Name: 基于亲和力，外的相互作用筛选（AVEXIS）外低亲和力受体 - 配体相互作用的可扩展检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: 了解AVEXIS高通量筛选技术，用于检测细胞膜受体与配体之间的低亲和力相互作用。该方法通过重组蛋白文库和酶标检测，帮助研究人员发现细胞识别过程中的新型蛋白质相互作用。

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本工作由惠康信托基金授予 GJW 的资助号 [077108] 支持。

1. 构建诱饵和猎物质粒表达载体文库
<ol>
	<li>整理一份拟用于筛选相互作用的细胞表面受体和分泌蛋白的列表，并从合适的蛋白质序列数据库中获取其序列。大多数含有N端分泌信号肽的蛋白质均适用于此目的（包括I型、GPI锚定型和分泌型蛋白质）。通常会选择一个蛋白质家族（例如免疫球蛋白超家族，或仅限于特定细胞类型如红细胞的所有受体）。</li>
	<li>利用蛋白质特征预测软件确定信号肽和跨膜区域的位置，以界定胞外区的范围。我们通常使用SignalP v3.05和TMHMM v2.06。</li>
	<li>设计引物组，用于扩增每个受体的完整胞外域片段。我们拥有一系列适用于此目的的诱饵和猎物载体，可从Addgene获取（<a href="http://www.addgene.org/">http://www.addgene.org/</a>）。正向引物应围绕起始甲硫氨酸设计，包含一个NotI限制性酶切位点和一个优化的Kozak序列；其后接25个碱基的完全匹配基因特异性序列（图2A）。</li>
	<li>设计反向引物，在预测的跨膜区之前截断I型受体蛋白，以便将整个胞外域表达为可溶性重组蛋白。该引物中应包含AscI限制性酶切位点，使其翻译后与C端大鼠Cd4d3+4蛋白标签保持阅读框一致7（图2A）。</li>
	<li>使用上述引物扩增所有基因的胞外域片段，并将其克隆至诱饵或猎物载体中。我们有时发现先将其克隆至穿梭载体，再亚克隆至合适的哺乳动物表达载体中更为便利；我们使用pTT3载体的一个衍生物3,4。诱饵和猎物载体均含有C端蛋白标签（图2B）。
	<ol>
		<li>诱饵：标签包含大鼠Cd4蛋白的第3和第4结构域（Cd4d3+4），其后接一段可作为E.coli BirA酶底物的肽序列，因此可在特定赖氨酸残基上进行单生物素化（图2B）。Cd4d3+4标签可被OX68单克隆抗体识别，用于通过ELISA定量检测诱饵蛋白的表达水平。因此，诱饵蛋白为单体且单生物素化。另有其他诱饵蛋白载体可供选择，其中可生物素化肽段被6×His标签取代，用于蛋白纯化。</li>
		<li>猎物：猎物也包含大鼠Cd4d3+4标签，其后接一段来自大鼠软骨寡聚基质蛋白（COMP）的肽序列以及一个C端β-内酰胺酶。COMP肽段可确保猎物表达后形成五聚体（图2B）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 捕食蛋白与诱饵蛋白的表达
我们采用一种便捷的高水平表达系统，利用HEK293E细胞系的悬浮培养4来制备蛋白质文库，但任何哺乳动物表达系统均应适用。一种可商业获得的替代系统是Freestyle系统。细胞通常在摇床平台上培养（125 r.p.m.），条件为37 °C、5% CO2及70%相对湿度。必须同时表达阳性和阴性对照蛋白。大鼠Cd4d3+4仅含标签片段可作为诱饵和猎物使用，适合作为阴性对照。类似地，编码阳性对照的诱饵和猎物载体也可获得（Addgene）；我们通常使用大鼠Cd200-Cd200R相互作用8作为阳性对照。
<ol>
	<li>转染前一天以 2.5 x 10 的密度接种 HEK293E 细胞5 细胞/mL-1我们通常按照制造商的建议，在50 mL的Freestyle293培养基中常规培养细胞。为确保高效的生物素标记，需在用于表达诱饵蛋白的细胞培养基中添加D-生物素，使其终浓度达到 100 μM表达猎物蛋白所用的培养基无需额外添加D-生物素。</li>
