Name: 一种简单快速的方法，同时分离小鼠的原级胰岛和原级胰腺细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: 学习一种简单快速的方法，无需复杂灌注技术即可同时分离小鼠原级胰岛和胰腺腺泡细胞。该方法每鼠可获得约120个高活性胰岛和160-195万腺泡细胞，适用于研究胰腺内外分泌相互作用及糖尿病发病机制。

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X.T.、H.C. 和 J.L. 对本工作贡献相同。本工作受到国家自然科学基金（项目编号：82370658、82170657、82370655 和 82400760）以及浙江省自然科学基金（项目编号：LGF22H030014）的资助。作者感谢 bioRender（www.biorender.com）在图像绘制方面提供的帮助。

涉及动物的实验程序已获得上海长海医院伦理委员会或实验动物中心伦理委员会的批准（批准号：CHEC (A.E)-2025-026）。SPF级C57BL/6J小鼠（6-8周龄，体重18-25 g，雄性或雌性，n = 3）在12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养，可自由摄取食物（维持性饲料）和饮水。
废弃的锐器（如注射器和针头）应收集在实验室专用的锐器容器中，并由有资质的专业机构进行处理。根据 关于在科研中护理与使用非人类动物的伦理行为准则小鼠尸体应置于实验室专用的小鼠尸体冰箱中，并由专业机构进行焚烧处理。
1. 试剂准备
注意：诸如无菌密度梯度介质等溶液应收集至实验室的&#34;化学废液收集桶&#34;中。所有化学废料须由实验室委托的专业资质机构统一处理。
<ol>
	<li>胶原酶P溶液的配制
	<ol>
		<li>在50 mL离心管中，依次称取25 mg胶原酶P、42 mg无水氯化钙和0.02 g胰蛋白酶抑制剂。加入45.5 mL Hank's平衡盐溶液和500 µL HEPES溶液，涡旋振荡至完全溶解。使用0.22 µm滤器过滤除菌，将滤过后的溶液转移至新的无菌50 mL离心管中。得到浓度为0.5 mg/mL的胶原酶P溶液，用于后续胰腺组织的消化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>无菌密度梯度溶液的处理
	<ol>
		<li>将无菌密度梯度溶液通过0.22 µm滤器过滤除菌，然后转移至新的无菌50 mL离心管中。明确标记溶液信息，并于4 °C保存备用。此后该溶液称为 &#34;Ficoll&#34;。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>终止缓冲液与完全培养基的配制
	<ol>
		<li>分别向空白DMEM培养基和RPMI-1640培养基中添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素溶液，配制DMEM完全培养基和RPMI-1640完全培养基（也作为胰腺消化的终止缓冲液）。明确标记溶液信息，并于4 °C保存备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>不同浓度葡萄糖溶液的配制
	<ol>
		<li>在50 mL离心管中，加入50 mL Krebs-Ringer碳酸氢盐HEPES缓冲液（KRBH）和0.25 g BSA-V（牛血清白蛋白），配制含0.5% BSA的KRBH溶液。然后，在28.33 mL含0.5% BSA的KRBH溶液中加入168 µL葡萄糖（1 M）和1.5 mL氯化钙溶液（50 mM），配制5.6 mM葡萄糖溶液。在9.28 mL含0.5% BSA的KRBH溶液中加入220 µL葡萄糖（1 M）和500 µL氯化钙溶液（50 mM），配制22 mM葡萄糖溶液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 胰岛及胰腺腺泡细胞（PACs）的分离
注意：所有外科手术器械必须经过高压灭菌处理。
<ol>
	<li>向12孔板中加入Hank's平衡盐溶液和胶原酶P溶液，并向50 mL离心管中加入3 mL胶原酶P溶液用于后续消化。 
	注意：向三个孔中各加入2 mL Hank's平衡盐溶液，向一个孔中加入2 mL胶原酶P溶液。</li>
	<li>术前通过腹腔注射1.25%三溴乙醇（剂量为0.025 mL/g）对小鼠进行称重并麻醉，通过捏压小鼠足垫检查麻醉状态：麻醉深度以呼吸频率逐渐减慢且对足垫捏压无反应为准。确认达到深麻醉状态后，采用颈椎脱臼法处死小鼠。将小鼠浸入75%乙醇中消毒5分钟，随后转移至生物安全柜中进行胰腺分离。 
	注意：1.25%三溴乙醇为购买后即用型预配溶液，无需自行配制。实验过程中研究人员必须全程佩戴手套和口罩。若在注射1.25%三溴乙醇时发生皮肤接触，应立即用无水乙醇擦拭残留试剂，再用流动水冲洗5分钟，并涂抹保湿剂以缓解干燥。本研究不涉及腐蚀性化学品。废弃的化学试剂（如1.25%三溴乙醇）应收集于贴有&#34;危险化学废物&#34;标签的专用密闭容器中。</li>
	<li>在小鼠腹部做&#34;V&#34;形切口以打开腹腔。位于左季肋区的暗红色淋巴器官为脾脏，附着于脾脏的白色器官为胰腺。沿胃下缘及胰十二指肠交界处小心进行钝性分离胰腺组织。</li>
	<li>用Hank's平衡盐溶液清洗分离的胰腺组织，并去除残留的肠系膜附着物、脾脏及胰周脂肪组织。</li>
