Name: 开源高内涵分析利用自动荧光寿命成像显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 了解开源高内涵分析技术，利用自动荧光寿命成像显微镜检测固定或活细胞中的蛋白质相互作用。该方法通过FRET读数提供稳健的定量数据，助力药物发现研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者们衷心感谢来自英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSRC BB/E003621/1、BB/H00713X/1 和 BB/M006786/1）、英国技术战略委员会（技术奖项 CHBT/007/00030、EP/C54269X，与阿斯利康、GE 医疗、葛兰素史克、Kentech Instruments Ltd 合作）以及惠康基金会（WT 095931/Z/11/Z）的资助。FG 感谢英国工程与物理科学研究理事会（EPSRC）提供的博士生奖学金。DA、DK 和 SW 感谢由工程与物理科学研究理事会（EPSRC）资助的化学生物学研究所博士培训中心提供的博士生奖学金。

1. 多孔板阵列的制备
<ol>
	<li>配制75 μM Coumarin 6的乙醇溶液（τ ~ 2.43 ns），用于参考测量，以确定t0。</li>
	<li>将150,000个Cos细胞接种至6孔板的四个孔中，加入培养基过夜培养使其贴壁（参见材料清单）。</li>
	<li>使用商用转染试剂，按照生产商说明书分别对四个孔中的细胞转染mTq5A、mTq5V、mTq17V和mTq32V，并继续培养24小时。</li>
	<li>按照生产商方案，使用商用胰蛋白酶/EDTA溶液消化细胞使其脱离。</li>
	<li>将表达mTq5A的Cos细胞（5,000个）重悬于Hank's平衡盐溶液（HBSS）中，每孔加入至已用多聚-L-赖氨酸处理过的#1.5厚度玻璃底96孔板的A1-G3孔；同法将表达mTq5V的细胞加入A4-G6孔，表达mTq17V的细胞加入A5-G9孔，表达mTq32V的细胞加入A10-G12孔。</li>
	<li>保持H1孔为空（用于检测多孔板本身的静态背景信号）。</li>
	<li>向H2孔中仅加入200 µL HBSS（用于检测细胞培养基可能产生的背景信号）。</li>
	<li>向H3孔中加入5,000个未转染的细胞悬液（HBSS中）（用于检测细胞自发荧光可能产生的背景信号）。</li>
	<li>向H4孔中加入200 µL 75 μM Coumarin染料溶液（用于监测多孔板检测过程中t0的可能变化，例如由于环境温度变化或激光器及计时电路波动所致）。</li>
</ol>
2. openFLIM-HCA 数据采集
注意：详细信息可在 openFLIM-HCA 维基上找到33。
<ol>
	<li>开始 µManager 以及 OpenFLIM-HCA 插件</li>
	<li>选择适用于特定延迟发生器单元与激光重复频率组合的校准文件 &#34;FLIM 控制：延迟盒校准文件：校准文件&#34; .</li>
	<li>设置数据保存的文件夹位置 &#34;文件：设置基础文件夹&#34;.</li>
	<li>检查激发光光路，确保激发光稳定耦合至传输光纤，并通过功率计测量传输光纤输出的光功率，以最大化耦合效率。光功率波动低于5%为可接受范围。</li>
	<li>通过将GOI的输入触发信号作为示波器的触发源，同时显示GOI的监视器输出信号，来检测GOI触发是否稳定。</li>
	<li>通过遮盖GOI的光阴极，将其增益设置为750 V，并调节其中一个中继透镜的焦距，使CCD记录到的稀疏单光子事件（由背景光泄漏穿过GOI盖板引起）图像尽可能清晰，从而检查GOI磷屏在CCD传感器上的成像效果。</li>
	<li>通过成像均匀的荧光样品（例如盖玻片上的参考染料溶液液滴），使用足够低的激发光功率，检查样品视野是否 illumination 均匀&#60; 1 µW），以确保目的基因（GOI）未达到饱和状态。</li>
	<li>选择合适的平板定义文件， 即， 选择96孔板的选项（&#34;文件：加载板属性&#34;).</li>
	<li>使用 µManager GUI中，通过选择空位确保显微镜框架中无二向色分光立方体。</li>
	<li>在整个实验中，为 GOI 手动选择 4 ns 的门宽。</li>
	<li>获取IRF图像数据：
	<ol>
		<li>使用 µManager 图形界面中，通过选择空位确保光路中无显微镜物镜。手动将黑色阳极氧化光束挡板放置在物镜转换器上方，以防止激光逸出，并调整其角度以最小化反射回显微镜主体的光线。</li>
		<li>使用 µManager 图形用户界面，设置 CSUX 中的滤波器（激发，二向色镜，发射）调整至可成像来自旋转尼康夫盘的激发光散射部分，但需确保其强度在200 ms的CCD积分时间内不足以使系统饱和。这是为了避免对目标基因（GOI）光电阴极暴露过多光照，从而可能损伤光电阴极。</li>
		<li>使用 找到最大值点 在可编程快速延迟箱覆盖的整个延迟范围内进行功能检测。检查显示的输出图，然后按下前进按钮调节手动粗调延迟箱，使完整的IRF谱线位于快速延迟箱的扫描范围内。</li>
		<li>调整采集参数（中性密度，曝光时间，帧累积）以确保CCD在最亮的时间门内不发生饱和，且有效积分时间为 &#62;200 ms</li>
		<li>在整个延迟范围内设置25 ps的延迟步长（&#34;FLIM 控制：快速延迟盒：设置延迟&#34;).</li>
		<li>按下以获取IRF图像 &#34;Snap FLIM 图像&#34;.</li>
		<li>通过阻断激光获取背景图像（&#34;光路控制：中性密度：阻断&#34;），减少延迟次数（&#34;FLIM 控制：快速延迟盒：当前延迟设置（ps）&#34;），其余属性保持不变，然后按下 &#34;Snap FLIM 图像&#34;.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>获取参考染料数据：
	<ol>
		<li>使用以下方法选择 H4 孔 µManager 图形用户界面 (&#34;XYZ 对照：移至孔位：H4&#34;).</li>
		<li>使用 µManager GUI中，选择滤光片（激发光434/17 nm，二向色镜，发射光482/25 nm）以对mTqFP进行成像。</li>
		<li>使用 找到最大值点 在整个快速延迟箱的范围内进行调节，然后调整粗调延迟箱，使完整的衰减曲线位于快速延迟箱的延迟范围之内。</li>
		<li>将延迟调整至强度最大的位置 &#34;FLIM 控制：快速延迟盒：当前延迟设置（ps）&#34;. 调整采集参数（中性密度，曝光时间以确保CCD不饱和。</li>
		<li>在整个延迟范围内设置25 ps的延迟步长（&#34;FLIM 控制：快速延迟盒：设置延迟).</li>
		<li>按下以获取参考染料数据 &#34;Snap FLIM 图像&#34;.</li>
		<li>通过阻断激发激光（参见2.11.7）获取第二张背景CCD相机图像</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用FLIM技术获取多孔板样品的数据 µManager 采集软件：
	<ol>
		<li>设置需要成像的孔以及每孔采集的视野数（&#34;设置高内涵筛选的序列采集：XYZ位置&#34;).</li>
		<li>手动选择一个包含待成像样本的代表性视野（FOV）。利用该视野确定最佳中性密度滤光片、目标基因（GOI）的门宽以及相机的积分时间，以使CCD相机的动态范围达到其75%。</li>
		<li>设置自动对焦（&#34;XYZ 控制：自动对焦&#34;)：按压 &#34;仅返回焦点控制&#34;，然后手动聚焦到目标细胞或结构上。设置 &#34;自动对焦搜索范围&#34; 至2000 µm并按压 &#34;输入&#34;. 按压 &#34;心房颤动现在&#34; 以启动自动对焦程序。偏移值将显示在该字段中 &#34;焦平面偏移（自动对焦）&#34;.</li>
		<li>输入在 2.13.3 中获得的偏移值 &#34;AF偏移&#34; 并重复自动对焦程序两次（&#34;心房颤动现在&#34;检查偏移值是否已为零，以确认自动对焦系统的正常功能。</li>
		<li>使用 &#34;AutoGate&#34; 功能在 OpenFLIM-HCA 使用采集软件选择延迟点的对数采样。或者，也可手动选择这些点，详见参考文献36。</li>
		<li>设置 &#34;累积帧&#34; 以达到所需的目标总数据采集时间。增加累积帧数可提高荧光寿命成像（FLIM）数据的信噪比，但同时也会延长FLIM数据的总采集时间。</li>
		<li>通过按下按钮运行多孔板的荧光寿命成像（FLIM）采集 &#34;开始HCA序列&#34; 按钮</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用与FLIM数据采集相同的采集设置，通过阻挡激发激光（见2.11.7）获取另一幅背景CCD相机图像。</li>
</ol>
3. 使用 FLIMfit 进行 openFLIM-HCA 数据分析
<ol>
	<li>检查进行荧光寿命成像数据分析所必需的辅助文件是否齐全（即，IRF 和参考染料检测）。</li>
	<li>将空孔（H1）、含培养基的孔（H2）以及含未标记细胞的培养基孔（H3）的数据导入 FLIMfit&#34;文件：加载 FLIM 数据&#34;）以检查是否存在任何高于表达细胞信号1%的背景贡献 &#34;仅供者&#34;, 即， 在 A1-G3 孔中。</li>
	<li>通过将含有培养基的孔板加载到 FLIMfit&#34;文件：加载荧光寿命成像数据&#34;)加载第 2.14 节中获取的相机背景数据 (&#34;背景：加载背景&#34;) 并使用 FLIMfit 选项 &#34;工具：创建 TVB 强度图&#34; 以生成TVB。有关TVB的更多细节，请参见参考文献31。</li>
	<li>通过载入2.11节中获取的IRF数据并减去2.11.7节中获取的CCD相机背景，制备空间变化的IRF偏移图。使用 FLIMfit 选项 &#34;工具：创建 IRF 偏移图&#34; 用于计算空间变化的IRF偏移图。有关IRF偏移图的更多细节，请参见参考文献[31]。</li>
	<li>将单指数衰减拟合到 2.12 节中获取的参考染料数据。加载参考染料以及 3.4 节中计算得到的空间变化 IRF 图谱，设置拟合参数（&#34;寿命：实验编号：1&#34;) 与 t0 设为拟合参数（&#34;寿命：FIT IRF 位移：拟合&#34;）。该值的 t0 获得的结果随后呈现在下表所示的 &#34;参数&#34; 表。</li>
	<li>加载第2.13节中获取的实验FLIM数据、第3.4节中计算的空间变化IRF图、第2.14节中获取的相机背景、第3.3节中准备的TVB文件，并输入负值 t0 在第3.5节中获得（&#34;IRF：IRF 漂移：t0&#34;）。然后使用所需的衰减模型拟合实验数据 FLIMfit36 根据实验要求。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

