菱形唇下的Midgestation小鼠胚胎在体外电穿孔

该程序的总体目标是通过在妊娠早期时间点通过电穿孔引入质粒 DNA 来纵胚胎后脑祖细胞中的基因表达。这是通过在妊娠 11.5 天时首先分离胚胎并将其背侧朝上置于无菌磷酸盐缓冲盐水中来实现的。第二步是将约 50 μL 的表达质粒注入 0.01% Fast Green。

在成功的注射中，整个心室系统将充满 DNA 固绿混合物。接下来，胚胎受到电脉冲的影响。胚胎最靠近带正电的电极的一侧将吸收质粒 DNA。

另一侧将用作内部阴性对照。最后一步是将胚胎放入组织培养物中至少 24 小时。最终，电额定基因将在培养 24 小时后表达，并且可以通过免疫组化进行评估。

与现有方法相比，该技术的优势在于可以在早期妊娠时间点纵胚胎后脑祖细胞。这种方法可以帮助回答该领域的关键问题，例如不同的 ural 基因如何影响胚胎祖细胞的命运。根据随附的手稿对解剖工具和层板流动罩进行消毒来开始此过程。

为了收获胚胎，将一只在妊娠第 E 11.5 天怀有 pops 的安乐死雌性小鼠放在引擎盖的解剖盘上。接下来，用 70% 乙醇喷洒小鼠的腹部。打开腹膜腔并将壁固定在解剖托盘上。

然后拉出子宫角，使其位于腹膜腔内。用镊子小心地打开子宫角壁。用 20 毫米的勺子轻轻地从胎盘中取出卵黄囊中的胚胎。

之后，将胚胎放入 100 毫米的组织培养皿中。预装 10 毫升预热的 1 倍 PBS 的无菌溶液。在此步骤中，将第一个胚胎转移到一个新的 100 毫米培养皿中，该培养皿预装了 10 毫升预热至 37 摄氏度的无菌一次性 PBS。

接下来，小心地取出并丢弃蛋黄袋。然后放置胚胎，使其背侧朝上。在解剖显微镜下用 7 毫米电极桨轻轻握住胚胎。

将电极放在后脑第四脑室水平的神经管两侧。之后，使用 1 cc 注射器抽取质粒 DNA 和 0.01% 快速筛选的混合物 一般来说，500 微升的混合物应该足以对至少 8 到 10 个胚胎进行电穿孔。接下来，用连接到一个 CC 注射器的 25 号五八分之一结核菌素针头轻轻刺穿覆盖第四脑室的顶板。

然后将约 50 微升 DNA DI 混合物注入心室。成功注射的特征是 DNA DI 混合物充满整个心室系统。输送 DNA DI 混合物的另一种方法是通过刺穿牛皮纸进入心室系统，覆盖在中脑上，打开脉冲发生器，然后使用电极脉冲发生器输送五个方形脉冲，7 毫米电极划动最靠近带正电电极的组织。

然后在层流罩中吸收质粒的同时，用两毫升补充有 10% 胎牛血清、5% 马血清、1% 谷氨酰胺、1% 青霉素链霉素的 DME MF 12 培养基填充 12 个培养皿的溃疡孔预热至 37 摄氏度。然后用一对镊子捏住胚胎的腹部。然后去除胚胎的后部，将前部放入培养皿的填充孔之一中。

对所有胚胎重复该过程，仅填充 12 孔板的外孔。为避免污染培养物培养物，将胚胎置于 37 摄氏度的培养箱中，用 5% 二氧化碳培养 24 小时以表达电穿孔质粒。如果需要更长的培养时间，请在新的 12 鲸鱼培养皿的血清孔中加入 2 毫升 D-M-E-M-F 12 培养基。

用消毒的勺子将胚胎转移到新板的孔中。然后将它们放回 37 摄氏度的培养箱中，培养长达 48 小时，以固定胚胎进行分析。用 1 倍 PBS 填充 12 孔板，然后转移胚胎并在 4 摄氏度下冲洗 5 分钟。

接下来，将胚胎在 2% 的 Paraldehyde 中在 4 摄氏度下固定 2 小时。然后在 4 摄氏度的一次 PBS 中冲洗 3 次，持续 5 分钟。同样，在填充新的 12 孔板后，用 30% 蔗糖在一次 PBS 中加入。

将胚胎转移到这些孔中，并在 4 摄氏度下平衡过夜。然后使用干冰乙醇浴将胚胎包埋在最佳切割温度化合物中，或将它们储存在零下 20 摄氏度。最后，用低温恒温器将胚胎切成 30 微米的切片。

将它们安装在载玻片上，并将它们储存在零下 20 摄氏度的 uni Histochemical 中。稍后显示的研究是培养 24 小时后电穿孔 E 11.5 胚胎横截面上 GFP 免疫组织化学的代表性结果。此处显示的箭头表示捕获二抗的顶板。

结果表明，下 ROIC 唇的电穿孔区域受到限制，没有延伸到神经管的整个前后轴。这里显示了两种分析蛋白质的结果，MASH 1 和 math 1。我们观察到，与对照胚胎相比，大多数胚胎在电穿孔和培养后保持正常的表达水平，为 11.5 一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在一到两个小时内完成。

观看本视频后，您现在应该对如何使用体外电穿孔检测来纵小鼠胚胎膜祖细胞中的基因表达有了很好的了解。