的ELISA基结合和竞争法快速测定配体 - 受体相互作用

所提出的方案描述了两种基于酶联免疫吸附测定 （ELISA） 的技术，用于快速研究配体-受体相互作用：第一种测定允许测定配体和受体之间的解离常数。第二种检测能够快速筛选封闭肽的配体-受体相互作用。

这种基于 ELISA 的方法的目标首先是确定细胞因子与其受体的结合亲和力，其次是测量配体-受体相互作用的抑制肽的阻断作用。这种方法可以帮助回答蛋白质-蛋白质相互作用领域的关键问题，例如细胞因子-受体结合。结合亲和力和阻断这些可能会增加对交互动力学的一般理解。

该技术的主要优点是，它易于执行，它产生标记受体，并且由于易于获得现成的 ELISA 阅读器，因此相对便宜。虽然这种方法可以提供对细胞因子受体相互作用的见解，但它也可以应用于其他系统，例如一般蛋白质-蛋白质相互作用和阻断化合物的设计以抑制特定相互作用。按照文本协议中的说明准备解决方案。

确保使用 0.22 微米 PES 膜过滤碳酸盐包被缓冲液。使用真空吸尘器。此外，每种配体或肽制备 10 种不同浓度。

本视频中描述了两种检测方法，第一种是直接配体受体相互作用 ELISA。它可用于测量受体-配体解离常数，它代表受体-配体结合亲和力。第二种检测是最近优化的竞争配体-受体相互作用 ELISA。

这允许筛选肽和其他封闭化合物，这些化合物会干扰受体-配体相互作用。为了提高效率，请准备使用多通道移液器处理 96 孔板，倾析时，只需倾倒其内容物即可。通过用重组受体包被板来开始此过程。

首先，在碳酸盐缓冲液中将受体稀释至 100 ng/μL。然后，向板孔中加载 100 微升受体溶液。排除外壁以避免处理板边缘伪影。

盖上板并在 4 摄氏度下孵育过夜。通过轻轻旋转进行所有板孵育。第二天，去除涂层溶液，用洗涤液、PBS 和少许 Tween 20 洗涤板 3 次。

接下来，通过添加 200 微升 5% PSA 来阻断游离受体结合位点。让板在室温下孵育 2 小时以完成模块。稍后，清空孔并像以前一样清洗板。

现在，向孔中加载 100 微升各种稀释的重组 his 标签配体稀释液。将每个浓度一式两份加载。仅用 PBS 加载空白孔。

然后，在室温下孵育板 2 小时。与配体孵育后，用洗涤液洗涤板 3 次。然后，将 100 微升等分试样的一抗 His 小鼠单克隆抗体移液到每个孔中，并在室温下孵育板 2 小时。

洗完抗体后，向每个孔中加入 100 μL HRP 偶联的山羊抗小鼠 IGG 二抗溶液。用铝箔包裹板以避免光线。然后，在室温下孵育板 45 分钟。

使用标准洗涤技术去除二抗。现在，向每个孔中加入 100 μL 新鲜制备的 TMB，由等量的底物储备液 A 和 B 制成，然后将板在室温下放置 15 至 30 分钟。然后，在充分显色后，向每个孔中加入 50 μL 储备液。

该协议基于以下假设：messaged 信号从特定绑定引发。可能需要估计非特异性结合对信号的贡献。然后，读取 450 纳米处的板吸光度值并继续计算 KD 值。

竞争 LRA 程序遵循与直接 LRA 程序相同的步骤，但有一些重要的变化。从板上洗掉多余的包被配体后，堵塞板孔。向每个孔中加入 200 μL 5% BSA 溶液，并在室温下孵育板 2 小时。

在孵育过程中，在 PBS 中制备固定浓度为 10 ng/mL 的重组 his 标签配体。然后，在 PBS 中制备不同浓度的封闭肽，范围从 10 纳摩尔到 100 微摩尔，以保证剂量反应曲线。因此，可以找到封闭肽的 IC50 值。

在对照孔中，加载不含肽的固定配体浓度以获得最大结合。在空白孔中，仅添加不含配体或肽的 PBS。在其他孔中，加入 50 μL 配体和 50 μL 每种肽浓度。

然后，在室温下孵育板 2 小时，并照常进行。使用直接 LRA 测定三种不同干扰素配体肽和受体 α 亚基 IL28R-a 之间的解离常数，将占据的结合位点的分数与相应干扰素浓度的对数作图。这些结果说明了一条结合曲线，可以通过将数据拟合到 Hill 方程来分析以估计 KD 值。

Scatchard 图说明了配体结合的协同性，最终干扰素配体 1 具有最高的结合亲和力，其次是干扰素配体 2 和干扰素配体 3。Hill 系数值大于 1 表明在初始配体受体相互作用后对其他配体的亲和力增加。接下来，使用竞争性 LRA 定量阻断肽对干扰素配体肽和受体亚基之间相互作用的影响。

将干扰素配体肽在 10 ng/mL 时占据的结合位点分数与干扰素肽浓度的对数作图。根据这些数据，估计 IC50 值。根据计算值，阻断肽最大程度地抑制了干扰素配体 3 与 IL28R-a 之间的相互作用。

一旦掌握了这项技术，可以在八小时内完成。如果执行得当。在尝试此过程时，重要的是要记住配体受体结合的每个饱和浓度，按照此程序，可以执行其他方法（如）以获得更详细的 KD 值。

开发后，这项技术为配体-受体相互作用领域的研究人员探索抑制物质以阻断这些相互作用铺平了道路。