复用荧光免疫检测方法和故障排除
December 12th, 2011
使用Luminex公司的xMAP微球技术，我们开发了复用荧光免疫法（MFIA）为血清学监测各种实验室动物物种的。 MFIA是抗原，组织控制或免疫球蛋白共价连接到颜色编码的聚苯乙烯微球的悬浮液微阵列。解决MFIA测试方法以及各种疑难排解主题。
以下实验的总体目标是检测实验动物中针对外源传染源的抗体。这是通过将测试血清与抗原包被的微球一起孵育来实现的。接下来，将血清与生物素化的标记物种特异性抗免疫球蛋白一起孵育，该免疫球蛋白可检测任何抗原抗体免疫复合物。
然后加入链霉亲和素标记的 FICO eryn Fluor force 溶液，以检测根据多重荧光、免疫测定净评分、荧光样品值获得的任何生物素化免疫球蛋白结果，这些结果显示实验室啮齿动物中常见试剂的阳性或阴性抗体状态。与 Eliza 等现有方法相比，使用这种技术的主要优点是 MFIA 是一种多重检测。这使研究人员能够在一次检测中筛选多达一百种不同的检测方法。
好吧，这种技术减少了现有方法中使用的血清区域和一次性用品的数量，同时增加了单次测试产生的信息量。嗯，当我们为多种试剂测试大量血清样本并希望减少劳动力和测试时间时，我们第一次想到使用这种方法。我们实验室的高级技术专家 Donna Cohen 将演示该程序首先，准备好多重、荧光、免疫测定或 MFIA 程序所需的两种缓冲液。
第一种是初级稀释剂，可从 Charles River 获得，含有专有的封闭剂，以减少检测洗涤缓冲液的非特异性相互作用。制备 1% BSA pH 值为 7.4 的 PBS 溶液以去除颗粒。使用检测洗涤缓冲液通过 0.2 微米瓶顶装置将缓冲液过滤到无菌标记的容器中。
准备两种浓度的生物素化抗物质、IGG 或 BAG 和链球菌 AVID 以及 FICO erything 或 SPE，用于标记在测试血清孵育步骤中形成的抗原抗体复合物，以制备以下材料和一次性用品的样品组装多通道和单通道微移液管和吸头，以及用于蛋白质稀释的 96 孔低蛋白结合微量滴定板。采集血样并分离血清后，短暂涡旋血清，然后在 96 孔微量滴定板中用初级稀释剂稀释样品，以确保预湿时正确和均匀地排空孔。在整个检测过程中，含有检测洗涤缓冲液的 96 孔测试板的每个孔都会缓慢吸出溶液。
吸液应需要 5 到 10 秒，以防止微珠聚集和将微珠压实到滤膜中，这两者都会减慢检测结束时的读取时间。用纸巾吸干测试板的底面，验证液体引流是否已停止。重要的是在每次洗涤步骤后吸干测试板，以防止在孵育过程中从孔中芯吸出来。
要制备珠子，首先要涡旋原液偶联的珠子悬浮液。然后在浴中短暂地对它们进行超声处理。正确重悬磁珠以防止磁珠聚集至关重要，这会导致读取时间延长。
接下来，将 20 x 原液悬浮液分配到初级稀释剂中的 2 x 工作珠溶液中。然后将 50 微升的 2 x 珠子悬浮液分配到预润湿测试板的每个检测孔中。根据预定义的板图，将 50 μL 每 2 x 测试和对照血清移液到测试板中。
将盖子固定在板上。用铝箔覆盖，并在室温下在轨道振荡器上孵育测试板 60 分钟，以避免溶液蒸发，从而阻止测定成功。在所有孵育步骤中，请用板盖盖住测试板。
此外，振荡速度应大于 400 RPM，但小于 700 RPM，以便磁珠保持悬浮状态，以允许血清抗体进入偶联抗原的所有表面。用 BAG 和 SPE 连续孵育珠子洗涤板后，再次洗涤样品。然后加入 125 μL 测定法重悬磁珠，洗涤、缓冲并摇动 2 分钟以读取板。
在复苏悬浮磁珠后 10 分钟内将其放入检测读数仪中，磁珠一次通过一个通过检测器，在那里它们暴露在两个激光下。一种激光激发识别珠子颜色集合的内部染料，另一种激发 FICO erything 报告染料。当 FM FI 读取第一个孔以验证所选的珠子组是否与测试孔中的珠子曲线匹配时，报告预定数量的珠子的 FICO 红珠荧光强度。
如果有微珠落在方案显示上指定的微珠区域之外，则表示配置文件选择不正确。已正确重悬的微珠将填充其指定区域，如 assay reader 软件所示。如果磁珠聚集，它们将以缓慢的速度填充其区域。
您可以从读数仪中取出测试板，然后手动重悬孔以分离微珠。从读数仪中取出测试板，并使用多通道移液器三倍，每个孔 3 到 4 次。然后将测试板放回给读板机并继续检查结果。
报告微珠计数不足或 IgG 抗 IgG 微珠评分下降等错误，并对这些样品重复检测。将数据导出到 Excel 并计算净 MFI 后，确定除高范围免疫血清外是否有任何测试播放测定对照。任何失败的对照都是不可接受的，必须重复检测。
下表显示了来自典型检测板的检测血清和检测对照的数据。是否通过所有 IgG 对照。该游戏的检测结果表明，许多组织反应性和 IgG 对照样品失败，如橙色孔中所示。
A1C 1 和 F1 表示 TC 组织反应性失败，其中 TC 评分在括号中表示，孔 B 1 和 E 1 分别表示两种类型的 IgG 内部对照失败，即测试抗体或测试试剂不足，BAG 或 SPE。仅当系统适用性对照品和血清对照品符合此处所示的验收标准时，才会解释检测板结果。包被物种特异性抗试验血清免疫球蛋白的微球由于样品添加量过高、样品稀释度过高、物种不正确或来自免疫缺陷宿主的检测血清，可能会显示评分不合格。
如果测试播放检测控制结果令人满意，则根据以下内容对单个检测分数进行分类。按照此程序，我们应该使用 Eliza、IFA 和/或 Western blot 等其他方法来确认最初的意外或阳性结果。在做出任何动物管理决定之前验证这些结果至关重要。
这可以通过对同一样品或来自同一菌落的其他样品使用不同的方法来实现。观看此视频后，您应该对如何进行多重荧光、指标免疫测定以及解释在您的设施中获得的结果有很好的了解。这将使您能够减少劳动力，同时从每个测试样品井中收集更多信息。
概述
本研究介绍了使用Luminex公司的xMAP技术开发多重荧光免疫分析（MFIA）以用于实验动物的血清监测。MFIA允许同时检测多种传染病原体的抗体，提高了测试效率并减少了资源使用。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 血清学检测
- 实验动物健康
背景
- 传统的血清学方法如ELISA耗时且资源密集。
- MFIA实现了多重分析，允许同时筛查多种检测。
- 该方法旨在改进实验动物中抗体的检测。
- 高效使用血清样本和一次性用品是MFIA的一个主要优势。
研究目的
- 开发一种更高效的方法来检测实验动物中的传染病原体抗体。
- 减少与传统方法相关的劳动和测试时间。
- 在单次测试中提供抗体状态的全面评估。
使用的方法
- 用抗原包被的微球孵育测试血清。
- 使用生物素化的抗免疫球蛋白检测抗原-抗体复合物。
- 应用链霉亲和素标记的检测溶液进行荧光测量。
- 使用96孔微孔板格式进行多重分析设置。
主要结果
- 成功检测到实验动物中针对多种传染病原体的抗体。
- 与传统检测相比，血清体积和一次性用品的使用减少。
- 通过多重荧光分析提供了定量结果。
- 发现影响检测性能的珠子聚集的潜在问题。
结论
- MFIA是传统血清学方法的可行替代方案。
- 该技术提高了实验室环境中血清监测的效率。
- 可能需要进一步优化以解决技术挑战。
常见问题
Executive Industry Relevance
Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay (MFIA) addresses the need for high-throughput serosurveillance in preclinical research by enabling simultaneous detection of antibodies against multiple infectious agents. This capability reduces sample consumption, reagent use, and assay time while increasing data density per test well. For biopharma R&D, MFIA supports early-stage target validation and mechanistic de-risking by providing reliable, quantitative immune status data from limited preclinical sample volumes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through broad pathogen exposure profiling in animal models.
- Operational Value: Supports functional target validation by clarifying confounding variables from adventitious infections.
- Predictive Confidence: Enhances portfolio triage by identifying models with compromised immunological integrity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows through rigorous health status verification.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility via internal control beads (tissue, IgG, and system suitability controls).
- Scalability: Enables screening readiness for up to 100 assays per well, improving platform reuse in antibody screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by ensuring animal models are free from confounding infectious agents that could skew phenotypic readouts.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by maintaining model integrity across study phases.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports go/no-go criteria based on serological health status before compound administration.
Pipeline & Workflow Integration
MFIA fits within the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification and Preclinical work, serving as a gatekeeping step for model suitability before compound screening or efficacy testing.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing by verifying that observed phenotypes are not driven by subclinical infections.
- Screening: Describes assay readiness through quantitative net MFI outputs and built-in controls that ensure data reliability.
- Analytics: Highlights multiplex fluorescence measurements and net score calculations that enable comparison across test conditions and antigen panels.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by ensuring that disease-relevant systems remain immunologically naive or appropriately characterized.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for ongoing colony health monitoring across multiple projects and sites.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity from infectious confounders.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via multiplexed bead-based detection and internal controls.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk from undetected pathogen exposure.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on verified animal model health.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in immunoassay principles, Luminex technology, and multiplex data interpretation.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including a Luminex reader, plate shaker, and fluorescence detection system.
- Cross-team standardization requirements for reagent preparation, bead handling, and wash protocol consistency.
- Adaptation considerations across model systems, including species-specific antigen selection and control bead validation.
- Practical limitations supported by source material: bead aggregation affecting read times and the necessity of proper resuspension to avoid false negatives or elevated background.
