Name: 的ELISA基结合和竞争法快速测定配体 - 受体相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 学习基于ELISA的结合与竞争法测定配体-受体相互作用，用于测定细胞因子与其受体的解离常数并筛选抑制肽。该方法操作简便、成本低廉，可广泛应用于蛋白质相互作用研究。

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我们感谢瑞士苏黎世联邦理工学院生物系统科学与工程系及瑞士生物信息学研究所（瑞士巴塞尔）的 J. Stelling 教授对本文稿的审阅。

1. 试剂配制
<ol>
	<li>配制碳酸盐包被缓冲液：将 0.36 g Na2CO3 和 0.84 g NaHCO3 溶解于 100 ml 蒸馏水中；使用真空驱动的 0.22 µm 聚醚砜（PES）膜滤器对缓冲液进行无菌过滤，并在室温下保存备用。</li>
	<li>通过在磷酸盐缓冲液（PBS）中加入 0.05% v/v Tween 20 配制洗涤液。</li>
	<li>在 PBS 溶液中配制 5% 牛血清白蛋白（BSA）（封闭液），方法是将 5 g BSA（≥98%）溶解于 100 ml PBS 中，并在 4 °C 下保存。</li>
	<li>重组受体、配体及阻断肽
	<ol>
		<li>根据生产商说明书，重悬重组人白细胞介素受体α亚基（IL28RA）以及带 His 标签的重组人干扰素配体（IFNL1-3），并在 -80°C 下保存。合成阻断肽，并按先前所述方法使用4。使用 PBS 配制不同浓度的配体和肽，用于后续检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制一抗：将 6x His 小鼠单克隆抗体用含 0.1% BSA 的 PBS 按 1:1,000 稀释。配制二抗：将辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠 IgG（H+L）用含 0.1% BSA 的 PBS 按 1:10,000 稀释。</li>
	<li>根据生产商说明书，将 TMB 试剂 A 和试剂 B 混合配制 TMB 溶液。</li>
	<li>通过将 5 N 硫酸（H2SO4）加入蒸馏水中配制终止液，并在室温下保存。</li>
</ol>
2. 酶联免疫吸附测定（ELISA）
注意：直接配体-受体相互作用 ELISA（直接 LRA，图 1）可用于测定配体-受体解离常数（KD），以评估配体与受体之间的结合亲和力。竞争性配体-受体相互作用 ELISA（竞争性 LRA，图 2）可用于筛选能够干扰配体与受体相互作用的多肽（及其他阻断化合物）。此前发表的基本方案5已进一步优化。 
注意：在两种 ELISA 方法中，每一步向 96 孔板的孔中添加溶液时，均应使用多通道移液器。在倾倒溶液或洗涤步骤中，可直接将液体弃入水槽。
<ol>
	<li>直接配体-受体相互作用检测（direct LRA） 
	注意：有关工作流程的示意图（见 图1).
	<ol>
		<li>用重组受体包被培养板
		<ol>
			<li>将重组受体用碳酸盐缓冲液稀释至终浓度为100 ng/µl。使用多通道移液器将100 µl稀释后的受体溶液（浓度为100 ng/µl）加入96孔微孔板的各孔中，以包被固定浓度的受体。避免使用板的外周孔，以防止边缘效应。用盖子封板后，于4 °C过夜孵育。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>封闭与配体添加
		<ol>
			<li>次日，将包被液倾斜倒出，用洗涤液（PBS + 0.05% v/v Tween 20）洗涤平板3次。</li>
			<li>使用多通道移液器向包被好的酶标板每孔加入200 µl 5% BSA溶液，封闭游离的受体结合位点，室温孵育2小时。</li>
			<li>弃去封闭液（参见步骤 2.1.2.1），用洗涤液洗板 3 次。</li>
			<li>制备不同浓度的重组 His 标签配体（例如， 8 µg/ml、4 µg/ml、2 µg/ml、1 µg/ml、0.5 µg/ml、0.25 µg/ml、0.125 µg/ml、0.063 µg/ml、0.031 µg/ml、0.0 µg/ml）的PBS溶液。空白孔中仅加入PBS。</li>
			<li>将每种配体浓度各100 µl加入孔中，每个浓度设复孔，于室温孵育2小时，使受体与配体相互作用。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>抗体孵育
		<ol>
			<li>孵育配体后，用洗涤液洗涤平板3次。</li>
			<li>向每个孔中加入100 µl一抗（抗His小鼠单克隆抗体溶液，1:1,000稀释）。</li>
			<li>室温孵育 2 小时；孵育结束后，弃去抗体溶液（参见步骤 2.1.2.1），用洗涤液洗涤 3 次。</li>
			<li>每孔加入 100 µl HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG 二抗溶液（1:10,000）。室温孵育 45 分钟。</li>
			<li>弃去抗体溶液（参见步骤 2.1.2.1），用洗涤液洗涤平板 3 次。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>底物添加与显色反应
		<ol>
			<li>将TMB底物溶液恢复至室温，并按1:1比例配制TMB底物溶液A和B。每孔加入100 µl新鲜配制的底物溶液，室温避光孵育15–30分钟。待显色充分后，每孔加入50 µl终止液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>读取酶标板与数据分析 
		注意：本方案基于信号来源于特异性结合的假设。可能需要评估非特异性结合对信号的贡献，但此项内容不在本方案的范围之内。
		<ol>
			<li>在450 nm处直接读取吸光度（光密度，OD）值。</li>
			<li>从测得的OD值中减去背景信号并进行归一化处理。将所有配体浓度值转换为以10为底的对数尺度（log）10).</li>
			<li>将经归一化和背景校正的吸光度值（Y轴，对应受体结合位点的占据比例）对配体浓度的对数（X轴，log）作图10 比例尺）。</li>
			<li>为了估算 KD 值，将数据拟合到以下形式的希尔方程： 