	<li>将预处理后的胰腺转移至含有2 mL胶原酶P溶液的12孔板中。左手用镊子固定胰腺，右手持1 mL注射器将胶原酶P溶液注入胰实质，直至胰腺组织呈现半透明且水肿状。 
	注意：灌注所用胶原酶P溶液的体积为600–800 µL。</li>
	<li>用手术剪迅速将胰腺剪成1–2 mm³大小的组织块。 
	注意：组织块的大小约等于标准200 µL移液枪头的内径。</li>
	<li>剪去1 mL移液枪头远端1–1.5 cm（以扩大开口），使用该改造后的枪头将胰腺组织块连同2 mL胶原酶P溶液转移至预先装有3 mL胶原酶P溶液的50 mL离心管中。</li>
	<li>将离心管置于37 °C水浴中孵育12分钟，期间每5–6分钟轻轻振荡一次。 
	注意：振荡离心管的目的是确保胰腺组织与胶原酶P溶液充分接触。</li>
	<li>加入10 mL RPMI-1640完全培养基以终止胶原酶P的消化作用。</li>
	<li>用5 mL巴斯德移液管反复吹打沉淀（上下吹打15–20次），直至无明显的大组织团块残留。</li>
	<li>加入10 mL RPMI-1640完全培养基，于4 °C以180 × g离心2分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用20 mL RPMI-1640完全培养基重悬沉淀，经40目筛网过滤后，于4 °C以180 × g离心2分钟。</li>
	<li>小心弃去上清液，加入20 mL Ficoll溶液重悬沉淀，缓慢加入15 mL RPMI-1640完全培养基。 
	注意：此时可观察到清晰的液体界面。</li>
	<li>于25 °C以640 × g轻柔离心20分钟。 
	&#8203;注意：离心过程中避免剧烈震荡，以防界面破坏。</li>
	<li>小心取出离心管，用5 mL巴斯德移液管吸除上层红色培养基。然后，小心吸取液层界面处含有胰岛的液体，转移至新的50 mL离心管中。加入20 mL RPMI-1640完全培养基，于4 °C以180 × g离心2分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用20 mL RPMI-1640完全培养基重悬沉淀，于4 °C以180 × g离心2分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用10 mL RPMI-1640完全培养基重悬沉淀，并转移至60 mm细胞培养皿中。</li>
	<li>在倒置生物显微镜（100倍放大）下，使用20 µL移液器手动挑选胰岛。将选出的胰岛转移至预先每孔加入500 µL RPMI-1640完全培养基的24孔细胞培养板中。</li>
	<li>弃去Ficoll溶液层，用10 mL DMEM完全培养基重悬沉淀（来自步骤2.15），经100 µm细胞滤网过滤后，于4 °C以180 × g离心2分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用10 mL DMEM完全培养基重悬沉淀，于4 °C以180 × g离心2分钟，弃去上清液。然后用5 mL DMEM完全培养基重悬沉淀，用于后续实验。</li>
</ol>
3. 胰岛细胞和腺泡细胞的活力检测
<ol>
	<li>将分离的胰岛和适量的腺泡细胞分别转移至含有1 mL RPMI-1640完全培养基和1 mL DMEM完全培养基的12孔/24孔细胞培养板中。将培养板置于37 °C、5% CO₂的细胞培养箱中平衡15分钟。</li>
	<li>在25 °C下，以180 × g 离心12孔/24孔细胞培养板30秒。同时，根据Calcein/Propidium Iodide（Calcein/PI）细胞活力与细胞毒性检测试剂盒的说明书配制染色试剂（配制过程中避光）。</li>
	<li>轻轻弃去培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤胰岛和腺泡细胞一次，然后在与步骤3.2相同的条件下进行离心。</li>
	<li>弃去PBS，用配制好的染色试剂重悬胰岛和腺泡细胞。用铝箔纸包裹培养板（避光），在37 °C、5% CO₂的细胞培养箱中孵育30分钟。</li>
	<li>在避光环境下，使用荧光显微镜（100倍放大）采集图像，并通过ImageJ进行细胞活力分析。</li>
</ol>
4. 腺泡淀粉酶检测
<ol>
	<li>将腺泡细胞以每孔1.5 × 106&#160;个细胞的密度接种于12孔板中，每孔加入1 mL培养基。设置对照组（Ctrl）和雨蛙素刺激组（10 nM、20 nM、50 nM；分别标记为C10、C20、C50）。刺激30分钟后，收集上清液，按照试剂盒说明书检测淀粉酶活性。</li>
</ol>
5. 葡萄糖刺激的胰岛素释放实验
<ol>
	<li>在24孔板中每孔接种10个胰岛。用完全RPMI-1640培养基稳定胰岛2小时，然后弃去培养基。</li>
	<li>将胰岛在1 mL 5.6 mM葡萄糖溶液中孵育1小时。随后收集上清液。</li>
	<li>用KRBH缓冲液洗涤胰岛。接着将胰岛在22 mM葡萄糖溶液中孵育1小时，再次收集上清液。</li>
	<li>使用小鼠胰岛素（INS）ELISA试剂盒检测两个上清液（来自低糖和高糖条件）中的胰岛素浓度。计算葡萄糖刺激的胰岛素指数（GSI）： 
	GSI = 高糖培养基中的胰岛素浓度 / 低糖培养基中的胰岛素浓度</li>
</ol>

