Name: 一种基于 GFP 互补的双表达系统，用于评估活果 蝇 翅假想盘中细胞介素介导的细胞间接触 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-22T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 了解基于GFP互补的活体成像技术，用于观察果蝇翅假想盘中细胞间接触和细胞素介导的细胞通讯机制。该方法为发育生物学研究提供了可靠的实验方案。

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本工作获得了加拿大卫生研究院（CIHR）基金（PJT-162109）对 D.H. 的资助。M.J. 获得了蒙特利尔临床研究所基金会和蒙特利尔大学分子生物学项目提供的博士奖学金。作者们衷心感谢 IRCM 显微镜与成像平台提供的技术支持。

使用nubbin-GAL4驱动子在背前翅囊（DP）的翅囊区域特异性表达CD4-spGFP1-10（图1A）。使用PerM-LexA驱动子21在PerM中特异性表达CD4-spGFP11（图1A）。这两种表达系统彼此独立，可在DP和PerM中同时且特异地表达不同的转基因（图1B、C）。
基本的遗传方案包括杂交果蝇以产生基因型为 nub-GAL4/UAS-CD4-spGFP1-10;PerM-LexA/LexAop-CD4-spGFP11 的幼虫。作为阴性对照，我们省略 LexAop-CD4-spGFP11 转基因。其他转基因（例如编码蛋白质的基因、双链RNA）可根据需要在DP层（由 UAS 序列控制）或在PerM细胞（由 LexA operator 控制）中表达。
这是一项不能中断的活体成像实验方案。材料准备时间约为10分钟。每次成像前，解剖操作不应持续超过20分钟。成像过程约需30分钟，总时长不应超过约1小时。对于多种实验条件或大量样本，必须分多轮进行操作，以确保获得最佳结果。
1. 材料准备
<ol>
	<li>解剖前，用70%乙醇清洁镊子、9孔玻璃凹面载片（或其他适合收集和清洗幼虫的容器）以及用于解剖的可重复使用的Sylgard（硅胶）包被培养皿。</li>
	<li>通过70%乙醇清洗显微镜载玻片，然后将成像间隔片粘贴到干燥的载玻片上。用剪刀从8孔条带上剪下单个孔，并将其剪成两半（图2A）。移除每半个间隔片一侧的保护背衬，并将间隔片粘贴到载玻片上，彼此稍留间距，以便在中间形成一个受保护的空间，用于放置组织样本（图2B）。 
	注意：根据我们的经验，这种方法简化了样品的装载过程，因为转移到载玻片上的培养基体积无需非常精确。盖上盖玻片时，任何少量多余的液体都会从间隙中流出。由于我们通常仅进行较短时间的成像（一般约1小时），未观察到培养基干燥的问题。</li>
	<li>将活体成像培养基（未添加补充物的Schneider's Drosophila培养基，以10 mL分装液冷冻保存）解冻，并置于冰桶中随时取用。</li>
	<li>在2 mL微量离心管中，将1.5 mL培养基与20 µL的200 µg/mL Hoechst 33342混合（终浓度为2.7 µg/mL）。将该管置于冰上保存。 
	注意：选用这种特定形式的Hoechst染料是因为其具有高度细胞膜通透性。警告：操作Hoechst 33342时应佩戴手套，使用后的工具应及时清洗。</li>
</ol>
2. 翅盘解剖与玻片制备
<ol>
	<li>在25°C条件下进行遗传杂交并培育后，从管中挑选出爬行的三龄幼虫，并将其在9孔玻璃凹面载片的冷活体成像培养基中清洗。 
	注意：细胞突（cytonemes）极为脆弱。在后续步骤中，应小心操作围绕着器官原基（discs）的组织，尽量避免器官原基与解剖工具直接接触。我们每次准备三到四只幼虫，因为部分器官原基的损伤难以避免，且这种损伤可能直到成像阶段才会被发现。</li>
	<li>在解剖显微镜下，将幼虫转移至涂有硅酮的培养皿中的一滴活体成像培养基内，并使用两把解剖镊开始解剖。操作时，先用一把镊子夹住幼虫身体前段约三分之一处（从前端算起），固定其头部和前部体节；再用第二把镊子夹住第一把镊子后方稍靠后的部位，然后向后拉动幼虫的后半部分，以分离出前“半”部分。</li>
	<li>用一把镊子夹住前半部分切口两侧将其固定，再用另一把镊子将头部推过切口，从而将前半部分翻转（类似于将袜子内翻），以暴露内部结构，包括成虫盘（imaginal discs）、气管、唾液腺、脂肪体和肠道。</li>
