基于亲和力，外的相互作用筛选（AVEXIS）外低亲和力受体 - 配体相互作用的可扩展检测

该程序的总体目标是发现参与细胞识别过程的新型细胞外蛋白质相互作用，特别是膜包埋的受体蛋白。AveXis 方法旨在规避这类蛋白质相互作用中非常弱的相互作用亲和力，以及膜蛋白难以生化纵的事实。这是通过首先编译细胞表面受体细胞外区域的重组蛋白文库来实现的。

这是通过设计表达质粒以将受体的胞外结构域区域作为可溶性片段作为单体生物素化诱饵和五聚体酶标记的赞美来实现的。第二步是表达和标准化蛋白质，以便为相互作用筛选做好准备。所有蛋白质都在哺乳动物细胞中产生，以确保添加翻译后修饰，例如 diss、硫化物、键和糖基化。

该方案中的一个关键步骤是确保文库中的诱饵和猎物蛋白都标准化到阈值水平以内。接下来是令人兴奋的部分，筛选新的交互。将 Bates 排列到微孔板的各个孔中，然后使用 PRAISE 探测相互作用。

然后执行洗涤步骤。最后一步是添加酶的底物，以检测诱饵蛋白阵列上捕获的任何赞美。最终，VEX 筛选的结果可以显示哪些 Cell Surfers 受体能够形成结合伴侣，因此可能参与细胞之间的识别和通信过程。

这种技术的主要优点是流行的蛋白质提取方法，如酵母两种杂交或生化纯化，是专门设计用于检测细胞外蛋白质蛋白质的相互作用。它特别适用于发现膜栓系受体蛋白之间的新相互作用。这些相互作用很难使用其他技术检测，因为膜蛋白在生化上难以纵，并且通常它们的抗受体相互作用非常弱。

这种方法可以帮助回答与细胞如何识别和相互通信有关的关键问题。在分子水平上，它可用于回答与基本生物过程相关的问题，例如卵子和精子表面显示的哪些受体蛋白相互结合，或者哪些受体配体相互作用负责细胞行为，例如肌细胞融合或神经嵴形成。这种方法的主要挑战是编译诱饵和祈祷蛋白文库，在其中筛选相互作用。

确保诱饵和猎物蛋白在检测所需的阈值水平内正常化也非常重要。这减少了假阴性和假阳性频率。我在攻读博士学位期间第一次想到这种方法，当时我试图确定 CD 200 细胞表面蛋白的结合伴侣。

本质上，我是在问这个问题，这种特定细胞表面受体的结合模式是什么？即使在今天？这在当时仍然是一个技术上难以回答的问题，但是，人类基因组已接近完成，我意识到，因为我们现在有基因组中所有细胞表面受体的完整列表，我们现在可以在这组受体蛋白中询问哪些受体蛋白可以在技术上相互作用。

这是一个更容易回答的问题，而 AveXis 是我们开发的回答方法。建立诱饵和预表达载体文库后，准备将它们转染到 HEC 2 9 3 E 细胞中，首先在转染前一天以每毫升 250， 000 个细胞的密度接种到 50 mL 自由式 2 9 3 培养基中，以确保有效的生物素释放。在制备所有板的情况下，用 d 生物素补充用于生产诱饵蛋白的培养基，而不是猎物蛋白，在标准条件下孵育细胞过夜。

由于生物素的溶解度低且溶液准确，因此我们倾向于称出额外的生物素，然后添加到培养基中并在第二天剧烈摇晃。使用合适的转染试剂，用 25 μg 诱饵或猎物质粒转染 50 mL 培养细胞，以产生生物素化诱饵 cot 转染。诱饵构建体以 10：1 的比例与编码分泌形式的 ELI 蛋白生物素连接酶的质粒每次收获。

转染后 5 天，首先以 3000 倍重力离心 20 分钟，使细胞变白，然后通过 0.22 微米过滤器过滤 S 上清液。AveXis 的主要特点之一是，由于重组蛋白是分泌的，因此可以将其稀释或浓缩至阈值活性范围内。我们发现重组蛋白的表达可变性高达四个数量级，因此归一化步骤减少了筛选步骤中假阳性的发生。

为了开始诱饵的正常化，必须通过透析从培养基中去除未偶联的 de 生物素，因为它会竞争生物素化的诱饵蛋白与结合位点的链球蛋白结合，首先将诱饵固定在透析管中。为了确保重组蛋白的有效透析，我们发现为透析管提供多余的表面积很重要。通常，我们提供的管路数量是透析体积实际需要的 2 到 3 倍。