	<li>次日，使用合适的转染试剂（例如 293fectin）对细胞进行转染。使用 25 μg 将诱饵或猎物质粒构建体转染至50 mL培养物中。 为制备生物素标记的诱饵，将编码诱饵构建体的质粒与编码分泌型形式的质粒共转染 E.coli 蛋白-生物素连接酶（BirA），可从 Addgene 获取。以 10:1 的比例共转染诱饵质粒2.5 μg编码分泌型BirA蛋白的质粒的)</li>
	<li>转染后第五天收获细胞，首先通过3000 x g离心沉淀细胞g 20分钟，随后将上清液通过滤膜过滤 0.22 μM 过滤器</li>
</ol>
[提示：诱饵蛋白和猎物蛋白应以未稀释状态在 4°C 下保存，通常建议在一年内使用。添加抑菌剂如 50 μg/mL 硫酸多粘菌素 B 或 10 mM NaN3，以防止上清液受到细菌污染。]
3. 钓饵样本与猎物样本的标准化
AVEXIS 检测的一个关键特征是，由于重组蛋白是分泌表达的，因此可在用于检测前将其稀释或浓缩（标准化）至已确定的阈值活性范围内。我们发现重组蛋白的表达水平跨度很大，可达四个数量级，因此标准化步骤显著减少了筛选过程中的假阳性数量。
3.1 诱饵归一化
注意：必须从培养基中去除未结合的D-生物素（通常通过透析法），因为它会与生物素化的诱饵蛋白竞争结合链霉亲和素的结合位点。
<ol>
	<li>将诱饵上清液转移至透析袋中，标记并牢固夹紧，然后在适当的缓冲液（如 PBS）中进行充分透析，以去除游离生物素。</li>
</ol>
[提示：我们发现，通常将6份50 mL诱饵上清液与4.5 L PBS缓冲液进行透析，24小时内更换4次缓冲液，即可达到充分的透析效果。若透析不充分，在诱饵标准化步骤中低倍稀释时可观察到蛋白结合受到抑制（图3A）。
<ol start="2">
	<li>通过 ELISA 检测诱饵蛋白的相对表达水平。制备生物素标记的诱饵蛋白系列稀释液，并将其捕获至链霉亲和素包被的微孔板上。利用大鼠 Cd4d3+4 标签，通过单克隆抗体（OX68）检测并定量被捕获的诱饵蛋白。将诱饵蛋白浓缩或稀释至足以饱和链霉亲和素包被板孔中所有生物素结合位点所需的最低量。</li>
	<li>用磷酸盐缓冲液/0.1% Tween-20（PBST）/2% 牛血清白蛋白（BSA）封闭链霉亲和素包被板的孔，封闭时间为 15 分钟。</li>
	<li>在另一块板中，用 PBST/2% BSA 将诱饵蛋白进行系列稀释（通常进行四次 1:3 稀释即可），然后转移至链霉亲和素包被板的孔中。室温孵育 1 小时。</li>
	<li>用 PBST 洗涤 3 次，每孔加入 100 μL 浓度为 2 μg/mL 的小鼠抗大鼠 Cd4d3+4 IgG（OX68），室温孵育 1 小时。</li>
	<li>用 PBST 洗涤 3 次，每孔加入 100 μL 以 PBST/2% BSA 按 1:5,000 稀释的碱性磷酸酶标记抗小鼠抗体，室温孵育 1 小时。</li>
	<li>用 PBST 洗涤 3 次，并用 PBS 进行最后一次洗涤，以去除任何残留的去垢剂。每孔加入 100 μL 二乙醇胺缓冲液中的 1 mg/mL 底物 104（10% 二乙醇胺（v/v），0.5 mM MgCl2，10 mM NaN3，pH 9.8，避光保存于 4 °C）。</li>
	<li>1 小时后，在 405 nm 处测定吸光度。诱饵蛋白标准化的代表性结果如图 3A 所示。</li>
	<li>对于未经稀释使用时表达水平不足以饱和链霉亲和素包被板所有生物素结合位点的诱饵蛋白，应使用 Vivaspin 浓缩器（Vivascience，10 kDa 截留分子量）进行浓缩。作为参考，我们估计约 5 μg 的典型诱饵蛋白（约 80 kDa）足以饱和一块 96 孔板。
	<ol>