			<img alt="Ligand binding equation, Y=(Ymax[L]^n)/(K_D^n+[L]^n), mathematical formula." src="/files/ftp_upload/53575/53575eq1.jpg" data-altupdatedat="1785211204000" data-alt="Equation 1"> 
			注意：此处 Y 表示受体结合位点被占据的比例，Y最大值 最大结合量；[L] 表示游离配体的浓度和希尔系数。如果配体只有一个结合位点，则希尔系数为 n = 1。对于具有多个配体结合位点的系统，当 n > 1 时，结合表现出正协同性 &gt;1，若 n < 1，则为负协同性&lt;1，当 n = 1 时无协同性。微观解离常数称为，对应于半最大效应浓度 EC506表观解离常数为 Kd = (KD)n在最简单的情况下（n = 1），解离常数对应于一半受体结合位点被配体占据时的配体浓度，此时Kd = KD该模型假定在平衡条件下遵循质量作用定律的结合反应，且仅有少量加入的配体与受体结合。 即， [L] >> [RL]</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="ELISA 流程图：IL28Rα 包被、IFNλ 结合、抗体添加、颜色变化、数据分析。" src="/files/ftp_upload/53575/53575fig1.jpg" data-altupdatedat="1785211204000" data-alt="图 1"> 
图 1. 直接配体-受体相互作用检测法（直接 LRA）。 直接 LRA 的逐步操作流程。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53575/53575fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol start="2">
	<li>竞争性配体-受体相互作用实验（竞争性 LRA） 
	注意：实验流程示意图参见图2。竞争性 LRA 的操作步骤与直接 LRA 相同（包被酶标板、抗体孵育、显色），但在配体和多肽的添加步骤中存在关键差异。本实验必须设置适当的阴性对照。在先前的一项筛选研究中4，错序阻断多肽未表现出拮抗效应。
	<ol>
		<li>阻断 — 配体与阻断多肽的添加
		<ol>
			<li>次日，移除包被液并洗涤酶标板（参见 2.1.2.1）。</li>
			<li>向每孔加入 200 µl 5% BSA 溶液以封闭酶标板，并在室温下孵育 2 小时。</li>
			<li>在 PBS 中将重组 His 标签配体（IFNL1-3）配制成固定浓度（2×–20 ng/ml）。</li>
			<li>将阻断多肽（参见表3）用 PBS 配制成不同浓度（范围从 10 nM 至 100 µM），以确保获得剂量-反应曲线。 
			注意：此步骤可为后续确定阻断多肽的 IC50 值提供依据。在对照孔中仅加入固定浓度的配体而不加多肽，以获得最大结合值（100%）。在空白孔中仅加入 PBS，不加配体或多肽。</li>
			<li>向各孔中分别加入 50 µl 配体（IFNL1-3）和 50 µl 不同浓度的多肽，每组设复孔。</li>
			<li>在室温下孵育 2 小时。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>读板与数据分析 
		注意：本方案基于所测信号来源于特异性结合的假设。可能需要评估非特异性结合对信号的贡献，但该内容不在本方案范围内。
		<ol>
			<li>直接在 450 nm 处读取吸光度（光密度，OD）。</li>
			<li>从测得的 OD 值中减去背景信号并进行归一化处理。将所有多肽浓度值转换为以 10 为底的对数形式（log10）。</li>
			<li>以归一化并扣除背景后的 OD 值为纵坐标（Y 轴，代表受体结合位点被占据的比例），以多肽浓度的对数值为横坐标（X 轴，log10 标度），绘制曲线。</li>
			<li>为估算 IC50 值，将数据拟合至以下方程： 
			<img alt="用于药物效力分析的剂量-反应方程，表示为 Y=100/(1+10^(h(log(IC50)-log[P])))。" src="/files/ftp_upload/53575/53575eq2.jpg" data-altupdatedat="1785211204000" data-alt="方程 2"> 
			注意：其中 [P] 为多肽浓度，h 为 Hill 斜率。Hill 斜率描述剂量-反应曲线的陡峭程度。IC50 表示配体与受体结合被抑制 50% 时的抑制剂浓度。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="ELISA 流程图：IL28Rα 包被、IFNA 结合、抗体添加、颜色变化、数据分析。" src="/files/ftp_upload/53575/53575fig2.jpg" data-altupdatedat="1785211204000" data-alt="图 2"> 
图 2. 竞争性配体-受体相互作用检测（竞争性 LRA）。 竞争性 LRA 的逐步操作流程。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53575/53575fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<ol><li>Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+and+techniques+to+study+ligand-receptor+interactions+and+receptor+activation+by+TNF+superfamily+members%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members.</a> Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).</li>