<ol><li>Manrai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+mellitus+as+a+consequence+of+acute+severe+pancreatitis%3A+unraveling+the+mystery%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Diabetes%22%5BJournal%5D)">Diabetes mellitus as a consequence of acute severe pancreatitis: unraveling the mystery.</a> World J Diabetes. 14 (8), 1212-1225 (2023).</li>
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<li>Hohmeier, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+INS-1-derived+cell+lines+with+robust+ATP-sensitive+K%E2%81%BA+channel-dependent+and+-independent+glucose-stimulated+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K⁺ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion.</a> Diabetes. 49 (3), 424-430 (2000).</li>
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<li>Xiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+incidence+and+mortality+of+pancreatic+diseases%3A+a+systematic+review%2C+meta-analysis%2C+and+meta-regression+of+population-based+cohort+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Global incidence and mortality of pancreatic diseases: a systematic review, meta-analysis, and meta-regression of population-based cohort studies.</a> Lancet Gastroenterol Hepatol. 1 (1), 45-55 (2016).</li>
<li>Sendler, M., Weiss, F. U., Golchert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+B-mediated+activation+of+trypsinogen+in+endocytosing+macrophages+increases+severity+of+pancreatitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Cathepsin B-mediated activation of trypsinogen in endocytosing macrophages increases severity of pancreatitis in mice.</a> Gastroenterology. 154 (3), 704-718.e10 (2018).</li>
<li>Modenbach, J. M., Möller, C., Asgarbeik, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+analyses+of+cystatin-C+dimers+and+cathepsin-B+reveals+a+trypsin-driven+feedback+mechanism+in+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Biochemical analyses of cystatin-C dimers and cathepsin-B reveals a trypsin-driven feedback mechanism in acute pancreatitis.</a> Nat Commun. 16 (1), 1702(2025).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

近年来，胰腺炎后糖尿病（PPDM）受到了广泛关注1,9,10。研究急性胰腺炎（AP）背景下胰腺腺泡细胞（PACs）影响胰岛激素分泌的分子机制具有重要意义。
急性胰腺炎的发病机制主要与腺泡细胞内胰酶的过度激活有关，这会导致胰腺组织的自我消化11,12尽管目前已有 AR42J、266-6（腺泡细胞系）和 MIN6、INS-1（β细胞系）等细胞系，这些 体外 细胞模型无法完全复制原代腺泡细胞和胰岛的生理复杂性4,5因此，分离原代腺泡细胞和胰岛对于深入研究胰腺外分泌部与内分泌部之间的相互作用至关重要。目前，胰岛分离方法已较为成熟；然而，大多数方法尚不能满足研究胰岛与胰腺腺泡细胞相互作用的需求。6,7,8.