		<li>高表达水平的诱饵蛋白可在 PBST/2% BSA 中稀释至足以饱和链霉亲和素包被板的浓度。稀释或浓缩后应重新检测诱饵蛋白的活性，以确保其能够饱和链霉亲和素包被板中的所有生物素结合位点。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3.2 捕食者标准化
<ol>
	<li>使用β-内酰胺酶活性定量检测猎物蛋白的相对表达水平。</li>
	<li>首先，在PBST/2% BSA缓冲液中对含有猎物蛋白的上清液进行系列稀释，然后将20 μL稀释液加入60 μL的242 μM（0.125 mg/mL）硝基头孢菌素溶液（Calbiochem）中。</li>
	<li>立即将该板转移至微量板读数仪，在室温下每隔1分钟测量一次485 nm处的吸光度，持续20分钟。典型的猎物蛋白归一化结果如图3B所示。</li>
	<li>使用离心浓缩器浓缩样品，或在PBST/2% BSA中稀释，使硝基头孢菌素的转换率达到约2 nmol min-1的阈值活性。实际操作中，若硝基头孢菌素在约7分钟内完全水解，则视为达到该标准。</li>
</ol>
4. AVEXIS 筛选流程
<ol>
	<li>用 PBST 洗涤链霉亲和素包被的酶标板。</li>
	<li>每孔加入 100 μL PBST/2% BSA，孵育 30 分钟，以封闭每孔中可能存在的非特异性蛋白结合位点。</li>
</ol>
[提示：洗涤步骤后，为去除残留的洗涤缓冲液，可将酶标板在纸巾上用力轻敲]
<ol start="3">
	<li>将板子在水槽上方轻轻敲击以去除封闭液，每孔加入 100 μL 经标准化的生物素化单体诱饵，于室温孵育 1 小时。</li>
	<li>将板子倒置并在水槽上方轻敲以移除诱饵样品，用 PBST 洗涤 3 次。</li>
	<li>每孔加入 100 μL 经标准化的五聚化猎物构建体，于室温孵育 1 小时，按步骤 4.4 进行洗涤，并用 PBS 进行最后一次洗涤。</li>
	<li>每孔加入 60 μL 的 242 μM 硝基头孢菌素溶液（将 5 mg 硝基头孢菌素溶于 500 μL DMSO 中，充分混匀，再用 40 mL PBS 稀释，并经 0.22 μM 滤器过滤后加入板中），于室温孵育。由于黄色的硝基头孢菌素被水解为红色产物，阳性相互作用可肉眼观察。使用酶标仪在 485 nm 处读取吸光度进行定量。图 4 展示了典型的板式结果与定量数据。</li>
</ol>
[提示：通常在室温下2小时内可观察到阳性反应，但为了确保检测到所有可能的相互作用，应将培养板置于4°C下16小时。我们还发现，硝基头孢烯（nitrocefin）沉淀以及微量滴定板塑料表面的缺陷（如划痕或指纹）有时会导致在485 nm处出现人为的假阳性信号，即使并未发生明显的硝基头孢烯水解。因此，建议对培养板拍照，以直观记录各孔中硝基头孢烯的转化情况。]
5. 代表性结果
图4展示了一个具有代表性的AVEXIS筛选板示例。在阳性对照孔中（包括抗体介导的猎物捕获对照以及阳性相互作用对照），通常在约十分钟内应观察到硝基头孢菌素底物发生水解反应（颜色由黄色变为红色）。在筛选过程中，部分相互作用在此时间范围内即可被观察到，但其他相互作用可能需要更长时间（数小时）才能显现。通常情况下，筛选的阳性率约为0.4–0.6%（即每检测150至250个相互作用中会出现一个阳性结果），具体数值取决于所使用的蛋白文库。
<img alt="细胞相互作用示意图；受体文库与AVEXIS检测用于结合分析。" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 利用AVEXIS鉴定介导细胞识别过程的受体-配体相互作用。示意图展示了两个相互作用的细胞（A和B），通过跨膜受体蛋白之间的相互作用进行信息交换。AVEXIS是一种可扩展的蛋白质相互作用检测方法，专门用于鉴定具有极弱相互作用强度的新型受体-配体对。该方法构建了代表两类细胞表面受体全外结构域的重组可溶性蛋白文库，分别作为五聚体β-内酰胺酶标记的“猎物”（细胞类型A）或单体生物素标记的“诱饵”（细胞类型B）。将“猎物”蛋白五聚化可提高外结构域的局部浓度，从而增强整体结合价，使得即使是非常短暂的相互作用也能被检测到。将“诱饵”文库固定在链霉亲和素包被的微孔板上，并系统地检测其与“猎物”蛋白的相互作用。经过短暂洗涤后，通过检测“猎物”蛋白所带有的β-内酰胺酶活性来确认是否捕获到结合的“猎物”。