我们介绍了一种用于时间门控荧光寿命成像显微镜（FLIM）高内涵筛选（HCA）的自动化多孔板显微镜。该仪器通过使用开源软件进行控制，软件以 µManager 可选择将数据保存至 OMERO 服务器，并使用以下方法进行 FLIM 数据分析 FLIMfit36, 一个用MatLab编写的开源程序，可作为OMERO客户端使用32 该 µManager 仪器控制软件 openFLIM-HCA，可在线获取33 包含系统组件列表48 使学术研究人员能够自行构建荧光寿命成像高内涵分析（FLIM HCA）仪器。
为了获得可靠的荧光寿命成像（FLIM）数据，必须优化感兴趣信号增益（GOI）和CCD采集参数，并考虑t0的任何变化。如3.8.2节所述，应设置GOI增益和CCD相机积分时间，使信号达到CCD动态范围的约75%。在每个时间门延迟处使用较高的GOI电压以及多次CCD帧累积可提高信噪比49，但这会增加总的FLIM采集时间（因为在CCD相机饱和前每帧采集的荧光光子数较少，因此需要增加帧累积次数），因此应根据每个实验的具体情况权衡这一取舍。延迟发生器的校准取决于激光重复频率，因此必须确保将对应所用重复频率的正确校准文件加载到采集软件中。延迟盒的校准程序可在openFLIM-HCA Wiki33上找到。
如果细胞自发荧光相对于荧光信号较低，我们使用仅含培养基的孔中的信号来提供随时间变化的背景（TVB）。为了最小化细胞培养基产生的背景荧光，我们避免使用含有酚红的培养基。如果细胞自发荧光较强，则TVB可通过未标记细胞的测量值获得。然而，在这种情况下必须谨慎，因为该方法假设图像中每个像素的自发荧光背景相同。如果细胞内自发荧光在空间上存在显著差异，或激发光束及检测灵敏度在视场范围内不均匀，则该假设将不成立。
利用散射的激发光脉冲获取仪器响应函数（IRF）图像，可提供在拟合过程中与数据模型进行卷积的时间IRF轮廓，同时提供视场内IRF空间变化的分布图。可通过成像散射样品（如胶体悬浮液）来测量IRF，但在本仪器中，使用来自Nipkow转盘的激发光散射可获得更清晰的IRF测量结果。准确确定IRF的时间特性至关重要，因为激发光与时间门控之间的时间延迟误差会显著影响拟合过程，尤其是在拟合复杂的指数衰减模型时。利用散射激发光获取的IRF并不完全适用于拟合过程，因为其记录的是激发波长而非荧光发射波长处的信号，这可能影响其时间特性，尽管IRF的空间变化在两个波长下应保持一致。此外，由于散射物体引起的光路长度不同，散射IRF相对于真实IRF可能存在全局性的时间偏移，例如在光学切片FLIM中从Nipkow转盘获取的IRF即属此情况。该校正量t0是指需施加于所获取的散射激发光IRF上的全局时间偏移量，其值根据协议步骤4.4中所述的单指数参考染料数据计算得出。以下染料可用于不同激发波长：75 μM香豆素153的甲醇溶液（τ ~ 4.3 ns50）适用于295–442 nm范围内的激发；75 μM香豆素6的乙醇溶液（τ ~ 2.43 ns37）适用于430–500 nm范围内的激发；75 μM罗丹明B的水溶液（τ ~ 1.7 ns37）适用于488–575 nm范围内的激发。需注意，尽管在FLIMfit中可以为系统的每个像素使用不同的IRF，但通常可合理假设空间变化的IRF在图像中每个像素具有相同的时间轮廓，仅相对于全局t0存在一系列空间变化的时间偏移。我们将此称为IRF偏移图，其由散射光IRF确定。IRF轮廓、t0和IRF偏移图共同用于确保视场中每个像素均使用适当的IRF进行拟合。重要的是，t0可能随时间缓慢变化，因此应在任何FLIM数据采集之前进行测量。
用户应决定如何采样荧光衰减曲线，并需设置时间门的宽度及其相对于激发后的延迟时间。通常，建议使用较宽的门宽以最大化检测到的信号，对于荧光蛋白标记细胞的荧光寿命成像（FLIM），我们通常将门宽设为 4 ns。时间门延迟的数量应足以采样荧光衰减曲线（包括一个设置在激发脉冲前以测量背景信号的门），具体数量取决于分析中所用拟合模型的复杂程度。最佳数值可能依赖于衰减组分的寿命及其相对幅值。一般而言，拟合单指数衰减使用 4 个门即可，而对于更复杂的衰减模型，则可能需要 7 个或更多的时间门。
我们注意到，荧光寿命成像（FLIM）可通过多种时域或频域技术实现，而针对多孔板阵列的自动化FLIM高内涵筛选（HCA）最初是在一种（非光学切片）宽场显微镜上利用FRET的频域寿命读出实现的51。随后，首个用于HCA的自动化光学切片FLIM多孔板检测仪被报道，该系统采用宽场时间门控成像技术28。此后，宽场（非光学切片）频域FLIM HCA被应用于基于FRET的基因文库中翻译后修饰（酪氨酸磷酸化）的筛选52，而时间门控FLIM HCA则已被用于HIV-1 Gag寡聚化的FRET检测53、FOXM1的SUMO化修饰分析54以及Raichu RhoA和Rac1生物传感器的研究33。此外，也可使用TCSPC技术进行多孔板FLIM检测26，但迄今为止，该方法在通量方面仍难以匹敌基于宽场检测的技术。一种有望解决此问题的新兴方法是采用单光子计数探测器阵列，例如SPAD阵列55。
需要注意的是，使用荧光蛋白进行FRET检测时应谨慎对待任何读数，且从FLIMfit或其他任何FLIM分析软件获得的参数绝对值将取决于拟合模型所关联的假设。例如，当FRET供体具有显著的第二衰减组分时，若采用双指数模型拟合FRET-FLIM数据，可能导致与发生FRET的群体相关的快速衰减组分贡献被高估。因此，最好使用具有单指数寿命的供体，如mTq2FP。即便如此，最近的研究表明，FRET分析仍可能受到受体荧光蛋白暗态的影响，或因荧光团构象分布导致的多种发色团角度和距离而引起取向因子κ2的异质性56。尽管如此，我们及其他研究者已证实，基于荧光寿命的FRET读数确实能够产生与生物化学测量结果相关联的有用数据，可用于筛选蛋白质相互作用或监测生物传感器的动力学变化。因此，该openFLIM HCA平台可广泛应用于基于荧光寿命的各种检测，包括利用FRET或细胞自发荧光的实验8，以及基于染料探针的定量读出25。