	<li>小心移除唾液腺、脂肪体和肠道，注意不要扰动气管的侧主干，这些主干应覆盖在翅盘（wing discs）上方并起到保护作用。</li>
	<li>使用镊子小心地将附有翅盘的清洁前半部分转移至已放置在载玻片间隔物之间的含Hoechst染料的新鲜活体成像培养基液滴中（图2C）。利用解剖镊的一侧刀刃或固定在解剖针 holder 上的细钨丝，轻轻钝性分离连接翅盘的气管细支，从而将翅盘与其他组织分离。其余组织残体弃去。</li>
	<li>使用解剖镊的一侧刀刃或钨丝解剖针调整翅盘的方向。由于其扁平的泪滴状外形，翅盘自然落下时可能以背前区（DP）或周边区（PerM）朝上。本方案中，应将所有翅盘调整为PerM面朝上。</li>
	<li>通过添加或移除培养基，调节液体体积，使凹槽完全充满，并略高于成像间隔物的水平。撕去成像间隔物上半部分的保护背衬，然后小心地将盖玻片覆盖在样品上方。在盖玻片与成像间隔物接触处轻轻按压（例如使用解剖镊的圆头端），确保盖玻片牢固粘附于间隔物上。 
	注意：培养基液面应略高于间隔物高度，以避免夹入气泡，但也不能过高，以免盖上盖玻片时产生明显液体流动。</li>
</ol>
3. 成像
<ol>
	<li>使用配备40倍/1.30数值孔径油浸物镜和显微成像软件的共聚焦显微镜（GFP采用488 nm波长的氩离子激光，Hoechst采用350 nm波长的紫外激光），在室温下对样品进行成像。采集图像堆栈时，步进尺寸为1 µm，范围从PerM最高层上方（Hoechst荧光消失处）至DP基底侧，通常每个堆栈需采集超过100张图像。重复采集图像堆栈以生成延时视频。 
	注意：我们对一张载玻片的成像时间通常不超过约1–2小时。</li>
	<li>显微镜软件设置方面，使用8位编码、2次线平均、探测器增益通常设置在650至750之间，并采用分通道采集以减少信号串扰。所有实验条件均使用相同的激光和探测器设置，这些参数需在正式实验前通过各条件的预实验预先确定。 
	注意：在40倍放大倍数下，我们的图像分辨率为每微米5.0386像素（像素尺寸：0.1985 × 0.1985 µm2）。在我们的系统中，最佳共聚焦显微镜设置包括在不损伤组织的前提下使用尽可能高的激光强度，以捕获尽可能多的信号，同时避免明显饱和；并通过降低探测器偏移和采集速度（必要时）使阴性对照中的噪声尽可能低。我们通常使用低于5%的激光功率和最大扫描头速度（Zen软件设置中的“9”）。单个图像堆栈的采集时间通常约为1分45秒，延时分析时每2–3分钟采集一次图像。</li>
</ol>
4. 图像分析
<ol>
	<li>使用 ImageJ 软件包的最大强度投影功能对图像堆栈进行投影（点击图像 | 堆栈 | Z 投影，在菜单中选择最大强度）。</li>
	<li>在最大强度投影（MIP）图像中，根据 Hoechst 通道显示的翅盘折叠模式，使用多边形选区工具确定翅囊区域。将相同的选区应用于 GFP 通道，并使用清除外部功能（点击编辑 | 清除外侧），将选区外所有像素值设为 0。</li>
	<li>在 MIP 图像中，利用 Hoechst 通道对 GFP 图像进行去噪处理，具体操作为：针对在两个通道中均出现的伪影斑点，使用多边形选区工具选中后，通过点击编辑 | 清除将对应像素值设为 0。</li>
	<li>在已清理的 MIP 图像中，使用直方图功能（点击分析 | 直方图 | 列表）获取所有像素值的列表，并将其复制到电子表格中的表格内。</li>
	<li>根据阴性对照中背景信号的分析结果设定阈值（随后在其他样本中验证；参见讨论部分）。</li>
	<li>使用以下公式计算 GFP 阳性表面积的百分比： 
	%GFP 阳性表面积 = <img alt="用于计算像素阈值比的分数公式；图像分析方法。" src="/files/ftp_upload/68411/68411eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="公式 1"> × 100</li>
	<li>最后通过将每个数值除以参照条件的平均值（设为 1）对数据进行归一化处理。 
	注：有效像素指像素值 ≥ 1 的像素，从而有效忽略所有已被删除且像素值设为 0 的像素。像素值为 0 的情况在自然状态下不会出现。</li>
	<li>为确定重建的 GFP 信号在翅盘中的定位位置，可对图像堆栈进行 XZ 切片，以观察盘上皮的顶-基底轴方向。在 Fiji 中执行切片时不要使用插值，并通过缩放功能采用双线性插值增加 Z 轴方向的图像高度，以提高可视性。</li>
</ol>