<img alt="CD200 克隆示意图；带有蛋白质相互作用分析的 HEK293 转染设置。" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 诱饵与猎物表达载体的设计。（A） 以大鼠 Cd200 受体蛋白为例，说明如何确定细胞表面受体蛋白的完整胞外域，并据此设计引物以构建诱饵和猎物表达载体。图中显示了从 N 端信号肽至跨膜区的大鼠 Cd200 的 cDNA 及其翻译后的蛋白序列。正义引物设计包含一个 5' 端 NotI 限制性酶切位点和优化的 Kozak 序列，随后是与 Cd200 cDNA 序列完全匹配的 25 个碱基。反义引物包含一个 AscI 位点以及位于所选胞外域截断残基上游紧邻处的 25 个完全匹配碱基序列。为了使胞外域与大鼠 Cd4d3+4 标签保持正确的阅读框，AscI 位点应编码 Gly-Ala-Pro 三肽。（B）诱饵与猎物表达载体的示意图。每个载体均包含位于 NotI 和 AscI 位点之间的受体胞外域及 Cd4d3+4 标签。诱饵载体含有一个 C 末端肽序列，可通过与表达分泌型 BirA 酶的质粒共转染，实现特异性单生物素化。猎物载体则在其后连接了来自软骨寡聚基质蛋白（COMP）的五聚化序列以及 β-内酰胺酶。
<img alt="吸光度与诱饵蛋白稀释度及时间的关系；405nm，485nm；双图分析；科学数据。" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 诱饵蛋白与猎物蛋白的标准化。（A）诱饵蛋白标准化的代表性示例。使用抗Cd4标签单克隆抗体通过ELISA检测四种不同透析后的诱饵上清液梯度稀释样品。四种诱饵蛋白的表达水平各不相同：1＞2＞3＞4。应将诱饵蛋白标准化至某一阈值水平，以使每孔中的生物素结合位点达到饱和。高表达的诱饵蛋白可进行稀释以节省蛋白用量（例如诱饵1可稀释约1:100），而低表达的诱饵蛋白则应浓缩。在某些诱饵蛋白中，低稀释倍数时有时会出现信号降低的现象（例如诱饵2），这归因于透析不完全导致存在未结合的D-生物素。（B）通过β-内酰胺酶底物硝基头孢啉（nitrocefin）的水解速率来定量猎物蛋白的表达水平。在所示示例中，三种猎物蛋白的表达水平不同：猎物1＞2＞3。猎物蛋白应标准化至约2 nmol min-1的活性水平，相当于在约7分钟内完全水解14.5 nmol的硝基头孢啉（例如猎物1）。本示例中的其他猎物蛋白在用于筛选前应进行浓缩处理。
<img alt="微量滴定板检测图表；485 nm 处的吸光度；实验结果；高通量筛选。" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. AVEXIS 筛选的代表性结果。（A） 一个代表性 AVEXIS 筛选板的照片。一种猎物蛋白被用于检测与 41 种不同诱饵蛋白的相互作用，其中在 E2 孔中检测到阳性相互作用。筛选板中使用的对照包括：用于捕获加入孔中所有猎物蛋白的生物素化抗 Cd4 抗体（G6）；对照相互作用：大鼠 Cd200（诱饵）-Cd200R（猎物），其中 Cd200R 猎物蛋白分别以临界稀释度（H3）、1:10（H4）和 1:100（H5）使用。阴性对照包括：以待测猎物蛋白检测 Cd4d3+4 诱饵蛋白（H1），以及 Cd200R 猎物蛋白（H2）。（B）同一样本三次重复实验的吸光度值定量结果。数据点表示均值 ± 标准差。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在活体（in vivo）观察活细胞时，其质膜表现出高度动态的行为：在与邻近细胞接触和通讯时，不断延伸和回缩膜突起2。