在药物发现中，自动化高内涵分析（HCA）用于筛选化合物文库的应用日益广泛1，与此同时，生命科学基础研究领域也呈现出向自动化成像实验发展的趋势，以开展系统性研究，例如对siRNA文库进行表型筛选。对于以往通常采用手动操作、仅对数十个细胞培养皿使用传统显微镜成像的小规模生物学研究而言，自动化HCA也正变得越来越重要。由于能够检测和分析数百至数千个视野，自动化HCA显著提升了统计效力，可对实验噪声（包括&#34;生物噪声&#34;）进行平均化处理；同时，图像数据的自动采集与大规模样本阵列的自动分析有助于消除操作者偏差，并常可用于检测系统性误差的发生，例如在数据采集过程中仪器响应函数（IRF）轮廓的变化。基于荧光的检测方法在HCA中被广泛应用，大多数商用HCA仪器均具备一个或多个光谱通道的荧光强度成像功能，用于描绘标记蛋白的相对分布及其共定位情况。然而，尽管更先进的荧光成像模式（如荧光寿命成像（FLIM）、偏振各向异性成像和时间分辨荧光各向异性成像）能够提供强大的定量读出信号，例如用于检测蛋白质相互作用，但这些技术在商用HCA仪器中尚未得到广泛利用。本文中，我们提出一种在自动化显微镜上实现HCA用FLIM的开源方法。
荧光寿命提供了一种内在的比率型光谱读数，可用于区分不同的分子种类，或探测荧光团的局部分子环境，且不受荧光团浓度、激发/检测效率以及散射和样品吸收影响2。此外，由于荧光寿命测量可在单一光谱通道中完成，因此无需校准即可在不同仪器和样品之间直接比较。该方法可应用于内源性荧光团，包括某些细胞代谢物、脂质和细胞外基质成分，从而对生物过程和病理状态提供内在的读数。因此，无需标记的荧光寿命成像（FLIM）可绘制细胞内的代谢变化图谱3,4，并已被用于监测干细胞分化5,6以及胶原支架的生长7。我们最近证明，FLIM高内涵分析（HCA）可利用自发荧光实现细胞代谢的自动化无标记检测8。然而更常见的是，荧光寿命测量和FLIM被应用于外源性荧光团，这些荧光团可标记特定的生物分子，通常通过染料对细胞区室进行染色，或使用与抗体偶联的染料靶向固定细胞中的特定蛋白，或使用与特定蛋白融合表达的基因编码荧光蛋白来实现。荧光寿命可用于为感知其物理或化学环境的荧光探针提供稳健的定量读数。例如，已有染料被用于检测细胞膜的局部脂质相态9或细胞黏度10，并已开发出基于基因编码荧光蛋白的生物传感器，用于报告细胞信号分子（如IP311、PIP212和钙蛋白酶13）或离子（如钙离子14,15、钾离子16和氯离子17）的浓度。
许多此类生物传感器利用弗ör斯特共振能量转移（Förster Resonance Energy Transfer, FRET）18,19来读取生物传感器构象变化的信号。供体（&#34;donor&#34;）与受体（&#34;acceptor&#34;）荧光团之间的FRET通过短程直接偶极-偶极相互作用发生，通常要求荧光团之间的距离小于约10 nm。因此，FRET的检测表明标记蛋白之间处于紧密接近状态，从而可用来读取蛋白-蛋白相互作用20，例如在固定细胞中的终点检测，或在活细胞时间序列测量中的动态事件，如结合或寡聚化过程。通过在适当的分子构建体上同时标记供体和受体荧光团，还可根据FRET的变化来检测该构建体的构象改变或裂解，这正是许多生物传感器的工作原理21。对FRET效率的测量可提供供体-受体间距离信息以及发生FRET的供体荧光团所占的比例。因此，基于FRET的成像技术可用于在空间和时间上绘制并定量分子相互作用，e.g., 阐明细胞信号传导过程22。自动化此类成像技术可实现基于信号通路或信号网络读数的高通量检测。
在高内涵筛选（HCA）中，最常采用的FRET检测方法是光谱比率成像，即对受体与供体荧光强度比值的变化进行成像分析。尽管该方法易于实施——并且许多商用多孔板检测仪均已具备此功能——但要实现定量的光谱分辨FRET测量，仍需对系统的光谱响应进行校准23。这包括由光谱渗漏和受体的直接激发引起的光谱串扰，以及仪器和样品的透射特性（内滤效应）。原则上，这需要额外测量仅标记供体或仅标记受体的&#34;对照&#34;样品。
通过此类光谱比例型FRET测量，可获得有效FRET效率（实际FRET效率与发生FRET的供体/受体分子比例的乘积），同时还能获得供体与受体分子的相对比例24。光谱比例型FRET通常用于单分子FRET生物传感器，此时可假设供体/受体的化学计量比已知。为了确定发生FRET的供体和受体分子所占的比例，例如，获得剂量-反应曲线，需要了解实际的FRET效率。这可通过测量具有已知特性的阳性FRET对照样品，或采用其他方法（如受体光漂白或荧光寿命成像，FLIM）测定FRET效率来实现。