本实验方案优化了胰腺灌注操作，降低了技术门槛，使未经胆管插管专门培训的研究人员也能开展实验。同时，该方法可保证分离所得胰岛细胞和腺泡细胞的数量与质量，为同时分离小鼠原代胰岛细胞和胰腺原代腺泡细胞提供了一种简便快速的方法。
尽管该方法简化了胰岛分离过程，但关键步骤仍需严格控制，以确保获得较高的产量以及胰岛与胰腺腺泡细胞的有效分离。这些步骤包括充分的胰腺灌注、适当的组织破坏（确保充分切碎）、胰腺消化（精确控制消化时间及消化过程中的人工振荡）以及机械吹打（控制吹打次数和强度）。在胰岛挑选前，应将重悬的胰岛置于细胞培养箱中稳定约10分钟，以利于更高效地挑选胰岛。
需要注意的是，在胰腺灌注过程中，注入更澄清的液体囊泡可获得更好的效果；应确保整个胰腺组织充分灌注，但灌注时间应控制在1-2分钟内。如果检测到细胞活力较低，可调整胰腺组织与胶原酶P的接触时间（包括灌注时间和水浴消化时间）。此外，注意在分离过程中避免机械损伤，例如分散胰腺组织时应避免用力过度。在整个胰岛和腺泡细胞分离过程中必须保持无菌操作，以防污染。配制好的试剂应通过0.22 µm滤膜过滤。分离操作应在生物安全柜中进行，且分离过程中使用的所有器械和耗材均须无菌。两种配制好的完全培养基也均含有1%青霉素-链霉素溶液。
小鼠麻醉操作：用左手拇指和食指固定小鼠颈部皮肤，无名指和小指托住其腹部（保持头部朝下、腹部朝上的姿势以暴露腹腔）。右手持注射器，以30°角将针头刺入小鼠左下腹部皮肤（距腹股沟1 cm，距中线0.5 cm），缓慢注入麻醉剂。拔针后用无菌棉签按压注射部位10秒，防止药液渗漏。必须在小鼠完全麻醉后，方可通过颈椎脱臼法实施安乐死。
若被污染的针头刺伤（接触过小鼠血液或组织）或被小鼠咬伤，应立即在最近的水槽处挤压伤口周围区域（从伤口近心端向远心端挤压，以排出少量血液），用流动水持续冲洗伤口15分钟，然后用75%乙醇或0.5%聚维酮碘进行消毒。
腺泡细胞淀粉酶活性检测结果显示，分离得到的胰腺腺泡细胞基础激活水平较低，并且对雨蛙素刺激敏感：随着雨蛙素浓度升高，淀粉酶活性逐渐增加，在20 nM雨蛙素时达到最高水平，当雨蛙素浓度为50 nM时略有下降。葡萄糖刺激胰岛素分泌实验结果表明，分离得到的胰岛在不同浓度葡萄糖溶液刺激下表现出典型且有效的胰岛素分泌反应。这些结果表明，通过本方案提取的腺泡细胞和胰岛适用于后续的in-vitro实验。
本实验方案中的胰岛和腺泡细胞分离操作简便。实验结果表明，通过该方案分离得到的胰岛和腺泡细胞数量多、活性好。此外，我们团队多位成员已使用多只小鼠对该方案进行了验证，结果表明该方法具有良好的可重复性、可靠的数据表现以及稳定的细胞得率。然而，该方案也存在一定的局限性。尽管其对操作者技术依赖性较低，但仍要求操作者具备基本的小鼠解剖学知识，以完整分离小鼠胰腺——这是整个分离过程的前提条件。若需同时从小鼠多只动物中分离胰腺组织，则必须相应调整胶原酶P溶液及其他试剂的用量。此外，不建议同时处理超过两只小鼠：在解剖、灌注和剪碎过程中，不同小鼠胰腺组织处理的时间差异会影响胰腺组织与胶原酶P的接触时间，从而影响细胞分离的效率和活性。因此，该方法的大规模应用可能受到限制。此外，该方案尚未在大鼠中进行验证。若需从大鼠中分离胰岛和腺泡细胞，部分试剂的用量及消化时间可能需要进一步优化调整。
总之，本实验方案提供了一种简便、快速的方法，可同时分离原代小鼠胰岛细胞和原代胰腺腺泡细胞。该方法更适合缺乏经验的研究人员进行胰岛和腺泡细胞的分离，同时也为相关研究提供了实用的实验框架。 体外 胰腺外分泌-内分泌相互作用的研究

急性胰腺炎（AP）可通过多种途径破坏胰腺内分泌功能，例如胰腺实质损伤和炎症级联反应，从而诱发急性胰腺炎后糖尿病（PPDM-A）。1,2目前，PPDM-A的核心发病机制尚不明确，胰腺内分泌与外分泌组分之间的异常双向交流是研究的重点。3尽管现有的永生化β细胞系（如INS-1、MIN6）常被用作研究工具 体外 糖尿病细胞模型由于具有肿瘤来源的特性，导致其在葡萄糖反应性和细胞异质性方面与正常的原代胰岛细胞存在显著差异。因此，它们无法真实模拟急性胰腺炎微环境下的病理生理状态4,5因此，获得高质量的原代胰岛细胞和腺泡细胞已成为阐明其相互作用机制的核心技术基础。