<ol><li>Ng, J. K., Tamura, K., Buscher, D., Izpisua-Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+basis+of+pattern+formation+during+vertebrate+limb+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular basis of pattern formation during vertebrate limb development.</a> Curr Top Dev Biol. 41, 37-66 (1999).</li>
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</ol>

作者声明无竞争利益。

细胞突起在配体分布中发挥重要作用，调控发育组织的生长与结构。信号交换发生在细胞突起末端与其靶标形成紧密膜接触的位置。在本方案中，我们描述了一种利用GRASP技术分析翅盘上皮层之间由细胞突起介导的接触的简单方法。
本文所述技术至少需要四个组分：一种GAL4驱动系统、一种LexA驱动系统，以及两种分别在UAS和LexAop调控下编码互补spGFP片段与CD4融合蛋白的转基因。我们使用所选驱动系统表达任一CD4-spGFP蛋白时，均未检测到明显的表型效应或致死性。因此，有可能构建一种稳定包含全部四个组分的通用驱动品系。该品系可与携带任意组合的其他UAS和LexAop转基因品系进行杂交，以操控DP和/或PerM细胞中的基因表达，进而检测其对细胞突触接触形成的效应。在构建品系过程中（特别是在构建携带两个组分的重组染色体时），可能需要单独检测其中一个互补spGFP片段的表达。我们使用的抗GFP抗体似乎无法在经多聚甲醛固定的组织盘中检测到spGFP1-10蛋白。然而，已有可检测该蛋白的抗体上市。发育研究杂交瘤库（Develo...

