样品制备结核分枝杆菌

该程序的目的是分析 结核分枝杆菌，通过 NMR 代谢组学首先培养的无细胞提取物，并在适当的生长阶段收获细胞。然后 lysa 细胞并获得无细胞提取物进行分析。将冻干提取物重新悬浮在缓冲液中用于 NMR 分析。

最后，收集 NMR 数据并使用软件分析光谱以识别代谢物。最终，结核分枝杆菌的 NMR 分析用于显示各种处理后代谢物水平的保留。核磁共振代谢组学可以应用于结核分枝杆菌生理学的关键方面，例如重要的代谢途径。

这种理解对于阐明药物作用和耐药性的作用机制以及确定药物设计的新靶点至关重要。一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为无法以完全相同的方式处理所有样品，这将引入不必要的变化和我实验室的结果。Steven Luka 博士研究生将演示处理用于 NMR 处理的样品的程序 在我的实验室中，研究实验室经理和三研究技术员 Robert Fenton 现在将演示在进行结核分枝杆菌培养时处理结核分枝杆菌培养的程序。

研究遵循机构指南定义的生物安全三级实践。虽然本视频中的标签上写着结核微生物是出于生物安全考虑，但该演示使用了非致病性岩浆分枝杆菌。首先在冰上解冻 50% 结核分枝杆菌的甘油原液。

在 250 毫升 ER 中将 0.15 毫升接种到 110 毫升 M-A-D-C-T-W 肉汤中，我的培养瓶在 37 摄氏度下以 100 RPM 振荡培养物约 6 天。如果没有抗生素，则需要替代添加或其他治疗。收获需要处理的培养物的培养物。

将 0.5 mL Eloqua 保留在冰上用于培养、滴定和质量控制。然后进行所需的处理，并在处理时间后将培养物放回摇床中。取出 1 毫升，测定 OD 600。

此外，保留 0.5 mL 样品用于培养、滴定和质量控制。在整个剩余方案中将细胞保持在冰上。用 15 毫升冰冷的双蒸水洗涤后，通过离心收获四个 50 毫升试管中的细胞。

Reese 将沉淀悬浮在 10 毫升等分试样中。拉出两个等分试样并通过离心沉淀，然后将细胞沉淀重悬于终体积为 1 毫升的双蒸水中。如果需要无结块的单个细胞悬液，请将细胞穿过 27 号针头。

继续将 1 mL 细胞悬液转移到含有裂解基质的 2 mL 螺帽上 3 次 B.将 Fast prep 24 裂解均质器放置在生物安全柜内。将样品放入固定辐条板的样品架中。然后以每秒 6 米的速度设置处理 60 秒。

接下来，离心样品以沉淀细胞碎片和完整细胞。然后将旋囊通过 0.2 微米注射器过滤器进入无菌管中，以控制活细胞的缺失。在 MADC 上接种 0.1 mL 样品。琼脂。

样品冷冻在乙醇干冰浴中，并在零下 80 摄氏度下储存，直到它们准备好在 NMR 设施中冻干和处理。两个月后，检查板以验证是否存在菌落形成单位。如果没有发现 CF 使用者，可以将样品从 BSL 三实验室中取出，以便在标准 NMR 设施中进一步分析。

将样品定干后，重悬于 0.7 mL NMR 缓冲液中，并转移至微量离心管中，以 13， 000 次离心 3 分钟。G，取出 0.6 毫升并转移到 5 毫米 NMR 管中。从培养基分析中，定制的支架有助于将多个 NMR 管以正确的深度加载到旋转器中。

然后将样品转移到 NMR 波谱仪中，将一个 20 样品转换器插入 A-B-A-C-S 中。在未处理和药物处理的培养物之间交替。在自动运行开始时，需要将第一个样品预装到磁力架中。

要校准仪器，请使用单个样品优化 90 度脉冲长度，并针对其余样品调整仪器。使用图标 NMR 和 grad shim。自动锁定匀场和 NMR 数据收集每个样品。

对于 A 1D 氢单 NMR 波谱，选择具有水抑制和激发雕刻的脉冲序列。为两个 DH one C 13 hs QC 谱图设置总共 32， 000 个数据点、128 个扫描和 16 个虚拟扫描。选择脉冲序列。

总共选择 2048 个沿直接 H 1 维度扫描宽度的数据点和 64 个数据点，沿间接 C 13 维度选择扫描宽度的数据点。此外，指定 128 次扫描和 16 次虚拟扫描的频谱收集，以获得良好的信噪比。结核分枝杆菌谱系产生了大约 400 个峰，包括 50 种已知的代谢物。

例如，随附手稿中详述的数据处理产生了与 D 丙氨酸通路直接或间接相关的代谢物谱。峰强度的大小与细胞提取物中存在的代谢物浓度成正比，因此可以在样品和处理之间量化代谢物和代谢途径的相对扰动。LMR 代谢组学为细菌学领域的研究铺平了道路，以探索视觉细菌和微生物（另一种致病性或非致病性微生物）的生理学和发病机制。

观看此视频后，您应该对如何制备用于 NMR 代谢组学的多种结核细胞提取物有很好的了解，重要的是保持整个方案的一致性以获得可靠的结果。