介导这些接触的膜嵌入型受体蛋白之间的物理相互作用已进化得极为微弱，以允许这种高度活跃的运动行为。据估计，在生理性的受体密度下，单体相互作用强度低至50 μM就足以驱动自发的相互作用9，这使得检测新的相互作用极具挑战性2,10。本文所述的AVEXIS方法提供了一种灵敏的方法，可用于检测短暂的细胞外蛋白质-蛋白质相互作用，并且能够以可扩展的方式实施，同时具有较低的假阳性率。尽管已有其他可扩展的方法被开发用于检测细胞外相互作用11-15，但AVEXIS的一个优势在于，其实验参数（如诱饵和猎物蛋白的活性）已被量化，能够在保持低假阳性率的同时，检测到最微弱的相互作用（t1/2 ≤ 0.1 s）3。此外，该方法流程简化且样品制备稳健，使其相比其他检测方法更易于大规模实施；我们最近报道了一项系统性相互作用筛选研究，共检测了约16,500种潜在的相互作用16。
该检测适用于任何能够表达可溶性重组蛋白片段的蛋白质。因此，这包括含有N端信号肽的蛋白质，如I型、GPI锚定型和分泌型蛋白质。我们最近设计了一套载体系统，现已能够将II型蛋白质作为诱饵进行表达17。该检测通常不适用于多次跨膜蛋白，例如离子转运蛋白或泵蛋白，因为这些蛋白在质膜环境之外难以正确折叠。我们已将该方法应用于多种不同体系，并成功表达了来自斑马鱼3,16,18、人类、小鼠以及P. falciparum的胞外蛋白，用于相互作用筛选。
在建立AVEXIS筛选系统所需的资源方面，我们发现一个主要的瓶颈是表达质粒的选择、构建和全序列测定。该步骤可能需要长达一年的时间来制备约100个诱饵和猎物载体；然而，随着基因合成成本的不断降低，我们目前倾向于将这一部分工作外包给商业公司完成。结合哺乳动物表达系统与大型摇动式组织培养箱（我们使用的是INFORS HT Multitron Cell），单名研究人员每月可表达并标准化多达约100种诱饵和猎物蛋白。蛋白制备并标准化后，相互作用的筛选过程非常迅速，每天可方便地处理多达十二块96孔板。为了便于大量蛋白的生产，我们唯一专门开发的设备是一种由压缩空气驱动的活塞装置，可用于平行地将最多五个上清液样本同时通过0.22 μm滤膜过滤。
与文献中预期的相互作用相比，主要可能遗漏的相互作用类型（假阴性）是同源性相互作用，尽管其中部分相互作用仍可被检测到3。在预期相互作用未能被检测到的情况下，我们认为这是由于猎物蛋白形成了同源性相互作用（一种“猎物屏蔽”效应），从而阻止了其与固定化的诱饵蛋白进一步结合。检测到相互作用的频率取决于所筛选蛋白文库的组成。作为参考，对斑马鱼免疫球蛋白超家族中&gt;30,000个相互作用进行筛选，获得了188个阳性结果，频率为0.6%3,16,18。一种可快速验证任何阳性结果的简便方法是检测该相互作用是否能在诱饵-猎物两种方向上均被检测到；即无论结合蛋白作为诱饵还是猎物，该相互作用是否均可被检测到。每当观察到这种互换性结合行为时，后续均通过表面等离子共振技术验证了纯化蛋白之间的直接可饱和结合，证实其结合具有特异性。需要强调的是，由于我们通过人工五聚化猎物蛋白以增强结合的亲合力，因此本实验不适用于对相互作用强度进行定量比较。为了获得相互作用的生物物理结合参数，我们使用单体蛋白并结合表面等离子共振技术。最后，一旦鉴定到某个相互作用，由于该实验具有高通量特性，可相对容易地将其改造用于筛选阻断该相互作用的试剂，如抗体或小分子化合物。