利用荧光寿命读数，可通过仅测量供体发射来检测和量化FRET，从而无需进行光谱校准以及额外的对照样品。因此，可在不同仪器和不同样品间比较FLIM-FRET读数，从而实现对活体疾病模型内窥镜或断层成像数据的比较分析25 需与基于细胞的检测结果进行基准比较。通过将供体荧光衰减曲线拟合至适当的多指数衰减模型，该模型对应于发生FRET和未发生FRET的供体分子群体，原则上可直接获得FRET效率及各群体所占比例，无需额外测量。然而，这些显著优势的代价是，FLIM每像素所需的检测光子数高于光谱分辨的强度成像——通常在拟合单指数衰减模型时，需数百个光子才能实现10%寿命测定精度；而在拟合复杂的（多指数衰减）模型时，所需检测光子数则上升至数千。传统上，这导致FLIM的采集时间较长（每个视野数十至数百秒），尤其是在激光扫描显微镜中采用按序像素采集的时间相关单光子计数（TCSPC）技术时更为明显。尝试通过提高激发光强度来加快成像速度，可能导致显著的光漂白和/或光毒性。加之缺乏合适的商业化仪器和软件工具，这些因素阻碍了FLIM在药物发现或系统生物学的高内涵筛选（HCA）中的应用，而这些领域通常需要对数百至数千个视野进行成像。目前已在自动化的多孔板显微镜中实现了激光扫描TCSPC FLIM26 用于在鉴定后的二次测量 &#34;命中数&#34; 通过稳态偏振分辨荧光各向异性成像27，其成像速度可达到与光谱比率成像相似的水平28 与其具有许多相同的优点和缺点。荧光各向异性成像利用FRET存在时受体荧光各向异性的降低，同时也对光谱串扰敏感。例如， 直接激发受体）。需要进行校准以校正偏振串扰，且无法直接测量FRET效率。
为了实现荧光寿命成像（FLIM）在高内涵筛选（HCA）中的优势，我们致力于解决图像采集速度以及技术普及性方面的问题。本文提供了一份完整的开源软件与硬件组件清单，可用于构建下文所述的自动化快速FLIM多孔板读取仪，并附有基于FRET的示例检测方法。在我们的方法29中，FLIM通过宽场时间门控成像实现，采用门控光学图像增强器（GOI），如图1所示；由于采用并行像素检测，该方法相比单光束扫描的TCSPC技术具有更快的成像速度和更低的光漂白效应。我们的openFLIM-HCA仪器可实现无人值守的FLIM检测，仅需数秒即可完成每个像素采集数百个光子（具体数量取决于样品亮度）的FLIM数据采集。结合将样品移至前一个视野所需的时间、调整采集参数以及维持样品聚焦所需的时间，通常每个视野的多孔板采集时间约为10秒25,28。光学切片可通过准宽场Nipkow（&#34;旋转盘&#34;）扫描器实现30。
对于荧光寿命成像（FLIM）数据分析，我们开发了一款名为 FLIMfit31 的开源软件工具，该工具可在常规PC工作站上快速分析多孔板FLIM数据集，并且是OMERO32的插件。FLIMfit 提供全局分析功能（见第1.2节），可在假设荧光寿命组分在整个图像或感兴趣区域（ROI）内保持不变的前提下，将FLIM数据拟合至复杂模型，且每个像素仅需数百个光子即可完成分析，从而减少所需检测光子数、降低样品的光照暴露以及缩短图像采集时间。在标准台式电脑上运行 FLIMfit，分析包含数百个视野（FOV）的数据集仅需数十秒的计算时间。因此，FLIM数据的采集与分析均可在适用于高内涵筛选（HCA）的时间尺度上完成。
openFLIM-HCA 硬件
我们的FLIM高内涵分析（HCA）实现包含六个关键组件：（i）带有光学自动对焦功能的荧光显微镜框架；（ii）电动（x-y-z）显微镜载物台；（iii）激发激光光源；（iv）配备门控光学增强器（GOI）、延迟发生器和相机的宽场时间门控FLIM系统；（v）用于数据采集与分析的计算机；以及（vi）用于光学切片成像的Nipkow圆盘扫描装置，以抑制离焦光信号。当检测弱信号时，这一点尤为重要，例如，来自细胞质膜上FRET生物传感器的信号，可能被细胞质荧光或盖玻片或培养基背景信号所淹没。时间门控FLIM数据通过使用超短脉冲激发辐射照射样品，将荧光发射成像至GOI的光电阴极，并在激发脉冲到达后，对GOI门控时间延迟的一系列设定值，采集一系列CCD图像上的GOI荧光屏图像而获得。随着激发后时间门控延迟的增加，荧光信号逐渐减弱，CCD采集到的一系列时间门控荧光强度图像构成了分析视场内所有荧光团衰减曲线所需的数据集。GOI的门控与激发脉冲同步，对于一系列CCD采集过程，时间门相对于激发脉冲的延迟在所需范围内设置为一系列递增的数值。该同步由延迟发生器实现，其包含一个&#34;快速延迟盒&#34;（提供最高20 ns、步长1 ps的延迟）和一个&#34;粗调延迟盒&#34;，后者提供的最小步长为25 ps。
对于荧光寿命成像（FLIM），激发光源可采用任意一种超快激光器。为方便起见，我们通常使用由光纤激光器泵浦的超连续谱光源，该光源可产生可见光谱范围内可调谐的皮秒脉冲，通过配备不同带通滤光片的电动滤光轮，可为任意荧光团选择合适的激发光。通常，我们在样品处使用的平均功率约为100–200 µW，脉冲重复频率为40或60 MHz。此类激发功率也可通过基于锁模钛掺杂蓝宝石激光器倍频的超快激光光源实现。需要注意的是，对于大多数实验，激发脉冲持续时间低于约100 ps已足够。另一个配备中性密度滤光片的电动滤光轮用于调节激发光强度。出于安全和操作便利考虑，激发光可通过单模光纤传输。宽场FLIM和光学切片FLIM的光路配置分别如图2和图3所示。有关所用具体组件的更多细节，请访问openFLIM-HCA wiki33。当前的元器件清单见补充材料。