胚胎组织的发育由位于“组织中心”的细胞所控制，这些细胞向组织内远距离的细胞发出信号，调控它们增殖（即生长和分裂）或分化为特定命运的决定1。这种细胞非自主性信号传递由组织中心细胞产生的配体介导，这些配体在组织中形成浓度梯度，并引发浓度依赖性的细胞反应。在许多情况下，这些配体通过基于肌动蛋白的长丝状突起——即连接信号发送细胞与接收细胞的丝状伪足（cytoneme）——进行递送或摄取2,3。cytoneme最初在黑腹果蝇（Drosophila）的翅成虫盘中被发现4，随后也在哺乳动物及其他脊椎动物中得到鉴定5,6,7,8,9。目前对cytoneme在细胞非自主性信号传递中作用的理解尚处于早期阶段，但深入研究对于揭示细胞如何通过通讯形成组织，以及这些通讯通路在包括发育畸形和癌症在内的多种病理状态下如何被改变，具有重要意义。
细胞突起（cytoneme）可从信号源细胞延伸，将配体递送至靶细胞，也可从靶细胞延伸，以在其信号源附近接收配体2,3。细胞突起与其靶标形成紧密接触，被认为可构建类似突触的结构，从而实现配体的转移3,10,11。此类接触可发生在信号源细胞与靶细胞的细胞突起顶端之间，也可发生在细胞突起与细胞体之间3。尽管尚未被充分表征，但在某些情况下，通过黏附分子或受体-配体相互作用介导的细胞黏附对于下游信号事件的正常激活是必需的12,13,14，因此这是细胞突起生物学中的一个重要方面。
多项研究已将&#34;突触伙伴间绿色荧光蛋白重构&#34;（GRASP）技术应用于细胞突起接触的分析。该方法最初用于在复杂的神经系统中识别和绘制突触伙伴15。其原理是在不同细胞群体中分别表达分裂型绿色荧光蛋白（spGFP1-10 和 spGFP11）的两个互补片段，每个片段均与跨膜结构域（例如 CD4 的胞外区）的胞外区域融合。当这两个细胞群体的质膜发生直接接触时，spGFP 的互补片段将被带入空间邻近状态，从而重建 GFP 荧光。该方法已在Drosophila中用于鉴定翅盘内细胞之间以及翅盘与其他邻近组织之间的细胞突起接触的存在12,16,17,18,19,20,21。
本文描述了GRASP技术在果蝇翅成虫盘两个形态不同的上皮层——盘本体（DP）和周膜（PerM）之间接触关系表征中的应用。这两个上皮层构成一个围绕中央腔的囊状结构，其中一侧为假复层柱状的DP细胞，另一侧为扁平的PerM细胞，两者的顶膜均朝向内侧腔面（图1A）。已有研究提示这两层之间存在跨腔信号交流22,23,24,25，我们近期还报道了DP通过其顶膜细胞突起（cytonemes）向PerM细胞传递信号以调控其增殖的过程21。本实验方案利用GAL4/UAS和LexA/LexAop转基因表达系统，在DP和PerM细胞的细胞膜上分别表达与CD4融合的spGFP互补片段，通过重构的GFP荧光信号来检测两个细胞群体之间的膜接触情况。

<table><tbody><tr><td>Discovery V12 解剖显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td>解剖显微镜</td></tr><tr><td>Dumont #55 镊子，生物用尖头</td><td>精细科学工具公司（Fine Science Tools）</td><td>11255-20</td><td>解剖镊</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;EP-Slik (slik&lt;sup&gt;20358&lt;/sup&gt;)&lt;/em&gt;</td><td>BDSC</td><td>Panneton 等，2015&amp;nbsp;</td><td>用于表达 Slik 的果蝇品系</td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td>Schindelin J. 等（2012）&amp;nbsp;</td><td>图像分析软件</td></tr><tr><td>Hoechst 33342&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技公司（ThermoFisher Scientific）</td><td>H3570&amp;nbsp;</td><td>活体成像核染色剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;LexAop-CD4-spGFP11&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td>BDSC</td><td>93018</td><td>果蝇品系</td></tr><tr><td>LSM 700 共聚焦显微镜&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td>共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;nub-GAL4&lt;/em&gt;</td><td>布卢明顿果蝇资源中心（Bloomington Drosophila Stock Centre, BDSC）</td><td>86108</td><td>果蝇品系</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;PerM-LexA&lt;/em&gt;</td><td></td><td>Rambaud, Joseph 等，2025</td><td>果蝇品系</td></tr><tr><td>PYREX 9孔玻璃培养皿</td><td>康宁生命科学公司（Corning Life Sciences）</td><td>7220-85</td><td>用于收集和清洗幼虫</td></tr><tr><td>Schneider's 果蝇培养基</td><td>赛默飞世尔科技公司（ThermoFisher Scientific）</td><td>21720024</td><td>活体成像培养基</td></tr><tr><td>SecureSeal 成像间隔片，8孔，0.12 mm 厚&amp;nbsp;</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>654008</td><td>间隔片</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 硅酮弹性体试剂盒</td><td>Sylgard</td><td>3097358-1004</td><td>用于制作解剖板</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-CD4-spGFP1-10&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td>BDSC</td><td>93017</td><td>果蝇品系</td></tr><tr><td>Zen Black</td><td>Zeiss</td><td></td><td>图像采集软件</td></tr></tbody></table>

