开源高内涵分析利用自动荧光寿命成像显微镜

该程序的总体目标是演示如何使用开源软件和基本仪器在自动化多孔板工作流程中实施时间门控荧光寿命成像显微镜 （FLIM）。该方法可应用于一系列固定或活细胞中基于 FLIM 的读数。它对于读取细胞信号处理或蛋白质相互作用特别有用。

该技术的主要优点是 FLIM 提供可靠的定量读数，并且可以在单次测量中提供交互作用群体分数。将全局分析技术应用于数百个视野中的数千个细胞，使我们能够利用 foster 树脂能量转移或 FRET 读数。例如，利用寿命变化低至约 20 皮秒。

我们的研究助理 Sunil Kumar 和我们的软件开发人员 Ian Munro 将与 Frederik Gorlitz 一起演示该程序。首先启动微管理器并打开 openFLIM-HCA 插件。在 FLIM control 选项卡下，选择 delay box calibration file，然后打开校准文件。

为延迟发生器单元和感兴趣的激光重复率的特定组合选择校准文件。在文件菜单下，选择 set base folder 并选择将保存数据的文件夹。确认已设置所有适当的参数后，在门控光增强器控制箱中手动设置整个实验的门宽为 4 纳秒。

要获取仪器响应功能图像数据，请在物镜前的滤光片盒中手动放置一个光束块，以防止任何激光逸出，并调整光束块的角度，以尽量减少反射回显微镜框架。在光路控制选项卡下，在旋转转盘单元中设置激发、二向色和发射滤光片，以便可以对从旋转的 Nipkow 转盘散射的激发光部分进行成像，而不会使系统在至少 200 毫秒的相机积分时间内饱和。在 FLIM control 选项卡下，在可编程快速延迟框覆盖的整个延迟范围内使用 find max point 函数。

然后检查显示的输出跟踪。并设置航向延迟时间，使完整的仪器响应功能配置文件处于快速延迟盒的扫描范围内。调整 NEUTRAL DENSITY 和 EXPOSURE TIME 参数。

以及帧的累积，使相机在亮度时间门中不饱和且有效积分时间不小于 200 毫秒。在 FLIM 控制菜单下，选择 Fast Delay 框并在整个延迟范围内设置 25 皮秒延迟步长。接下来，选择 populate delays（填充延迟）并单击 snap FLIM image（捕捉 FLIM 图像）以获取仪器响应函数图像。

并等待收购完成。在光路控制菜单下，选择 neutral density（中性密度），然后单击 blocked（阻挡）以阻挡激光。打开 FLIM 控制菜单并选择 fast delay 框，通过增加增量框中的值来减少延迟步数。

然后单击 snap FLIM image 以获取背景相机图像。要获取参考晶粒数据，请转到 XYZ 控制选项卡，然后在 go to well 对话框中输入 H4 井。接下来，转到光路控制选项卡，选择合适的激发、二向色和发射滤光片，以便在快速延迟框的整个范围内使用查找最大点功能对 M 绿松石荧光蛋白进行成像。

然后设置适当的参数来获取参考晶片数据和相应的背景图像，就像刚才演示的那样。要从多孔板样品中采集 FLIM 数据，请转到设置 HCA 测序采集菜单。选择 XYZ 位置选项卡并设置应成像的孔以及每个孔要采集的视野数量。

选择包含要成像的样品的代表性视场，并在相机的积分时间内设置最佳中性密度滤光片，以达到读出相机动态范围的 75%。在 XYZ control（XYZ 控制）选项卡下，在自动对焦对话框中选择 return focus control（返回聚焦控制），然后手动将显微镜聚焦在感兴趣的细胞或结构上。将自动聚焦搜索范围设置为 2000 微米，然后按 Enter。

然后点击 AF now 启动自动对焦程序。偏移值将出现在焦点偏移自动对焦字段上。在 AF 偏移窗口中输入此偏移值，然后单击 AF now 两次以重复自动对焦过程。

偏移值现在应设置为零，表示自动对焦系统正常运行。接下来，在 FLIM control 选项卡下，选择自动门控功能以确保延迟点的对数采样。将 accumulate frames 设置为可产生所需总数据采集时间的值。

然后，在 FLIM 采集对话框中，单击启动 HCA 序列按钮以运行 FLIM 多孔板采集并获取背景相机图像，如刚才所示。这里显示了使用共细胞和多孔板中表达的模型 fret 系统的代表性 FLIM fret 测定，并在每个孔中展示了自动获取的典型视野的荧光寿命图像的示例。在该实验中，阴性对照孔的寿命最长，供体寿命表现出最低的 Fret 构建体和最短的接头长度。

总体而言，每个孔中所有视场的平均寿命在多孔板中有所不同。对 A1 孔中成像的所有细胞的供体荧光强度衰减曲线进行平均，并与单指数衰减模型和仪器响应函数拟合，表明拟合模型是有效的。通过像素级单指数拟合获得的多孔板每列的平均荧光寿命的进一步分析表明，接头长度较短的 Fret 构建体的寿命缩短，模拟了具有不同 Fry 效率的实验。

在本实验中，不同抑制剂对蛋白质寡聚化作用的 fret 测定的 FLIM 数据与单个指数衰减模型拟合。荧光寿命板图说明了 8 个视场的平均每孔平均寿命。一个小集合，每孔四个视野成像，而我们的 FLIM 分析可以在大约两个半小时内完成，包括获取仪器响应功能、参考芯片数据和以 FLIM 拟合运行分析的时间。

在进行 FLIM 分析时，请务必记住获取仪器响应函数和参考芯片数据及其背景图像，以便您获得分析 FLIM 数据所需的所有信息。使用我们的开源软件 FLIM fit，还可以将这些数据拟合到更复杂的衰减模型中。例如，允许确定 fret 种群分数。

我们的 FLIM HCA 技术正在帮助药物发现界的研究人员对 FREST 进行可靠的测量。未来，我们希望这项技术能够在基于细胞的测定中测量解离常数。我们希望这篇视频论文以及我们 Wiki 中的信息能够帮助其他研究人员构建自己的 FLIM HCA 仪器，并将其应用于品丝和其他检测。

不要忘记，使用激光工作可能很危险，并且在使用此类仪器时应始终采取预防措施，例如封闭所有激光束。