<table><tbody><tr><td>Freestyle培养基</td><td>Invitrogen</td><td>12338018</td><td></td></tr><tr><td>硝基头孢</td><td>Calbiochem</td><td>484400</td><td></td></tr><tr><td>SA包被的微孔板</td><td>Nalge Nunc international</td><td>734-1284</td><td></td></tr><tr><td>OX68抗体</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA1022R</td><td></td></tr><tr><td>透析袋</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>PN68100</td><td></td></tr><tr><td>多粘菌素B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4932</td><td></td></tr><tr><td>D-生物素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639-5G</td><td></td></tr><tr><td>底物-104</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1040-506</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin-20离心浓缩器</td><td>Sartorius AG</td><td>VS2002</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m滤器</td><td>Nalge Nunc international</td><td>190-2520</td><td></td></tr></tbody></table>

基于亲合力的细胞外相互作用筛选（avexis）用于可扩展检测低亲和力细胞外受体-配体相互作用

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

分泌型或膜锚定蛋白之间的细胞外蛋白质-蛋白质相互作用对于启动细胞间通讯以及维持多细胞生物体的结构完整性至关重要。据预测，编码可形成细胞外相互作用蛋白的人类基因约占人类基因总数的四分之一1，但尽管这些蛋白具有重要性和丰富性，其中大多数蛋白至今尚未有明确记录的结合伴侣。这主要归因于其生化性质难以处理：膜整合蛋白难以在其天然构象下溶解，且含有对结构至关重要的翻译后修饰。此外，受体蛋白之间的相互作用亲和力通常极弱（半衰期&lt;1秒），导致许多常用的高通量方法无法检测到这些相互作用2。
本文介绍一种名为AVEXIS（基于亲和力的细胞外相互作用筛选，AVidity-based EXtracellular Interaction Screen）的检测方法，该方法克服了上述技术难题，能够以较低的假阳性率检测到极弱的蛋白质相互作用（半衰期 t1/2 ≤ 0.1 秒）3。该检测通常以高通量形式进行，可在标准微孔板中系统性地筛选数千种相互作用（图1）。该方法依赖于构建包含细胞表面受体或分泌蛋白胞外域片段的可溶性重组蛋白文库，用于相互作用的筛选；因此，该策略适用于I型、II型、GPI锚定型细胞表面受体以及分泌蛋白，但不适用于离子通道或转运蛋白等多次跨膜蛋白。
利用一种便捷且高效的哺乳动物表达系统来产生重组蛋白文库4，以确保添加重要的翻译后修饰，如糖基化和二硫键。表达的重组蛋白被分泌到培养基中，并以两种形式产生：一种是可被固定在链霉亲和素包被的固相载体上用于筛选的生物素标记“诱饵”蛋白，另一种是五聚化酶标记（β-内酰胺酶）的“猎物”蛋白。诱饵蛋白与猎物蛋白以二元方式相互呈现，以检测它们之间的直接相互作用，类似于传统的ELISA方法（图1）。猎物蛋白的五聚化是通过软骨寡聚基质蛋白（COMP）的一段肽序列实现的，可提高胞外结构域的局部浓度，从而显著增强结合能力，使即使是极为短暂的相互作用也能被检测到。在筛选前，通过将诱饵和猎物蛋白的活性标准化至预设水平，我们已证明半衰期低至0.1秒的单体间相互作用仍可被检测，且假阳性率较低3。

