一种基于 GFP 互补的双表达系统，用于评估活果 蝇 翅假想盘中细胞介素介导的细胞间接触
2025年8月22日
我们描述了一种协议，用于使用基于GFP重建的方法测量活果蝇翅假想盘中相邻上皮层细胞之间的接触。
因此，我们的研究重点是了解组织中远距离的细胞如何相互交流。我们使用果蝇翅想象盘作为模型系统，试图了解胞苷是如何形成的，它们如何发挥作用，以及它们在局部控制组织生长中发挥的作用。研究表明，生长因子通常通过专门的细胞投射，如基于肌动蛋白的信号传导丝状伪足，称为细胞介素，以便被输送到靶细胞。
细胞介素是非常薄且脆弱的结构，很容易被固定方案破坏。要观察它们，您需要使用专用的实时成像方法和表达的荧光标记蛋白。这极大地限制了我们可以用来调查它们的工具和方法。
我们鉴定出一种名为 Slik 的蛋白激酶，它参与细胞介素生物发生。Slik 在翼假想盘的一个硬膜外层中的表达会触发穿过椎间盘腔的细胞介素的形成，并刺激邻近上皮层细胞的增殖。未来，我们希望确定作用于 Slik 下游以促进细胞介素形成的蛋白质，确定通过该细胞介素递送以促进穿孔的配体，并更好地了解该机制在控制组织生长方面的生理重要性。
首先，用剪刀从八孔条上切下单个孔，然后将每个孔切成两半。从每一半的一侧取下保护背衬，并将垫片粘贴到显微镜载玻片上，将它们稍微分开，以创建一个用于放置光盘的受保护的中央空间。在基因杂交和 25 摄氏度孵育后，从饲养管中挑选游荡的三龄幼虫。
在解剖显微镜下，将幼虫转移到涂有硅胶的培养皿上的一滴活成像介质中。使用两个解剖镊子，用一对镊子捏住幼虫，使其从前部约 1/3 体长处保持稳定，从而开始解剖。用第二对，捏住身体在第一点的后方，然后拉动以分开后半部分，隔离前部。
用镊子夹住切口端的两侧，然后使用第二对镊子将头部推过，将其翻过来，将前半部分倒置。这暴露了内部结构，例如假想盘、气管、唾液腺、脂肪体和肠道。使用镊子去除唾液腺、脂肪体和肠道，注意不要干扰覆盖翼盘的外侧气管干。
使用镊子，将带有翼盘的清洁前半部分转移到一滴干净的活成像介质中，并在载玻片垫片之间放置挂钩。要隔离翼盘，请用解剖镊子的一个刀片或安装在解剖针架上的细钨丝轻轻地将它们从细气管分支上解剖。丢弃剩余的胴体。
使用解剖镊子刀片或钨针定向翼盘，使足膜面朝上。调整中等音量，使其稍微溢出间隔液位上方的井。从成像垫片上取下顶部保护背衬，然后轻轻地将盖玻片放在样品上。
使用镊子的圆形端将盖玻片压在间隔器接触点处，以确保适当的粘合。要在 ImageJ 中投影图像堆栈，请选择“图像”，然后选择“堆栈”，然后选择“Z 项目”，然后从菜单中选择“最大强度”。在最大强度投影图像中，使用钩通道和多边形选择工具根据翼盘折叠图案识别翼袋区域。
将相同的选择应用于 GFP 通道，然后选择“编辑”，然后选择“清除外部”以消除所选区域之外的噪点。使用最大强度投影图像中的钩子通道来识别 GFP 图像中的伪影点。然后，使用多边形选择工具选择该区域。
单击“编辑”，然后选择“清除”。在清理后的最大强度投影图像中，选择“分析”，然后选择“直方图”，然后选择“列表”以获取所有像素值。将此列表复制到电子表格中。
要设置阈值，请分析阴性对照样品中的背景信号，并使用其他样品图像确认该值。通过将高于阈值的像素数除以有效像素总数并将结果乘以 100 来计算 GFP 阳性表面的百分比。最后，将每个计算值除以参考条件的平均值（设置为 1）后对其进行归一化。
在缺乏两种分裂的 GFP 成分的野生型圆盘中，仅在翼袋中心附近观察到最小的颗粒状 GFP 自发荧光，该基线信号用于定义荧光阈值。在圆盘适当层中仅表达 CD4 分裂 GFP1-10 的圆盘显示出与野生型无法区分的荧光水平，证实了单独 GFP1-10 的非荧光性质。CD4 分裂 GFP1-10 在椎间盘内和 CD4spGFP11 在足周膜中的共表达导致位于椎间盘腔的离散、明亮的 GFP 斑点显着增加，高于阈值的荧光阳性区域明显大于对照组。
椎间盘内的 Slik 表达导致足周膜核密度的强烈增加和整个翼袋区域的 GFP 信号强度的急剧增加，表明 Slik 诱导的细胞介素与足周膜细胞建立了增强的接触。
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概述
本研究提出了一种测量活体果蝇翅膀想象盘中相邻上皮层细胞之间接触的协议。该方法利用基于GFP重组的方法来可视化细胞相互作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 发育生物学
- 活体成像技术
背景
- 理解组织中的细胞通信对发育生物学至关重要。
- 果蝇翅膀想象盘是研究这些相互作用的有效模型。
- 细胞腋突是促进远距离细胞之间通信的专门的细胞投射。
- 活体成像对于观察细胞腋突等脆弱结构而不破坏它们是必要的。
研究目的
- 调查生长因子如何通过细胞腋突传递到目标细胞。
- 开发一种观察活体组织中细胞接触的可靠方法。
- 增强对组织生长调节的理解。
使用的方法
- 基于GFP重组的成像技术。
- 果蝇翅膀想象盘的活体成像。
- 用于可视化细胞结构的荧光标记蛋白。
- 旨在最小化破坏脆弱细胞投射的协议。
主要结果
- 成功可视化活体果蝇组织中的细胞腋突。
- 证明了细胞腋突在生长因子传递中的作用。
- 提供了对上皮层细胞通信机制的洞察。
- 建立了一个可以应用于其他细胞相互作用研究的协议。
结论
- GFP重组方法有效用于研究活体组织中的细胞接触。
- 理解细胞腋突功能对于组织生长控制的洞察至关重要。
- 这种方法为细胞通信的未来研究开辟了道路。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of cell-cell contact via cytoneme-mediated signaling in live Drosophila tissues addresses a critical gap in understanding direct intercellular communication mechanisms. This dual-expression GFP complementation system enables precise measurement of contact-dependent signaling events, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking at early discovery stages. The approach is adaptable for dissecting pathway-specific interactions and evaluating genetic or pharmacological perturbations in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct quantification of contact-mediated signaling between defined cell populations.