对于宽场荧光寿命成像（FLIM），激发光辐射需要尽可能均匀地照射整个视场。为此，我们将激发激光束导向一个全息扩散器 &#34;礼帽&#34; 以10-50 Hz旋转的扩散器用于对激光散斑进行时间平均，扩散器平面成像至物镜的后焦平面。显微镜输出端的荧光图像被中继至门控光学成像器（GOI）的光阴极，GOI的荧光屏（有效区域对角线18 mm）通过一对相机镜头（放大倍率为0.7）成像至冷却科学CCD相机（芯片尺寸10.2 mm × 8.3 mm）的传感器上。系统由标准PC机控制，通过RS232协议与仪器连接。此外，使用Arduino微处理器控制激发光路中的快门，该快门仅在CCD相机采集FLIM数据时打开，并记录来自光电二极管的信号，该光电二极管用于测量经光谱滤波的超连续谱激发光源的平均功率。对于光学切片FLIM，激发激光通过单模保偏光纤耦合，直接连接至Nipkow盘扫描单元，如图所示 图3. Nipkow扫描单元输出的荧光图像被中继至GOI的光电阴极，系统其余部分与宽场FLIM相同。
openFLIM-HCA 软件
数据采集软件是用 µManager34提供完整的HCA数据采集功能，包括更改孔板成像顺序的选项、对任意视野采集时间序列、在测量过程中自动维持聚焦，以及控制激发和发射滤光轮和二向色镜切换器以实现自动多色成像。还可运行 &#34;预扫描&#34; 根据预设标准自动识别并记录适合的视野位置，以进行后续荧光寿命成像（FLIM）所需的荧光强度采集， 例如，根据强度。FLIM HCA 数据可保存为一系列 TIFF 文件，或保存为一系列 OME-TIFF 文件（即，每个视野一个文件，或整合多孔板中所有数据为单个 OME-TIFF 文件。有关 µManager 软件的更多信息及详细说明，请参见 openFLIM-HCA wiki33.
数据分析软件 FLIMfit31 是一个基于开源 MATLAB 的客户端，用于 OMERO 图像数据管理平台32，能够从 OMERO 服务器或计算机磁盘读取 FLIM 数据，如图4所示。该软件专为分析 TCSPC 或宽场时间门控 FLIM 仪器的数据而设计，具备多种功能，可对 openFLIM-HCA 获取的数据进行拟合，包括单指数衰减曲线拟合、双指数及更高复杂度的衰减曲线拟合，支持诸如偏振分辨荧光衰减曲线等模型。软件还可考虑固定或随时间变化的背景信号，并可使用实测的时空仪器响应函数（IRF），或采用理想化的 IRF 进行拟合，后者可根据完整的实验 IRF 测量结果逐像素进行时间偏移。荧光样品与 IRF 之间的全局时间差（t0）可通过荧光标准样品的测量确定。背景信号和 IRF 的空间变化也可被纳入分析。 FLIMfit 支持逐像素拟合 FLIM 数据，也可采用&#34;全局分箱&#34;或&#34;全局拟合&#34;方法，以实现对光子数较少（数百量级）的 FLIM 数据进行复杂衰减模型的拟合。
全局分箱是指在每个时间点上，将用户定义的感兴趣区域（ROI）内所有像素检测到的光子进行汇总，以获得足够数量的光子，从而能够拟合复杂的衰减模型。该ROI可以是整个视野（FOV），可以由用户手动定义，也可以通过图像分割工具确定。此外，还可以通过从其他图像分割软件导入掩膜（mask）到FLIMfit中来定义ROI。在FRET应用中，通常采用全局分箱方法拟合双指数衰减模型，以确定对应于发生FRET和未发生FRET的供体荧光团的荧光寿命组分，这些组分被假定在ROI内空间上保持不变；随后，在各像素上进行逐像素拟合，固定上述寿命组分值，以获得每个像素中发生FRET的供体荧光团所占的比例。
全局拟合 需要在整个视野（FOV）范围内，或在包含多个视野的FLIM数据集上，同时拟合寿命组分以及逐像素的FRET供体群体分数， 例如，来自多孔板实验或一系列荧光寿命图像。全局拟合能够利用图像中群体组分分数的空间变化信息，而这些信息在全局分箱方法中会丢失；因此，尽管计算量显著增加，全局拟合可为组分寿命的估计提供更强的约束，从而获得更可靠的结果35. FLIMfit 可在常规PC工作站上快速分析多孔板荧光寿命成像（FLIM）数据集，并实现全局拟合；例如，对于一个采用五个时间门控采集的多孔板时间门控FLIM数据集，共包含394个视野（FOV），每个视野为672 × 512像素，拟合至双指数衰减模型仅需32秒和2 GB内存31通过采用多线程并行算法实现的可分离非线性最小二乘拟合算法，实现了在多核处理器上的高效扩展 FLIMfit 代码已优化以最小化内存使用。 图5 展示了图形用户界面的一个快照 FLIMfit 更多详细信息可参见参考文献36中给出的网页。关于全局拟合和全局分箱的进一步信息可参见参考文献31。
以下使用我们的 openFLIM-HCA 仪器与软件进行荧光寿命成像高通量分析（FLIM HCA）的实验方案，可适用于多种具有 FLIM 检测读数的细胞成像实验。通常，多孔板 FRET 实验的设计应包含待研究条件之外的阳性与阴性生物学对照的重复孔。本文描述了对表达 FRET 构建体的 Cos 细胞进行光学切片 FLIM 分析（见图3）的具体实施方法，该构建体由 mTurquoise 荧光蛋白与 Venus 荧光蛋白通过一段短肽连接子连接而成。其中，mTq32V、mTq17V 和 mTq5V FRET 构建体（参见代表性结果部分）分别提供低、中、高 FRET 效率，同时包含不发生 FRET 的 mTq5A 构建体。这些构建体及其他执行本方案所需的材料均列于材料清单中。