<li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensor+analysis+of+anti-citrullinated+protein%2Fpeptide+antibody+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biosensor analysis of anti-citrullinated protein/peptide antibody affinity.</a> Analytical biochemistry. 465, 96-101 (2014).</li>
<li>van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell-adhesion+molecule+interactions+using+surface+plasmon+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell-adhesion molecule interactions using surface plasmon resonance.</a> Curr Opin Immunol. 8, 257-261 (1996).</li>
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<li>Levin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptides+derived+from+HIV-1+integrase+that+bind+Rev+stimulate+viral+genome+integration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Peptides derived from HIV-1 integrase that bind Rev stimulate viral genome integration.</a> PLoS One. 4, e4155(2009).</li>
<li>Egli, A., Santer, M. D., O'Shea, D., Tyrrell, D. L., Houghton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+the+interferon-lambda+family+on+the+innate+and+adaptive+immune+response+to+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">The impact of the interferon-lambda family on the innate and adaptive immune response to viral infections.</a> Emerging infectious diseases. , e51(2014).</li>
<li>Gad, H. H., Hamming, O. J., Hartmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+human+interferon+lambda+and+what+it+has+taught+us%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">The structure of human interferon lambda and what it has taught us.</a> J Interferon Cytokine Res. 30, 565-571 (2010).</li>
<li>Folch, B., Rooman, M., Dehouck, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermostability+of+salt+bridges+versus+hydrophobic+interactions+in+proteins+probed+by+statistical+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+chemical+information+and+modeling%22%5BJournal%5D)">Thermostability of salt bridges versus hydrophobic interactions in proteins probed by statistical potentials.</a> Journal of chemical information and modeling. 48, 119-127 (2008).</li>
<li>Yuzlenko, O., Lazaridis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+ionizable+amino+acid+side+chains+at+a+lipid+bilayer-water+interface%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+physical+chemistry.+B%22%5BJournal%5D)">Interactions between ionizable amino acid side chains at a lipid bilayer-water interface.</a> The journal of physical chemistry. B. 115, 13674-13684 (2011).</li>
<li>Tissot, A. C., Vuilleumier, S., Fersht, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+two+buried+salt+bridges+in+the+stability+and+folding+pathway+of+barnase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Importance of two buried salt bridges in the stability and folding pathway of barnase.</a> Biochemistry. 35, 6786-6794 (1996).</li>
</ol>

