一种基于ELISA的结合与竞争方法以快速确定配体-受体相互作用

本基于ELISA的方法的目标首先是确定细胞因子与其受体之间的结合亲和力，其次为测量抑制性肽段对配体-受体相互作用的阻断效应。该方法有助于回答蛋白质-蛋白质相互作用领域中的关键问题，例如细胞因子与受体的结合。对这些结合亲和力及阻断效应的研究可增进对相互作用动态特性的整体理解。

该技术的主要优势在于操作简便、可生成标记受体，且成本相对较低，原因在于酶标仪等设备易于获取。尽管该方法可用于研究细胞因子受体相互作用，也可应用于其他系统，如一般的蛋白质-蛋白质相互作用，以及设计阻断性化合物以抑制特定相互作用。溶液的配制请参照文本版实验方案中的描述。

务必使用 0.22 微米 PES 膜对碳酸盐包被缓冲液进行过滤，并使用真空过滤。同时，每种配体或肽需配制 10 种不同浓度。

本视频中描述了两种检测方法，第一种是直接配体-受体相互作用的ELISA。该方法可用于测量受体-配体的解离常数，该常数代表受体与配体之间的结合亲和力。第二种检测方法是近期优化的配体-受体竞争性相互作用ELISA。

这可以用于筛选肽段及其他阻断化合物，这些化合物可干扰受体-配体相互作用。为提高效率，准备使用多通道移液器处理96孔板；倾倒液体时，直接将内容物倒出即可。首先用重组受体包被酶标板，开始该实验流程。

首先，用碳酸盐缓冲液将受体稀释至每微升100纳克。然后，向酶标板孔中加入100微升受体溶液。避免使用外周孔，以排除板边缘效应的影响。

用封板膜覆盖，于 4 摄氏度孵育过夜。所有板的孵育步骤均需在轻柔振荡条件下进行。次日，移除包被液，并用洗涤液（含微量 Tween 20 的 PBS）洗涤平板三次。

接下来，加入200微升5%PSA以封闭游离的受体结合位点。将酶标板在室温下孵育2小时，完成封闭。随后，弃去孔内液体，并按之前步骤洗涤酶标板。

现在，向各孔中加入 100 微升不同稀释浓度的重组 his-tag 配体溶液，每个浓度设两个复孔。空白孔仅加入 PBS。

然后，将酶标板在室温下孵育两小时。与配体孵育后，用洗涤液洗涤酶标板三次。随后，向每个孔中加入100 µL一抗（抗his小鼠单克隆抗体），并在室温下孵育两小时。

洗去抗体后，向每孔加入 100 微升 HRP 标记的山羊抗小鼠 IGG 二抗溶液。用铝箔纸包裹酶标板以避光。随后，于室温孵育 45 分钟。

使用标准洗涤技术去除二抗。现在，向每个孔中加入100微升新鲜配制的TMB，该溶液由等量的底物储存液A和B混合而成。然后，将板在室温下放置15至30分钟。随后，在显色充分后，向每个孔中加入50微升储存液。

该方案基于信号来源于特异性结合的假设。可能需要评估非特异性结合对信号的贡献。随后，在450纳米波长处读取酶标板的吸光度值，并据此计算KD值。

竞争性LRA实验步骤与直接LRA实验步骤基本相同，仅存在几项重要差异。在洗去包被配体的过量成分后，对酶标板孔进行封闭。每孔加入200微升5% BSA溶液，在室温下孵育两小时。

孵育期间，用 PBS 将重组 his-tag 配体配制成固定浓度 10 纳克/毫升。然后，用 PBS 将阻断肽配制成不同浓度，范围从 10 纳摩尔到 100 微摩尔，以确保获得剂量-反应曲线。由此可确定阻断肽的 IC50 值。

在对照孔中，加入固定浓度的配体但不加多肽，以确定最大结合量。在空白孔中，仅加入 PBS，不加配体或多肽。在其余孔中，分别加入 50 微升配体和 50 微升各浓度的多肽。

然后，在室温下孵育平板两小时，并按常规步骤继续操作。使用直接LRA测定了三种不同干扰素配体肽与受体α亚基IL28R-a之间的解离常数，结合位点占有率对相应干扰素浓度的对数值作图。这些结果展示了一条结合曲线，可通过将数据拟合到Hill方程来分析并估算KD值。

Scatchard 图可说明配体结合中的协同效应，最终显示干扰素配体1的结合亲和力最高，其次是干扰素配体2和干扰素配体3。Hill 系数大于1表明在初始配体与受体结合后，后续配体的结合亲和力增强。接下来，采用竞争性LRA定量分析阻断肽对干扰素配体肽与受体亚基之间相互作用的影响。

在每毫升10纳克的干扰素配体肽浓度下，其结合位点的占据比例随干扰素肽浓度的对数值绘制而成。根据这些数据估算了IC50值。根据计算结果，阻断肽对干扰素配体3与IL28R-α之间相互作用的抑制作用最为显著。

一旦掌握，该技术可在八小时内完成，前提是操作得当。在进行此实验步骤时，需要注意的是，每种配体-受体结合的饱和浓度均可通过本方法测定，此外还可结合其他方法以获得更精确的解离常数（KD）值。

该技术问世后，为配体-受体相互作用领域的研究人员探索抑制性物质以阻断这些相互作用开辟了道路。