<table><tbody><tr><td>显微镜框架</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td>http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf</td></tr><tr><td>光学自动对焦系统</td><td>Olympus</td><td>ZDC</td><td>http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf</td></tr><tr><td>电动（x-y-z）显微镜载物台</td><td>Marzhauser</td><td>00-24-565-0000</td><td>配备 Corvus 控制器</td></tr><tr><td>激发激光光源</td><td>Fianium</td><td>SC400-4</td><td>超连续谱激光器 http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/</td></tr><tr><td>门控光学增强器&amp;nbsp;</td><td>Kentech</td><td>High Rate Imager (HRI)</td><td></td></tr><tr><td>延迟发生器</td><td>Kentech</td><td>---</td><td>参见 agile delay generator 和 precision delay generator</td></tr><tr><td>相机</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA-ER-II</td><td></td></tr><tr><td>Nipkow 盘扫描单元&amp;nbsp;</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1&amp;nbsp;</td><td>http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/</td></tr><tr><td>平顶光束扩散器</td><td>Thorlabs</td><td>ED1-S20-MD</td><td>工程化扩散器</td></tr><tr><td>mTq5V&amp;nbsp;</td><td>Oxford Genetics</td><td>P3850</td><td>含5个氨基酸连接子的 mTurquoise Venus 构建体</td></tr><tr><td>mTq17V</td><td>Oxford Genetics</td><td>P3847</td><td>含17个氨基酸连接子的 mTurquoise Venus 构建体</td></tr><tr><td>mTq32V</td><td>Oxford Genetics</td><td>P3848</td><td>含32个氨基酸连接子的 mTurquoise Venus 构建体</td></tr><tr><td>mTq5A</td><td>Oxford Genetics</td><td>P3849</td><td>mTurquoise Amber 构建体</td></tr><tr><td>HEK293T</td><td>---</td><td>---</td><td>所用细胞类型</td></tr><tr><td>无酚红 HBSS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>55021C-1000ML</td><td>成像培养基</td></tr><tr><td>培养基</td><td></td><td></td><td>DMEM + 10% FBS + 0.5% 抗生素</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6046-500ML</td><td>用于配制培养基</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12003C-500ML</td><td>用于配制培养基</td></tr><tr><td>xTremeGene9</td><td>Sigma Aldrich</td><td>6.37E+09</td><td>用于转染，遵循 Roche 在线操作方案</td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA 溶液</td><td>Thermo Fischer</td><td>R001100</td><td>用于细胞消化，遵循 Thermo Fischer 在线操作方案</td></tr></tbody></table>