A.E. 获得了“SNSF Ambizione Score”项目（PZ00P3_154709）、巴塞尔大学“Forschungsfond, Förderung strategischer Projekte”、巴塞尔传染病基金会以及Bangeter Rhyner基金会的研究资助。J.L. 感谢SystemsX.ch系统生物学项目（9）提供的iPhD奖学金支持。th 呼叫

ELISA 是许多实验室常用的标准且成熟的方法。我们对先前发表的方法5,7进行了进一步的改进和优化。本演示的逐步操作方案展示了如何以简便的方式测定配体-受体相互作用的KD值。此外，还可测定干扰配体-受体相互作用的阻断肽的IC50值。
主要优势包括操作快速、试剂制备简便以及操作方式熟悉，因为大多数研究人员此前都使用过ELISA方案。直接LRA方案具有高度灵活性，可适用于检测多种蛋白质-蛋白质相互作用。应使用带有His6标签或其他标签的重组蛋白作为与固定化配体结合的结合伴侣。竞争性LRA可用作筛选工具，用于（i）确定阻断性化合物（如多肽、抗体或小分子）的抑制潜力，以及（ii）通过使用模拟受体或配体的阻断性多肽，确定关键的相互作用位点。
阴性对照对于正确解读所展示的实验至关重要。在之前的一项筛选研究4中，所用阻断肽的随机序列未显示出拮抗作用。然而，其他一些肽段在随机化后仍表现出阻断能力，这可能是由于非特异性的静电相互作用所致。
<p class="jove_c...

要全面理解信号通路，需要深入了解配体-受体相互作用。目前大多数评估特定配体与其受体相互作用的方法均成本高昂、耗时较长、劳动强度大，且需要专门的仪器设备和技术专长1。
本文介绍了两种基于酶联免疫吸附测定法（ELISA）的快速、可靠的逐点检测方案，用于研究配体-受体相互作用：直接配体-受体相互作用检测法（LRA）和竞争性LRA。ELISA是一种高度灵敏、特异且易于获取的技术，几乎在每个实验室中常规使用。ELISA可根据需要以多种方式进行实施和调整。本文所述方案已针对不同λ型干扰素（INFLs）与其受体之间的相互作用研究进行了优化。
直接LRA能够根据配体浓度对配体-受体结合进行定量，从而得到结合曲线。通过使用适当的配体-受体相互作用模型，可进一步分析数据以估算解离常数（KD）。
在本方案中，采用常用的Hill方程对配体-受体结合进行建模。尽管其他方法（如表面等离子共振技术2,3）可用于测定两种蛋白质之间的结合亲和力，但该技术通常耗时耗力、成本高昂，且需要特殊的实验设备。
竞争性配体-受体结合分析（LRA）可用于筛选抑制性肽：通过测定不同肽浓度下的配体-受体结合量，获得描述肽抑制效应的剂量-反应曲线。进一步分析数据可估算阻断肽的半数最大抑制浓度（IC50）。
两种ELISA方案均易于使用，并可适用于广泛的研究问题。任何类型的重组蛋白均可用于可靠且快速地确定相互作用区域。此外，可通过使用阻断肽的竞争性LRA来确定配体与受体的关键相互作用位点，这些阻断肽被设计为模拟配体或受体。如果阻断肽显示出高效且特异性的抑制作用，则表明该肽占据了配体的关键相互作用位点（当肽模拟受体时）或受体的关键相互作用位点（当肽模拟配体时）。
第一个方案描述了KD 不同INFLs及其受体α亚基的值测定 即， 白细胞介素-28受体（IL28RA）的直接LRA检测方法。接下来，第二种方案展示了如何测定一段由20个氨基酸组成的肽段抑制INFL-IL28RA相互作用的能力。该肽段设计用于在干扰素λ（IFNLs）的受体结合位点与其竞争结合，从而实现对这一相互作用的分子层面理解。此外，该肽段还可用于阻断IL28RA的功能 体外 确定对下游信号传导效应影响的实验4.