AVEXIS 是一种高通量蛋白质相互作用检测方法，旨在系统性筛选参与细胞识别过程的新型细胞外受体-配体对。该方法专门用于检测那些利用其他高通量技术难以发现的瞬时蛋白质相互作用。

基于亲合力的细胞外相互作用筛选（AVEXIS）用于可扩展检测低亲和力细胞外受体-配体相互作用

细胞外蛋白：蛋白相互作用在分泌型或膜锚定型蛋白之间发挥关键作用，不仅对启动细胞间通讯至关重要，而且对……

本实验的总体目标是发现参与细胞识别过程的新型细胞外蛋白质相互作用，特别是膜嵌入型受体蛋白。AveXis 方法旨在克服此类蛋白质相互作用通常具有的极弱结合亲和力，以及膜蛋白在生物化学操作上的困难。该方法首先构建细胞表面受体胞外区域的重组蛋白文库来实现这一目标。通过设计表达质粒，使受体的胞外结构域区域以可溶性片段的形式表达，分别作为单体生物素化诱饵和五聚体酶标记的捕获物。第二步是表达并标准化待测蛋白质，使其准备好用于相互作用筛选。所有蛋白质均在哺乳动物细胞中表达，以确保添加二硫键、糖基化等翻译后修饰。该实验方案中的一个关键步骤是确保文库中的诱饵蛋白和猎物蛋白均被归一化至阈值水平以内。接下来是激动人心的部分——筛选新的相互作用。将诱饵蛋白分配至微孔板的各个孔中，然后利用猎物蛋白探针检测相互作用。然后进行洗涤步骤。最后一步是加入酶的底物，以检测捕获到的猎物蛋白阵列上是否存在结合的靶标蛋白。最终，VEX 筛选的结果可以显示哪些细胞表面受体能够形成结合伴侣，因而可能参与细胞间的识别与通讯过程。该技术相较于常用的蛋白质提取方法（如酵母双杂交或生化纯化）的主要优势在于，它专为检测细胞外蛋白质-蛋白质相互作用而设计。该方法特别适用于发现膜锚定受体蛋白之间的新相互作用。由于膜蛋白在生化操作上较为困难，且其对应的受体相互作用通常极为微弱，因此使用其他技术难以检测到这类相互作用。该方法有助于解答有关细胞如何相互识别和通讯的关键问题。在分子水平上，可用于探究基本的生物学过程，例如卵细胞和精子表面展示的哪些受体蛋白发生相互结合，或哪些受体-配体相互作用介导了心肌细胞融合或神经嵴形成等细胞行为。该方法的主要挑战在于构建用于筛选相互作用的诱饵蛋白和猎物蛋白文库。确保诱饵蛋白和猎物蛋白在检测所需的阈值水平内进行标准化也极为重要。这可以减少假阴性和假阳性结果的频率。我最初在攻读博士学位期间萌生了该方法的想法，当时我正试图鉴定 CD 200 细胞表面蛋白的一个结合伴侣。本质上，我提出的问题是：这种特定的细胞表面受体的结合模式是什么？即使在今天，这仍然是一个在技术上难以回答的问题。然而，当时人类基因组计划即将完成，我意识到，由于我们现在拥有了基因组中所有细胞表面受体的完整列表，因此可以转而在这个受体蛋白集合中，探讨哪些在技术上能够发生相互作用。这是一个更容易回答的问题，AveXis 正是我们为回答该问题而开发的方法。一旦建立了诱饵蛋白和猎物蛋白表达载体的文库，即可准备将其转染至 HEC 293E 细胞中。首先在转染前一天以每毫升 250,000 个细胞的密度，将细胞接种于 50 毫升 FreeStyle 293 培养基中，以确保高效的生物素化。在用于表达诱饵蛋白（而非猎物蛋白）的培养基中添加 D-生物素。待所有培养板准备完毕后，在标准条件下将细胞培养过夜。由于生物素溶解度低且需精确配制溶液，我们更倾向于称取额外的生物素，然后加入培养基中，并在次日剧烈振荡。转染50毫升培养细胞，使用适当的转染试剂将25微克诱饵或猎物质粒导入细胞，以产生生物素标记的诱饵；同时共转染诱饵质粒与编码分泌型ELI蛋白生物素连接酶的质粒，比例为10:1，随后进行收获。转染后第五天，通过以下两步处理培养物：首先将细胞在3000 × g离心20分钟进行收集，其次将上清液S通过0.22微米滤膜过滤。AveXis的一个关键特征是，由于重组蛋白被分泌出来，因此可将其稀释或浓缩至阈值活性范围内。我们发现重组蛋白的表达量差异可达四个数量级，因此归一化步骤可减少筛选过程中假阳性结果的出现。开始诱饵蛋白的标准化之前，必须通过透析去除培养基中未结合的游离生物素，因为它会与生物素化的诱饵蛋白竞争结合链霉亲和素（streptavidin）的结合位点。