利用自动荧光寿命成像显微镜的开源高内涵分析

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

我们介绍了一种开源的高内涵分析仪器，该仪器利用自动化的荧光寿命成像（FLIM）技术，通过检测多孔板中固定或活细胞的基于荧光共振能量转移（FRET）的信号，来分析蛋白质相互作用。该方法可用于筛选细胞信号传导过程，其读出方式包括基于分子内FRET的生物传感器，或蛋白质相互作用（如寡聚化或异源二聚化）的分子间FRET，从而用于鉴定结合伴侣蛋白。本文描述了该自动化多孔板FLIM仪器的功能，并展示了我们研究HIV Gag蛋白寡聚化以及活细胞中FRET生物传感器时间过程的示例数据。随后，我们详细说明了该系统的实际实施方案，包括硬件组件清单以及基于µManager编写的开源数据采集软件的说明。同时介绍了FLIMfit的应用，这是一个基于MATLAB的开源OMERO平台客户端，用于分析多孔板FLIM数据阵列。文中还概述了固定细胞和活细胞成像的实验方案，并演示了利用表达基于荧光蛋白的FRET构建体的细胞进行自动化多孔板FLIM实验的过程。此外，还提供了针对该特定FLIM-FRET数据集的数据分析逐步操作指南。

我们介绍一种开源的高内涵分析（HCA）仪器，该仪器利用自动化的荧光寿命成像（FLIM）技术，通过基于荧光共振能量转移（FRET）的检测方法来分析蛋白质相互作用。openFLIM-HCA 仪器的数据采集由基于 µManager 编写的软件控制，数据分析则在 FLIMfit 中进行。

我们介绍一种开源的高内涵分析仪器，该仪器利用自动荧光寿命成像（FLIM）技术检测蛋白质相互作用……

本实验的总体目标是演示如何利用开源软件和基本仪器，在自动化多孔板工作流程中实现时间门控荧光寿命成像显微技术（FLIM）。该方法可应用于一系列固定细胞或活细胞的基于FLIM的检测，尤其适用于细胞信号转导或蛋白质相互作用的研究。该技术的主要优势在于，荧光寿命成像（FLIM）可提供可靠的定量读数，并能在单次测量中获得相互作用分子群的比例。通过对数百个视野中的数千个细胞应用全局分析技术，我们可以利用荧光共振能量转移（FRET）读数，并检测到例如荧光寿命低至约20皮秒的变化。我们的研究助理 Sunil Kumar 和软件开发人员 Ian Munro 将与 Frederik Gorlitz 一起演示该操作流程。首先启动 Micromanager，并打开 openFLIM-HCA 插件。在 FLIM 控制选项卡下，选择延迟盒校准文件，并打开校准文件。选择针对特定延迟发生器单元和激光重复频率组合的校准文件。在文件菜单下，选择设置基础文件夹，并指定用于保存数据的文件夹。在确认所有相关参数均已正确设置后，在整个实验过程中，手动将选通式光学增强控制器上的门宽设置为四纳秒。为获取仪器响应函数图像数据，需手动将一个光束挡板放置在物镜前的滤光立方盒内，以防止任何激光逸出，并调整光束挡板的角度，以最大限度减少反射回显微镜主体的光线。在光路控制选项卡下，设置转盘单元中的激发滤光片、二向色镜和发射滤光片，使得来自旋转尼普科夫盘的激发光散射部分能够在不少于200毫秒的相机积分时间内成像，且系统不发生饱和。在FLIM控制选项卡下，对可编程快速延迟盒所覆盖的全部延迟范围，使用“查找最大值点”功能。然后检查显示的输出轨迹，并设置粗调延迟时间，使整个仪器响应函数曲线位于快速延迟盒的扫描范围内。调节中性密度和曝光时间参数。除了帧累积外，还需确保相机在亮度时间门内不饱和，且有效积分时间不少于200毫秒。在FLIM控制菜单下，选择快速延迟框，并在整个延迟范围内设置25皮秒的延迟步长。接着，选择填充延迟，然后点击拍摄FLIM图像，以获取仪器响应函数图像。等待采集完成。在光路控制菜单中，选择中性密度，并点击“阻断”以关闭激光。打开荧光寿命成像控制菜单，选择快速延迟框，通过增加增量框中的数值来减少延迟步数。然后点击“拍摄FLIM图像”以获取背景相机图像。为获取参考染料数据，请转到XYZ控制选项卡，并在“转至孔”对话框中输入H4孔。接着，转到光路控制选项卡，选择适当的激发、二向色镜和发射滤光片，使用“查找最大值点”功能，在快速延迟框的全范围内对M turquoise荧光蛋白进行成像。然后设置适当的参数以采集参考芯片数据和相应的背景图像，方法如前所述。要从多孔板样品中采集荧光寿命成像（FLIM）数据，请进入高内涵筛选（HCA）序列化采集设置菜单。选择XYZ位置选项卡，设定需要成像的孔以及每个孔采集的视野数量。选择一个包含待成像样本的代表性视野，并设置相机积分时间下的最佳中性密度滤光片，使读出相机的动态范围达到75%。在XYZ控制选项卡下，于自动对焦对话框中选择返回焦点控制，并手动将显微镜聚焦在感兴趣的细胞或结构上。将自动对焦搜索范围设置为2000微米，然后按回车键。然后点击“AF now”以启动自动对焦程序。对焦偏移自动对焦字段中将显示一个偏移值。将此偏移值输入至AF偏移窗口中，并连续两次点击“AF now”以重复自动对焦程序。偏移值现在应设置为零，表明自动聚焦系统工作正常。接下来，在FLIM控制选项卡下，选择自动门控功能，以确保延迟时间点的对数采样。将累积帧数设置为可达到所需总数据采集时间的数值。然后，在FLIM采集对话框中，单击“启动HCA序列”按钮以运行FLIM多孔板采集，并如上所述获取背景相机图像。此处展示了一个使用共表达FRET模型系统并在多孔板中进行的代表性FLIM FRET检测，图中显示了各孔中典型视野下自动采集的荧光寿命图像示例。在本实验中，阴性对照孔显示出最长的荧光寿命，而供体荧光寿命在具有最短连接序列的FRET构建体中表现最短。总体而言，每个孔中所有视野的平均荧光寿命在多孔板之间存在差异。将A1孔中所有成像细胞的供体荧光强度衰减曲线进行平均，并结合单指数衰减模型拟合及仪器响应函数，结果表明该拟合模型是有效的。进一步对多孔板每列的平均荧光寿命进行分析（通过逐像素单指数拟合获得），结果显示，随着FRET构建体中连接子长度的缩短，荧光寿命降低，模拟了不同FRET效率的实验结果。在本实验中，采用单指数衰减模型对不同抑制剂作用于蛋白质寡聚化的FRET实验的FLIM数据进行拟合。荧光寿命平板图显示了每个孔的平均寿命，该值是基于八个视野的平均结果。其中一个小规模实验每孔成像四个视野，而我们的FLIM实验总耗时约为两个半小时，包括获取仪器响应函数、参考染料数据以及在FLIM拟合软件中完成分析的时间。进行荧光寿命成像（FLIM）实验时，重要的是要同时采集仪器响应函数和参考染料数据及其背景图像，以确保拥有分析FLIM数据所需的全部信息。利用我们的开源软件FLIM fit，还可以将这些数据拟合到更复杂的衰减模型中，例如，可用于确定FRET群体比例。我们的FLIM高内涵分析技术正在帮助药物发现领域的研究人员对FRET进行可靠的测量。未来，我们希望该技术能够实现基于细胞的检测中解离常数的测定。我们希望本视频论文以及我们在Wiki中提供的信息，能够帮助其他研究人员构建自己的FLIM高内涵分析仪器，并将其应用于FRET及其他检测方法中。请勿忘记，使用激光可能存在危险，因此在使用此类仪器时，应始终采取相应预防措施，例如将所有激光束封闭起来。