基于gfp互补的双表达系统用于活体评估由细胞突起介导的细胞间接触 果蝇 翅成虫盘

A GFP Complementation-based Dual-expression System for Assessing Cell-Cell Contact Mediated by Cytonemes in Live Drosophila Wing Imaginal Discs

胚胎组织的生长和图式形成主要由组织内部细胞群体之间局部交换的信号所控制。细胞突起&#160;是一类信号传递性丝状伪足，最初在果蝇中被发现，可连接信号产生细胞与信号接收细胞并介导二者之间的信息交换。在发育中的果蝇翅成虫盘中，细胞突起参与盘上皮（DP）上皮内不同细胞群体之间的信号交换，这些细胞将形成成体翅结构，同时也参与DP细胞与邻近盘相关组织细胞之间的信号交流。细胞突起通过与靶细胞形成突触样结构，建立紧密的膜接触。
本文介绍了一种利用活体翅成虫盘中绿色荧光蛋白（GFP）重组方法，定量分析毛囊乳头细胞（DP细胞）与相邻浆膜上皮（PerM）细胞之间通过细胞突起（cytoneme）介导的接触的实验方案。该方法中，DP细胞与PerM细胞被成虫盘腔（disc lumen）分隔。利用GAL4-UAS和LexA-LexAop系统，将分裂GFP的互补片段（spGFP1-10和spGFP11）分别与CD4跨膜结构域融合，并表达于成虫盘腔的两侧。通过共聚焦显微镜对活体翅成虫盘样本进行成像，获得图像堆栈，从而定位并定量重组GFP的荧光信号。利用该系统，可在产生细胞突起的细胞或靶细胞中共同表达编码蛋白的转基因或RNA干扰转基因，以评估其对DP-PerM细胞间接触的影响。该系统可便捷地推广至其他组织，因而有助于鉴定在细胞突起形成或功能中起重要作用的分子因子。

为了检验GRASP技术在检测DP细胞与PerM细胞之间接触方面的有效性，我们观察了四种不同基因型的翅成虫盘：野生型阴性对照成虫盘（基因型：w1118），其在GFP通道中仅显示背景水平的自发荧光；在DP层表达CD4-spGFP1-10但缺乏CD4-spGFP11转基因的成虫盘，用于显示仅由GFP1-10产生的荧光水平（我们预期该水平可忽略不计，因为GFP1-10本身不应产生荧光26）；在DP和PerM细胞中分别表达CD4-spGFP1-10和CD4-spGFP11的成虫盘（图3A），用于揭示DP与PerM细胞之间“正常”接触水平；以及在DP细胞中除表达CD4-spGFP1-10和CD4-spGFP11外，还在UAS调控下表达Ser/Thr蛋白激酶Slik的成虫盘。DP细胞中Slik的表达可驱动PerM细胞的非自主性增殖27，同时诱导DP细胞形成顶端细胞突起（apical cytonemes），这些突起可穿越成虫盘腔并与PerM细...