首先将诱饵蛋白置于透析袋中。为了确保重组蛋白的有效透析，我们发现为透析管提供足够的表面积至关重要。通常，我们使用的透析管长度为实际所需体积的两到三倍。在24小时内，透析后用适当的缓冲液（如PBS）对诱饵蛋白进行充分透析。ELIZA实验首先用含BSA的PBST缓冲液在链霉亲和素编码的微孔板中封闭孔板，孵育15分钟。同时，在另一块干净的孔板上，用含2% BSA的PBST缓冲液对诱饵蛋白进行连续四倍的一比三稀释。孵育15分钟后，将稀释液转移至编码strep TTR的孔板中，在室温下孵育1小时。孵育结束后，洗涤各孔，然后向每个孔中加入100微升浓度为每毫升2微克的OX 68。再次于室温孵育1小时。第二次孵育结束后，进行另一次洗涤步骤，随后加入抗-US碱性磷酸酶。将培养板在室温下继续孵育第三个小时。随后用 PBST 洗涤培养板三次，并用 PBS 进行最后一次洗涤。为去除任何残留的去垢剂，在一小时后加入 100 微升浓度为每毫升 1 毫克的底物 1 0 4，溶于二乙醇胺缓冲液中。在室温下测定 405 纳米处的吸光度。使用抗 CD4 标签单克隆抗体通过 ELISA 检测四种不同透析后的诱饵上清液的系列稀释样品。如果未稀释的表达诱饵蛋白不足以饱和链霉亲和素包被板上的所有生物素结合位点，则使用 Viva spin 浓缩器浓缩蛋白。否则，将诱饵蛋白用含 2% BSA 的 PBST 稀释后使用。这足以饱和检测中生物素的结合位点。利用β-内酰胺酶活性定量分析前体蛋白的相对表达水平。首先在PBST 2% BSA缓冲液中制备含有副蛋白的上清液的系列稀释液。然后将20 µL稀释液加入到已装有60 µL亚硝酸盐检测试剂溶液的孔板中。立即将孔板转移至酶标仪，使用离心浓缩器或含2% BSA的PBST，在接下来的20分钟内每分钟测量一次485 nm处的吸光度。调整样品的终浓度，使其在约7分钟内水解完全反应体系中的亚硝酸盐，相当于每分钟约2个亚硝酸盐分子的转化速率。通过用 PBST 洗涤链球菌 TAVR ENC 包被的板，并将板在纸巾上轻拍至干燥，开始 AveXis 检测。接着，向每孔中加入含 BSA 的 PBST，并将板孵育 30 分钟。此步骤可阻断非特异性蛋白结合位点。在每个孔中，将板子在水槽上方轻轻一甩，去除封闭液，然后向相应的孔中加入100 µL经标准化的生物素化单体诱饵。室温孵育1小时。随后再次轻轻甩去孔中的诱饵样品，并用PBST洗涤3次。第三次洗涤后轻拍干燥。现在向每孔加入100 µL标准化的五聚体猎物构建物，在室温下孵育1小时。1小时后，用PBST再洗涤平板3次，最后用PBS洗涤1次。最后，向每个孔中加入 60 µL 七氧化二氮溶液，将酶标板在室温下孵育两小时，或更优方案是在 4 °C 孵育 16 小时。次日，阳性相互作用将变为红色。拍摄酶标板照片以留存视觉记录，然后使用酶标仪在 485 nm 吸光度下定量反应结果。从AveXis筛选反应开始约10分钟后，抗体介导的猎物捕获对照组以及阳性对照相互作用均出现了由黄色到红色的颜色变化。这种颜色变化表明底物中的亚硝酸盐发生了水解。在此时间尺度上可观察到一些阳性相互作用，但大多数需要数小时才会显现。通常，阳性命中率约为 0.4% 到 0.6%。一旦制备好蛋白质文库，该技术的筛选部分便可快速完成。在确认相互作用后，一天内筛选多达 12 块培养板是完全可行的。最重要的下一步是首先证明该相互作用能够使用新制备的独立蛋白重复出现。其次，我们始终要确定该相互作用是否与诱饵-猎物的方向无关，即是否可进行互作验证？这需要将诱饵载体中的结构域克隆到猎物载体中，反之亦然。可重复且可逆的相互作用被视为高置信度，并始终被证明为阳性。我们倾向于使用表面等离子共振等其他技术，对重新鉴定出的任何相互作用进行额外验证。重要的是，该方法能够证明两种纯化的组分可直接相互作用，也可用于表明结合是饱和的，因而具有特异性。

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