open-source-high-content-analysis-utilizing-automated-fluorescence

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

开源高内涵分析利用自动荧光寿命成像显微镜

本文中，我们描述了如何利用自动扫描共聚焦显微镜，从固定在表面的单个DNA分子获得FRET轨迹。...

用于表面固定生物分子单分子荧光测量的自动化系统

荧光寿命成像（FLIM）已成为一种关键技术，用于成像活细胞中特定蛋白质和染料的环境及其相互作用。利用荧光分子转子的FLIM可实现对活细胞内黏度的成像图谱绘制。...

活细胞中分子转子的荧光寿命成像

来源：Nyström, S., 等 利用高光谱共聚焦显微镜和荧光寿命成像技术对经发光共轭寡噻吩染色的淀粉样组织进行成像。 J. Vis. Exp.

利用荧光寿命成像显微镜分析组织切片中的淀粉样结构

来源： Pigazzini, M. L., 等 衰老过程中淀粉样结构的表征 秀丽隐杆线虫 使用荧光寿命成像 J. Vis. Exp. (2020).本视频展示了如何利用荧光寿命成像显微技术（FLIM）评估秀丽隐杆线虫（C.

多聚谷氨酰胺蛋白聚集的荧光寿命成像在 秀丽隐杆线虫 神经元

本文展示了一种灵活的信息学工作流程，可实现对荧光标记细胞的多重基于图像的分析。该工作流程可定量分析细胞核和细胞质标志物，并计算这些标志物在不同区室间的转位情况。文中提供了利用siRNA对细胞进行扰动的实验步骤，以及在96孔板体系中通过间接免疫荧光法可靠检测标志物的方法。...

基于开源软件的通用显微镜数据中荧光标记物高内涵单细胞定量分析工作流程

淀粉样蛋白沉积是多种疾病的特征，并可累及多个不同器官。本文介绍了荧光标记的共轭寡噻吩染色法结合荧光显微镜技术的应用。该染色方法在临床和科研环境中均为检测和研究蛋白质聚集体的有力工具。...

利用高光谱共聚焦显微镜和荧光寿命成像技术对经发光共轭寡噻吩染色的淀粉样组织进行成像

本方案描述了一种基于荧光共振能量转移和荧光寿命成像显微技术，用于定量可视化SNARE蛋白复合物形成的新方法。...

利用荧光寿命成像显微镜观察细胞内SNARE的运输

本文介绍了一种利用宽场高内涵分析系统（WHCAS）对载玻片上荧光标记组织进行自动分割的实验方案。该方案在涉及生物组织中荧光标记物定量的各个领域均具有广泛应用，包括生命科学、医学工程和健康科学。...

使用宽场高内涵分析系统对荧光标记组织进行自动载玻片扫描与分割

我们介绍一种利用微图案阵列获取单细胞荧光报告信号时间序列的方法。本方案详细描述了单细胞阵列的制备、活细胞扫描式延时显微镜的设置与操作，以及一个开源图像分析工具，用于对每个黏附位点的细胞整合荧光时间序列进行自动预筛选、可视化质控和追踪分析。...

活细胞成像单细胞阵列（LISCA）——一种用于定量细胞动力学的多功能技术

本方案详细介绍了无标记自体荧光多谐波（SLAM）显微技术的逐步操作流程，包括激光光源的产生、组织样本的制备、成像过程的实施以及数据的分析方法。SLAM技术通过检测四种互补的无标记对比信号，推动了非线性显微成像技术的发展，可用于研究组织微环境。...

无标记自体荧光多谐波显微成像同步观测

了解开源高内涵分析技术，利用自动荧光寿命成像显微镜检测固定或活细胞中的蛋白质相互作用。该方法通过FRET读数提供稳健的定量数据，助力药物发现研究。

利用自动荧光寿命成像显微镜的开源高内涵分析

探索更多视频