目前从小鼠中分离原代胰岛的主要方法依赖于导管插管技术，该技术需要精确定位胆管并进行插管，以将胶原酶溶液注入胰腺实质，实现体内灌注。6,7然而，对于从新生小鼠中分离原代胰岛，Huang 等人8 使用取得了优异的结果 体外 无消化 体内 胰腺灌注。根据我们研究团队的实践经验，通过胆管插管进行理想的胰腺灌注，若无专门训练，很难快速且有效地完成。受自新生小鼠分离原代胰岛方法的启发，我们团队对提取方案进行了改良，使其更简便，便于无灌注经验的研究人员操作。该改良方法也为从幼龄小鼠或胆管较脆弱的小鼠中分离原代胰岛提供了更简便的替代方案。此外，该方法在胰岛及腺泡细胞的分离效率（数量）和纯度（质量）方面均具有优势。它使研究人员能够在相同的病理生理背景下开展实验，有助于深入分析胰岛细胞与腺泡细胞之间的相互作用机制。
该方法需要严格控制胰腺消化时间；在消化前对胰腺进行剪碎也是关键步骤。此外，需注意消化后胰腺组织机械分散的强度。这些因素均会影响分离所得胰岛和腺泡细胞的数量与质量。该方法尚未在大鼠中验证，目前也无法放大用于生产。

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;mu;m 滤膜</td><td>Millex</td><td>SLGPR33RB</td><td>过滤制备好的胶原酶P溶液</td></tr><tr><td>0.25 M 氯化钙（无菌）</td><td>Beyotime</td><td>ST365</td><td>激活胰岛素分泌的钙依赖性信号通路</td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>Jierui</td><td>10084692516405</td><td>用于将胶原酶P灌注至胰腺组织</td></tr><tr><td>1.25% 三溴乙醇溶液</td><td>北京佑森生物科技有限公司</td><td>JT0781</td><td>麻醉</td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>Eppendorf</td><td>30121589</td><td>收集细胞上清液用于离心和储存</td></tr><tr><td>1× Hank&amp;rsquo;s 平衡盐溶液</td><td>Biosharp</td><td>BL561A</td><td>配制胶原酶P溶液并冲洗胰腺组织</td></tr><tr><td>12孔细胞培养板</td><td>SARSTEDT</td><td>83.3921</td><td>用于承载胰腺组织及分离的腺泡细胞进行培养</td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>北京莱伯泰科科技有限公司</td><td>CT-002-15A</td><td>实验过程中盛放溶液</td></tr><tr><td>24孔细胞培养板</td><td>SARSTEDT</td><td>83.3922</td><td>培养分离得到的胰岛</td></tr><tr><td>40目&amp;nbsp;筛网</td><td>维丹仪器</td><td>N/A</td><td>过滤胰腺组织</td></tr><tr><td>5 mL 巴斯德吸管</td><td>Biosharp</td><td>BS-XG-03L</td><td>移液及物理性破碎胰腺组织</td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>北京莱伯泰科科技有限公司</td><td>CT-002-50A</td><td>实验过程中盛放溶液、组织以及进行离心</td></tr><tr><td>60 mm 细胞培养皿</td><td>北京莱伯泰科科技有限公司</td><td>12211</td><td>盛放含胰岛的培养基，便于挑取</td></tr><tr><td>75% 乙醇溶液</td><td>HYNAUT</td><td>N/A</td><td>浸泡小鼠以进行消毒</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop 2023</td><td>Adobe Inc.