多重荧光免疫测定检测方法及故障排除

以下实验的总体目标是检测实验动物体内针对偶然感染性病原体的抗体。该检测通过将待测血清与包被抗原的微球共同孵育来实现。随后，将血清与生物素标记的种属特异性抗免疫球蛋白抗体孵育，以检测任何抗原-抗体免疫复合物。

然后加入链霉亲和素标记的 FICO eryn Fluor force 溶液，以检测任何生物素化的免疫球蛋白。根据多重荧光、免疫测定净评分和荧光样本值，获得的结果可显示实验啮齿动物中常见病原体的抗体阳性或阴性状态。与现有方法（如 ELISA）相比，该技术的主要优势在于 MFIA 是一种多重检测方法，使研究人员能够在单次检测中同时筛查多达一百种不同的指标。

该技术在减少现有方法中血清用量和一次性耗材使用量的同时，提高了单次检测所产生的信息量。最初，我们在对大量血清样本进行多种病原体检测时，希望降低工作量并缩短检测时间，因而提出了采用该方法的想法。本次实验操作将由本实验室高级技术员 Donna Cohen 进行演示。首先，准备好多重荧光免疫分析（MFIA）步骤所需的两种缓冲液。

第一种是初级稀释液，可从Charles River公司获得，其中含有专有的封闭剂，用于减少检测洗涤缓冲液中的非特异性相互作用。配制含有1% BSA、pH 7.4的PBS溶液以去除颗粒物。使用检测洗涤缓冲液，通过0.2微米瓶顶滤器将缓冲液过滤至无菌并已标记的容器中。

准备两种浓度的生物素化抗物种抗体（IGG 或 BAG）以及链霉亲和素（strep AVID）和异硫氰酸荧光素（FICO erything）或 SPE，用于标记在测试血清孵育步骤中形成的抗原-抗体复合物。准备以下材料和一次性耗材：多通道和单通道微量移液器及吸头，以及用于蛋白质稀释的 96 孔低蛋白结合微孔板。采集血液样本并分离血清后，在 96 孔微孔板中用初稀释液稀释样本前，先将血清短暂涡旋混匀。为确保各孔充分且均匀地排空，在每次检测前用检测洗涤缓冲液预润洗 96 孔检测板的每个孔，并在整个检测过程中缓慢吸出溶液。

吸取过程应持续5到10秒，以防止磁珠聚集或将磁珠压入滤膜，这两种情况均可能导致检测结束时读数时间延长。用纸巾轻拭检测板底部，确认液体已完全排净。每次洗涤步骤后均需轻拭检测板，以防止孵育过程中液体通过毛细作用从孔中析出。

准备磁珠时，首先涡旋振荡偶联磁珠的储存悬浮液，然后在水浴中超声处理片刻。充分重悬磁珠至关重要，以防止形成磁珠聚集体，否则可能导致读取时间延长。

接下来，将20倍浓缩的悬浮液加入主要稀释液中，配制成2倍工作浓度的磁珠溶液。然后，将50 µL的2倍磁珠悬浮液分别加入已预湿的检测板各检测孔中。根据预先设定的板图，用移液器将每种2倍稀释的待测血清和对照血清各50 µL加入检测板中。

将板盖固定在板上。用铝箔包裹，并将检测板在室温下置于旋转摇床上孵育60分钟，以避免溶液蒸发，防止影响检测结果。在所有孵育步骤中，均应保持检测板加盖板盖。

此外，振荡速度应大于400但小于700 RPM，以使磁珠保持悬浮状态，从而使血清抗体能够接触到偶联抗原的所有表面。在依次使用BAG和SPE对磁珠进行孵育并洗涤微孔板后，再次洗涤样品。然后加入125 µL检测洗涤缓冲液重悬磁珠，并振荡两分钟以读取微孔板结果。

在重悬珠子后的10分钟内将其放入检测仪中，珠子将逐个通过检测器，并暴露于两束激光下。其中一束激光激发珠子内部的染料，以识别珠子的颜色编码，另一束激光则激发FITC标记的报告染料。系统会报告预设数量珠子的FITC荧光强度，作为FM FI值；首先读取第一个孔，以确认所选的珠子微阵列与检测孔中的珠子特征相匹配。

如果在实验方案显示界面上有微珠落入其指定微珠区域之外，则表明选择了错误的分析谱型。正确重悬的微珠将按照检测读取软件中所示，填充至其对应的特定区域。如果微珠发生聚集，其填充区域的速度将会较慢。

可将检测板从读板仪中取出，手动重悬各孔以分离磁珠。从读板仪中取出检测板，使用多通道移液器对每个孔上下吹打三至四次。然后将检测板放回读板仪，继续分析结果。

报告错误情况，例如微球计数不足或IgG抗IgG微球评分下降，并对这些样本重复检测。将数据导出至Excel并计算净MFI后，确定是否有任何测试样本的检测对照（不包括高浓度免疫血清）不符合要求。任何失控的对照均不可接受，必须重复检测。

本表格展示了一块典型检测板中测试血清和检测对照的数据。所有IgG对照均未通过。该检测板的检测结果表明，多个组织反应性样本和IgG对照样本均未通过，如橙色孔位所示。

A1C1 和 F1 表示 TC 组织反应性失败，其中括号内为 TC 评分；B1 和 E1 分别显示了两种类型的 IgG 内部对照失败，即测试抗体或测试试剂不足，分别为 BAG 或 SPE。仅当系统适用性对照和血清对照符合此处所示的可接受标准时，才对测试板结果进行判读。包被有物种特异性抗测试血清免疫球蛋白的微球可能因样本添加量不足、样本稀释度过高、物种错误或使用免疫缺陷宿主的血清进行检测而导致失败评分。

如果测试性攻毒试验对照结果令人满意，则根据以下标准对各项试验结果进行分类。按照此流程，我们应采用ELISA、IFA或Western blot等其他方法，来确认初始试验中出现的意外或阳性结果。在做出任何动物管理决策之前，验证这些结果至关重要。

这可以通过对同一样本或来自同一菌落的额外样本采用不同的方法来实现。观看本视频后，您应能够充分理解如何在您所在机构进行多重荧光免疫测定，并解读所得结果。这将使您能够在减少劳动量的同时，从每个测试样本孔中获取更多信息。