<table><tbody><tr><td>Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp)</td><td>Thermo Scientific</td><td>442404</td><td>ELISA 板</td></tr><tr><td>碳酸钠 (Na2CO3)</td><td>Merck</td><td>497-19-8</td><td>用于 ELISA 板包被缓冲液</td></tr><tr><td>碳酸氢钠(NaHCO3)</td><td>Merck</td><td>144-55-8</td><td>用于 ELISA 板包被缓冲液</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030-100G</td><td>用于封闭的 PBS 中 5% BSA</td></tr><tr><td>rhIL-28R&amp;alpha;/IFN&amp;lambda;R1</td><td>R&amp;D systems</td><td>5260-MR</td><td>重组人白细胞介素-28 受体 α</td></tr><tr><td>rhIL-29/IFN&amp;lambda;1</td><td>R&amp;D systems</td><td>1598-IL/CF</td><td>重组人白细胞介素-29/无载体蛋白/C端10-His标签</td></tr><tr><td>rhIL-28A/IFN&amp;lambda;2</td><td>R&amp;D systems</td><td>1587-IL/CF</td><td>重组人白细胞介素-28A/无载体蛋白/C端6-His标签</td></tr><tr><td>rhIL-28B/IFN&amp;lambda;3</td><td>R&amp;D systems</td><td>5259-IL/CF</td><td>重组人白细胞介素-28B/无载体蛋白/C端6-His标签</td></tr><tr><td>6x His 单克隆抗体（小鼠）</td><td>Clontech</td><td>631212</td><td>用于捕获带 His 标签配体的一抗</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>115-035-166</td><td>辣根过氧化物酶标记的二抗</td></tr><tr><td>BDoptEIA TMB 试剂盒</td><td>BD Biosciences</td><td>555214</td><td>ELISA - TMB 底物溶液</td></tr><tr><td>硫酸 (H2SO4)</td><td>Fulka</td><td>84720</td><td>5 N H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;（酶反应终止液）</td></tr><tr><td>Synergy/H1 - 微孔板读数仪</td><td>BioTeK</td><td></td><td>ELISA 板读数仪</td></tr></tbody></table>

一种基于elisa的结合与竞争方法以快速确定配体-受体相互作用

An ELISA Based Binding and Competition Method to Rapidly Determine Ligand-receptor Interactions

要全面理解信号通路，需要对配体-受体相互作用有深入的认识。本文介绍了两种快速且可靠的酶联免疫吸附测定（ELISA）逐点实验方案，用于研究配体-受体相互作用：直接配体-受体相互作用测定法（LRA）和竞争性LRA。以λ干扰素（IFNLs）与其受体α亚基（IL28RA）之间相互作用的ELISA分析为例进行说明：直接LRA用于测定受体与IFN配体之间的解离常数（KD值），竞争性LRA则用于测定一种寡肽的抑制能力，该寡肽被设计用于在IFNLs的受体结合位点处与其竞争结合。文中详细描述了估算KD值和半数最大抑制浓度（IC50）值的分析步骤。最后，讨论部分重点阐述了所介绍方法的优缺点，以及这些结果如何促进对配体-受体相互作用的分子机制的深入理解。

通过直接配体结合分析法（LRA）测定了INFL1-3与其受体α亚基IL28RA之间的解离常数。结果如图3所示：结合位点的占有率随相应干扰素（IFN）浓度的对数值变化而变化。数据的Scatchard图显示在右下角。结果表明，直接LRA可获得一条结合曲线，该曲线可进一步分析以估算KD值。KD值通过将数据拟合至Hill方程（公式1）而确定。
IFNL1 的结合亲和力最高，其次是 IFNL2 和 IFNL3。Hill 系数 n &gt;1 表明，在初始配体-受体相互作用之后，对后续配体的亲和力增强（见讨论部分）。估计的解离常数和 Hill 系数总结于表 1中。
采用竞争性LRA定量分析阻断肽对IFNL1-3与IL28RA相互作用的...

本文所述方案介绍了两种基于酶联免疫吸附测定（ELISA）的技术，用于快速研究配体-受体相互作用：第一种检测方法可用于测定配体与受体之间的解离常数；第二种检测方法则可实现对配体-受体相互作用阻断肽的快速筛选。

