRET的邻近检测技术对蛋白质-蛋白质相互作用进行成像。...

蛋白质-蛋白质相互作用成像 体内

活细胞周期分析方案 果蝇 使用Attune声学聚焦流式细胞仪对组织进行分析的方法被描述。该方案可同时提供有关相对细胞大小、细胞数量、DNA含量以及通过谱系示踪或组织特异性荧光蛋白表达鉴定细胞类型的信息。 体内.

活细胞周期分析 果蝇 使用Attune声学聚焦流式细胞仪和Vybrant DyeCycle Violet DNA染料进行组织分析

复杂的组织团块，从器官到肿瘤，均由多种细胞成分构成。我们利用多重荧光标记的转基因小鼠，结合多参数免疫荧光染色及光谱解混技术，解析了组织内不同细胞表型的贡献，从而根据蛋白质表达情况确定细胞来源及其特性。...

荧光组织移植后用于可视化细胞来源、类型及相互作用的定量多光谱分析

本文展示了如何利用图像细胞计量技术对与培养中宿主细胞相关的致病性真菌进行定量分析。该技术可作为菌落形成单位（CFU）计数的替代方法。...

使用图像流式细胞术定量与宿主细胞相关的致病性真菌

本文展示了一种灵活的信息学工作流程，可实现对荧光标记细胞的多重基于图像的分析。该工作流程可定量分析细胞核和细胞质标志物，并计算这些标志物在不同区室间的转位情况。文中提供了利用siRNA对细胞进行扰动的实验步骤，以及在96孔板体系中通过间接免疫荧光法可靠检测标志物的方法。...

基于开源软件的通用显微镜数据中荧光标记物高内涵单细胞定量分析工作流程

在亚细胞水平上，信号事件受到发育和环境线索的动态调控。本文介绍了一种利用烟草瞬时表达系统监测蛋白质-蛋白质动态相互作用，并揭示植物细胞中信号转导空间组织的实验方案。...

利用烟草瞬时表达系统成像MAPK信号通路的空间重排

我们介绍一种开源的高内涵分析（HCA）仪器，该仪器利用自动化的荧光寿命成像（FLIM）技术，通过基于荧光共振能量转移（FRET）的检测方法来分析蛋白质相互作用。openFLIM-HCA 仪器的数据采集由基于 µManager 编写的软件控制，数据分析则在 FLIMfit...

利用自动荧光寿命成像显微镜的开源高内涵分析

活细胞成像能够提供单个细胞或整个细胞群体的丰富信息，而这些信息仅通过固定细胞成像无法获得。本文描述了在使用抗有丝分裂药物紫杉醇处理后，通过活细胞成像技术评估细胞命运决定的实验方案。...

长期活细胞成像评估细胞对紫杉醇处理的细胞命运响应

我们描述了一种利用基于GFP重组的方法，在活体果蝇翅成虫盘中测量相邻上皮层细胞间接触的实验方案。...

基于GFP互补的双表达系统用于活体评估由细胞突起介导的细胞间接触 果蝇 翅成虫盘

学习使用Tali图像流式细胞仪评估GFP表达细胞的存活率。该方法结合定量数据与可视化图像，为细胞生物学研究提供经济高效的台式分析方案。

基于图像的 Tali 细胞仪评估 GFP 表达与细胞活力

探索更多视频