在 24 小时内，在透析后用合适的缓冲液（如 PBS）对诱饵进行广泛透析。ELIZA 首先用含有 BSA 的 PBST 封闭链球菌编码的微小板的孔 15 分钟。同时，在干净的板上，用 2% BSA 在 PBST 中对诱饵蛋白进行四次一到三次的稀释。

孵育 15 分钟后，将稀释液转移到链球菌 TTR 编码板中，一小时后在室温下孵育板 1 小时，清洗孔，然后向每个孔中加入 100 微升每毫升 2 微克 OX 68。将板在室温下再孵育一小时。第二次孵育后，进行另一次洗涤系列，并在板中加入抗 US 碱性磷酸酶。

将板在室温下孵育第三个小时。现在在 PBST 中洗涤板 3 次，然后进行最后的 PBS 洗涤。要去除任何残留的去污剂，请在一小时后在二乙醇胺缓冲液中加入 100 微升每毫升 1 毫克的底物 1 0 4。

在室温下测量 4 0 5 纳米的吸光度，Eliza 使用抗 CD 四标签单克隆抗体检测四种不同透析诱饵 supinate 的稀释系列。如果未稀释的表达诱饵蛋白不足以使 strep avid ENC 包被板的所有生物素结合位点饱和，则使用 Viva 离心浓缩器浓缩蛋白质。否则，使用稀释浓度的 PBST 和 2% BSA 的诱饵蛋白。

这足以使测定的生物素结合位点饱和。使用 β 内酰胺酶活性定量前蛋白表达的相对水平。首先在 PBST 2%BSA 缓冲液中制备含有副蛋白的孢子的稀释系列。

然后将 20 微升稀释液加入 60 微升装在板中的亚硝酸 stepin 溶液中。立即将板转移到读板器上，并在接下来的 20 分钟内使用离心浓缩器或用 2%BSA 稀释的 PBST 每分钟测量一次 4 85 纳米的吸光度。设置样品的最终浓度，在大约 7 分钟内水解测定中的所有亚硝基，即每分钟约 2 ol 亚硝基周转。

通过在 PBST 中洗涤链球菌 TAVR ENC 涂层板并用纸巾将板拍干来开始 AveXis 筛选。接下来，向每个孔中加入含 BSA 的 PBST，并将板孵育 30 分钟。这会阻断虚假的蛋白质结合位点。

在每个孔中，在水槽上轻轻弹板，去除封闭溶液，并将 100 微升标准化生物素化单体诱饵添加到适当的孔中。将板在室温下孵育一小时。然后再次轻弹从盘子中取出诱饵样品，并用 PBST 洗掉 3 次。

然后在第三次洗涤后敲干。现在向每个孔中加入 100 μL 标准化五聚体 Prey 构建体，并在室温下孵育板 1 小时。一小时后，用 PBST 再给板洗 3 次，最后只用 PBS 洗。

最后，向每个孔中加入 60 μL 亚硝酸 7 溶液，并在室温下孵育板 2 小时，或者最好将板在 4 度 SIU 下孵育 16 小时。第二天，积极的互动将变为红色。拍摄板的照片以进行视觉记录，然后使用读板器以 4 85 纳米的吸光度量化反应。

从 AveXis 筛选反应开始约 10 分钟后，抗体介导的猎物捕获对照和阳性对照相互作用中均出现黄色到红色的变化。这种颜色变化表明底物中的亚硝酸水解。在这个时间尺度上可以观察到一些积极的互动，但大多数需要几个小时才能出现。

通常，观察到的阳性命中率约为 0.4% 至 0.6%。准备好蛋白质文库后，可以快速完成该技术的筛选部分。在识别交互作用后，很有可能在一天内筛选多达 12 个板。

最重要的下一步是首先证明可以使用新鲜的独立蛋白质制剂重复相互作用。其次，我们总是确定相互作用是否独立于诱饵猎物的方向，也就是说，它可以相互吗？这涉及将诱饵载体结构域克隆到猎物载体中，反之亦然。

可以重复和相互的交互被认为是高置信度的，并且始终被证明是积极的。使用表面等离子体共振等其他技术，我们喜欢使用表面等离子体共振来额外验证我们重新识别的任何相互作用。重要的是，这证明了两种纯化的组分可以直接相互作用，并且还可以用于表明结合是 SAT 的，因此具有特异性。