一种基于ELISA的结合与竞争方法以快速确定配体-受体相互作用

全面理解信号通路需要深入了解配体-受体相互作用。本文介绍了两种快速且……

本基于ELISA的方法的目标首先是确定细胞因子与其受体之间的结合亲和力，其次为测量抑制性肽段对配体-受体相互作用的阻断效应。该方法有助于回答蛋白质-蛋白质相互作用领域中的关键问题，例如细胞因子与受体的结合。对这些结合亲和力及阻断效应的研究可增进对相互作用动态特性的整体理解。该技术的主要优势在于操作简便、可生成标记受体，且成本相对较低，原因在于酶标仪等设备易于获取。尽管该方法可用于研究细胞因子受体相互作用，也可应用于其他系统，如一般的蛋白质-蛋白质相互作用，以及设计阻断性化合物以抑制特定相互作用。溶液的配制请参照文本版实验方案中的描述。务必使用 0.22 微米 PES 膜对碳酸盐包被缓冲液进行过滤，并使用真空过滤。同时，每种配体或肽需配制 10 种不同浓度。本视频中描述了两种检测方法，第一种是直接配体-受体相互作用的ELISA。该方法可用于测量受体-配体的解离常数，该常数代表受体与配体之间的结合亲和力。第二种检测方法是近期优化的配体-受体竞争性相互作用ELISA。这可以用于筛选肽段及其他阻断化合物，这些化合物可干扰受体-配体相互作用。为提高效率，准备使用多通道移液器处理96孔板；倾倒液体时，直接将内容物倒出即可。首先用重组受体包被酶标板，开始该实验流程。首先，用碳酸盐缓冲液将受体稀释至每微升100纳克。然后，向酶标板孔中加入100微升受体溶液。避免使用外周孔，以排除板边缘效应的影响。用封板膜覆盖，于 4 摄氏度孵育过夜。所有板的孵育步骤均需在轻柔振荡条件下进行。次日，移除包被液，并用洗涤液（含微量 Tween 20 的 PBS）洗涤平板三次。接下来，加入200微升5%PSA以封闭游离的受体结合位点。将酶标板在室温下孵育2小时，完成封闭。随后，弃去孔内液体，并按之前步骤洗涤酶标板。现在，向各孔中加入 100 微升不同稀释浓度的重组 his-tag 配体溶液，每个浓度设两个复孔。空白孔仅加入 PBS。然后，将酶标板在室温下孵育两小时。与配体孵育后，用洗涤液洗涤酶标板三次。随后，向每个孔中加入100 µL一抗（抗his小鼠单克隆抗体），并在室温下孵育两小时。洗去抗体后，向每孔加入 100 微升 HRP 标记的山羊抗小鼠 IGG 二抗溶液。用铝箔纸包裹酶标板以避光。随后，于室温孵育 45 分钟。使用标准洗涤技术去除二抗。现在，向每个孔中加入100微升新鲜配制的TMB，该溶液由等量的底物储存液A和B混合而成。然后，将板在室温下放置15至30分钟。随后，在显色充分后，向每个孔中加入50微升储存液。该方案基于信号来源于特异性结合的假设。可能需要评估非特异性结合对信号的贡献。随后，在450纳米波长处读取酶标板的吸光度值，并据此计算KD值。竞争性LRA实验步骤与直接LRA实验步骤基本相同，仅存在几项重要差异。在洗去包被配体的过量成分后，对酶标板孔进行封闭。每孔加入200微升5% BSA溶液，在室温下孵育两小时。孵育期间，用 PBS 将重组 his-tag 配体配制成固定浓度 10 纳克/毫升。然后，用 PBS 将阻断肽配制成不同浓度，范围从 10 纳摩尔到 100 微摩尔，以确保获得剂量-反应曲线。由此可确定阻断肽的 IC50 值。在对照孔中，加入固定浓度的配体但不加多肽，以确定最大结合量。在空白孔中，仅加入 PBS，不加配体或多肽。在其余孔中，分别加入 50 微升配体和 50 微升各浓度的多肽。然后，在室温下孵育平板两小时，并按常规步骤继续操作。使用直接LRA测定了三种不同干扰素配体肽与受体α亚基IL28R-a之间的解离常数，结合位点占有率对相应干扰素浓度的对数值作图。这些结果展示了一条结合曲线，可通过将数据拟合到Hill方程来分析并估算KD值。Scatchard 图可说明配体结合中的协同效应，最终显示干扰素配体1的结合亲和力最高，其次是干扰素配体2和干扰素配体3。Hill 系数大于1表明在初始配体与受体结合后，后续配体的结合亲和力增强。接下来，采用竞争性LRA定量分析阻断肽对干扰素配体肽与受体亚基之间相互作用的影响。在每毫升10纳克的干扰素配体肽浓度下，其结合位点的占据比例随干扰素肽浓度的对数值绘制而成。根据这些数据估算了IC50值。根据计算结果，阻断肽对干扰素配体3与IL28R-α之间相互作用的抑制作用最为显著。一旦掌握，该技术可在八小时内完成，前提是操作得当。在进行此实验步骤时，需要注意的是，每种配体-受体结合的饱和浓度均可通过本方法测定，此外还可结合其他方法以获得更精确的解离常数（KD）值。该技术问世后，为配体-受体相互作用领域的研究人员探索抑制性物质以阻断这些相互作用开辟了道路。

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关键词：ELISA，滴定，解离常数，受体-配体结合，结合亲和力

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学习基于ELISA的结合与竞争法测定配体-受体相互作用，用于测定细胞因子与其受体的解离常数并筛选抑制肽。该方法操作简便、成本低廉，可广泛应用于蛋白质相互作用研究。

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