体外电穿孔转染中期小鼠胚胎菱脑唇下部

本实验的总体目标是通过在较早的妊娠阶段进行电穿孔，将质粒 DNA 导入胚胎后脑前体细胞，从而调控其基因表达。首先，在妊娠第 11.5 天分离胚胎，并将其背侧朝上置于无菌磷酸盐缓冲液中。第二步是注射约 50 µL 含 0.01% 快绿的表达质粒。

在成功的注射中，整个脑室系统将充满DNA与快绿的混合物。接着，对胚胎施加电脉冲。靠近带正电电极一侧的胚胎将摄取质粒DNA。

另一侧将作为内部阴性对照。最后一步是将胚胎放入组织培养中培养至少24小时。最终，经过24小时培养后，电转染的基因将得以表达，并可通过免疫组织化学进行检测。

该技术相较于现有方法的优势在于，可在更早的妊娠时间点对胚胎后脑前体细胞进行操作。该方法有助于回答本领域中的关键科学问题，例如不同同源框基因如何影响胚胎前体细胞的命运。开始本实验前，请根据随附的实验方案对解剖工具和层流通风罩进行灭菌处理。

为了获取胚胎，将一只处于妊娠11.5天（E 11.5）且腹中带有胎仔的雌性小鼠实施安乐死后，置于生物安全柜内的解剖托盘上。接着，用70%乙醇喷洒小鼠腹部。切开腹腔，并将腹壁固定在解剖托盘上。

然后拉出子宫角，使其位于腹膜腔内。用镊子小心地打开子宫角的壁，使用20毫米的勺子轻柔地将卵黄囊中的胚胎从胎盘上分离并取出。

此后，将胚胎放入一个100毫米的组织培养皿中，该培养皿已预先加入10毫升无菌预热的1倍PBS。在此步骤中，将第一个胚胎转移至一个新的100毫米培养皿中，该培养皿已预先加入10毫升无菌的1倍PBS，并预热至37摄氏度。

接下来，小心移除并丢弃卵黄囊。然后将胚胎调整至背侧朝上。在解剖显微镜下，用七毫米电极板轻轻固定胚胎。

将电极分别放置在后脑第四脑室水平的神经管两侧。随后，使用1 cc注射器吸取质粒DNA与0.01% Fast screen的混合液，通常情况下，500微升混合液足以对至少8至10个胚胎进行电穿孔。接下来，用连接在1 cc注射器上的25号五分之八英寸结核菌素针头，轻轻刺穿覆盖第四脑室的顶板。

然后将约 50 微升的 DNA DI 混合物注入脑室。成功的注射表现为 DNA DI 混合物充满整个脑室系统。另一种递送 DNA DI 混合物的方法是通过穿刺覆盖中脑的薄膜进入脑室系统，打开脉冲发生器，然后使用电极脉冲发生器和 7 毫米电极板对靠近正极电极的组织施加五个方波脉冲。

随后在超净工作台中取出质粒，向12孔细胞培养板的每个孔中加入2毫升预热至37摄氏度的DME MF 12培养基，培养基中添加10%胎牛血清、5%马血清、1%谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素。然后用镊子夹住胚胎中段，移除胚胎的后部，将前部放入培养板中已加液的一个孔内。

对所有胚胎重复此操作，并仅填充12孔板的外周孔。为避免培养物污染，将胚胎置于37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中培养24小时，以表达电穿孔导入的质粒。若需要更长的培养时间，则在新的12孔板的中心孔中加入两毫升D-M-E-M-F 12培养基。

用无菌勺子将胚胎转移至新培养板的孔中，然后放回37°C培养箱中，培养最多48小时以固定胚胎用于分析。用1倍PBS填充12孔板，随后转移胚胎并在4°C下洗涤5分钟。

接下来，在4°C条件下，用含2%多聚甲醛的1倍PBS固定胚胎2小时。然后在4°C条件下，用1倍PBS清洗三次，每次5分钟。随后，用含30%蔗糖的1倍PBS填充一个新的12孔板。

将胚胎转移至这些孔中，并在4°C下平衡过夜。然后使用干冰乙醇浴将胚胎包埋于最佳切割温度包埋剂中，或在-20°C下保存。最后使用冷冻切片机将胚胎切成30微米的切片。

将它们置于载玻片上，并在 -20 °C 下由 uni Histochemical 保存。下图所示为转染后培养 24 小时的 E 11.5 胚胎横切面 GFP 免疫组织化学染色的代表性结果。图中箭头指示的是捕获二抗的顶板结构。

结果显示，下 ROIC 唇部的电穿孔区域受限，未延伸至神经管的整个前后轴。此处展示了所分析的两种蛋白质 MASH1 和 Math1 的结果。我们观察到，与 11.5 天的对照组胚胎相比，大部分胚胎在电穿孔及培养后仍保持正常的表达水平。一旦掌握该技术，若操作得当，可在 1 至 2 小时内完成。

观看本视频后，您现在应该能够很好地掌握如何利用体外电穿孔实验技术来调控小鼠胚胎膜前体细胞中的基因表达。