我们描述了一种利用基于GFP重组的方法，在活体果蝇翅成虫盘中测量相邻上皮层细胞间接触的实验方案。

基于GFP互补的双表达系统用于活体评估由细胞突起介导的细胞间接触 果蝇 翅成虫盘

胚胎组织的生长与图式形成主要由组织内部细胞群体之间局部交换的信号所调控。

因此，我们的研究重点是理解组织中相距较远的细胞如何相互交流。我们以果蝇翅成虫盘作为模型系统，试图阐明细胞突起（cytoneme）的形成机制、功能及其在局部调控组织生长中所起的作用。研究表明，生长因子通常通过一种基于肌动蛋白的特殊细胞突起——即称为细胞丝状伪足（cytoneme）的信号传递结构——传递至靶细胞。细胞突起是非常纤细且脆弱的结构，容易受到固定方案的破坏。为了观察它们，需要使用表达荧光标记蛋白的专用活体成像方法。这极大地限制了我们可用于研究它们的工具和方法。我们鉴定出一种称为Slik的蛋白激酶，其参与了细胞突起（cytoneme）的生成。在翅成虫盘的某一上皮层中表达Slik，可触发形成跨越成虫盘腔的细胞突起，并促进邻近上皮层细胞的增殖。未来，我们希望鉴定出在Slik下游发挥作用以促进细胞突起形成的蛋白，鉴定通过该细胞突起传递以促进增殖的配体，并进一步阐明该机制在调控组织生长中的生理意义。首先，使用剪刀从八联排管中剪下单个孔，并将每个孔剪成两半。移除每半边一侧的保护背衬，然后将间隔物粘贴到显微镜载玻片上，间隔物之间稍留间距，以形成一个用于放置组织块的中央庇护空间。在完成遗传杂交并经25°C培养后，从培养管中挑选出爬行的三龄幼虫。在解剖显微镜下，将幼虫转移至涂有硅胶的培养皿中的一滴活体成像培养基内。使用两把解剖镊子，用其中一把镊子夹住幼虫头部起约三分之一体长处以固定幼虫；用另一把镊子在第一夹点稍后方夹住虫体，向后拉扯，分离后半部分，从而分离出前段组织。用镊子夹住切口端的两侧，再用另一对镊子将头部推入，使前半部分翻转，内外翻出。这样可暴露内部结构，如成虫盘、气管、唾液腺、脂肪体和肠道。用镊子去除唾液腺、脂肪体和肠道，注意不要扰动覆盖在翅盘上的侧支气管主干。用镊子将带有附着翅盘的清洁前半部分转移至一滴清洁的活体成像培养基中，将钩子置于载玻片间隔物之间。为分离翅盘，用解剖镊子的一侧刀刃或安装在解剖针持针器上的细钨丝，小心地将其从细微的气管分支中解剖下来。弃去剩余的尸体组织。使用解剖镊尖端或钨针将翅成虫盘调整至周围膜一侧朝上。调节培养基体积，使其略微高于隔片水平并充满小孔。取下成像隔片的顶部保护背衬，然后轻轻将盖玻片覆盖在样品上。使用镊子的圆头按压盖玻片在间隔物的接触点处，以确保充分粘附。在 ImageJ 中投影图像堆栈时，依次选择图像（Image）、堆栈（Stacks）、Z 投影（Z Project），然后从菜单中选择最大强度投影（Maximum Intensity）。在最大强度投影图像中，根据钩状结构通道的翅盘折叠模式，结合多边形选区工具，确定翅囊区域。对GFP通道应用相同的选区，然后依次选择“编辑”和“清除外部”，以消除选中区域外的噪声。利用最大强度投影图像中的hooks通道来识别GFP图像中的伪影斑点。随后，使用多边形选区工具选择该区域。单击编辑并选择清

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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基于GFP互补的双表达系统用于活体评估由细胞突起介导的细胞间接触果蝇翅成虫盘

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