- Supports functional validation of candidate genes or pathways involved in cytoneme formation and signaling.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating the effects of specific genetic or RNAi perturbations on cell-cell contact.
- Provides a platform for hypothesis-driven interrogation of intercellular communication mechanisms.
Screening & Assay Development
- Establishes a live imaging assay with quantitative GFP readouts for screening modulators of cytoneme-mediated contact.
- Enables reproducible measurement of fluorescence intensity and contact area for robust assay standardization.
- Supports scalability and adaptation to other tissues or model systems for broader screening applications.
- Delivers quantitative outputs suitable for comparative analysis across experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by enabling manipulation and measurement of signaling pathways in vivo.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by supporting functional studies of candidate targets.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions based on quantitative assessment of pathway engagement.
- Offers predictive de-risking for targets implicated in tissue growth and patterning.
Pipeline & Workflow Integration
This dual-expression GFP complementation system integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, where direct measurement of cell-cell contact is required.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying cytoneme-mediated contacts.
- Screening: Provides assay readiness and reproducibility with quantitative fluorescence outputs.
- Analytics: Enables statistical comparison of contact area and intensity across genetic or pharmacological conditions.
- Translational Research: Connects mechanistic findings in Drosophila to broader tissue growth and signaling paradigms.
- Enterprise Reuse: Adaptable for use in other tissues or model organisms to interrogate conserved signaling mechanisms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in cell signaling studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable live imaging assays for cell-cell contact quantification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early de-risking of candidate pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of targets with validated intercellular signaling roles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live imaging, Drosophila genetics, and quantitative image analysis.
- Needs confocal microscopy infrastructure and computational tools for fluorescence quantification.
- Demands cross-team standardization of imaging and analysis protocols for reproducibility.
- Adaptable to other tissues or model systems with appropriate genetic tools.
- Limited by the need for live tissue handling and potential tissue-specific constraints.