</td><td>N/A</td><td>生成图像</td></tr><tr><td>Beckman Allegra X-12/X-12R 离心机</td><td>BECKMAN</td><td>Allegra X-12/X-12R</td><td>离心</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）-V</td><td>Solarbio</td><td>A8020</td><td>维持胰岛正常生理功能，并用于配制不同浓度的葡萄糖溶液</td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠，SPF级，6&amp;ndash;8 周龄，体重 18&amp;ndash;25 g</td><td>海军军医大学实验动物中心&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcein/PI 细胞活力与细胞毒性检测试剂盒</td><td>Beyotime</td><td>C2015L</td><td>基于Calcein-AM（Calcein AM）和碘化丙啶（PI）对活细胞与死细胞的双荧光染色，检测动物细胞的活力与细胞毒性</td></tr><tr><td>氯化钙（无水）</td><td>生工生物工程（上海）股份有限公司</td><td>10043-52-4</td><td>配制胶原酶P溶液</td></tr><tr><td>细胞筛（100 &amp;mu;m）</td><td>Biosharp</td><td>BS-100-XBS</td><td>过滤腺泡细胞</td></tr><tr><td>胶原酶P</td><td>Sigma</td><td>11213857001</td><td>消化胰腺组织</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖溶液（20%，无菌）</td><td>Beyotime</td><td>ST491</td><td>刺激胰岛分泌胰岛素</td></tr><tr><td>DMEM基础培养基（1×）（Dulbecco&amp;rsquo;s 改良Eagle培养基）</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td>培养腺泡细胞</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Biowest</td><td>S140B-500</td><td>配制培养基</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PREMIUM 无菌溶液</td><td>Cytiva</td><td>17544203</td><td>密度梯度介质，用于密度梯度分层</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8.0.1</td><td>GraphPad Software, LLC</td><td>N/A</td><td>生成图像并进行统计分析</td></tr><tr><td>HEPES 溶液（1 M）</td><td>Biosharp</td><td>BL1061A</td><td>配制胶原酶P溶液</td></tr><tr><td>高速/冷冻离心机</td><td>Sigma</td><td>3K15</td><td>离心</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院光学与计算仪器实验室（LOCI）</td><td>N/A</td><td>分析细胞荧光图像并计算细胞活力</td></tr><tr><td>倒置生物显微镜</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td>观察细胞形态并挑选胰岛</td></tr><tr><td>倒置荧光显微镜</td><td>OLYMPUS</td><td>IX73</td><td>观察细胞荧光信号并采集荧光图像</td></tr><tr><td>Krebs-Ringer 碳酸氢盐 HEPES 缓冲液</td><td>LEAGENE</td><td>CZ0103</td><td>维持胰岛正常生理功能，并用于配制不同浓度的葡萄糖溶液</td></tr><tr><td>小鼠胰岛素（INS）ELISA试剂盒</td><td>武汉菲恩生物科技有限公司</td><td>EM0260</td><td>检测胰岛的胰岛素分泌水平</td></tr><tr><td>眼科镊（10 cm，弯头带钩）</td><td>清易医疗器械</td><td>N/A</td><td>辅助解剖操作</td></tr><tr><td>眼科镊（10 cm，直头带齿）</td><td>清易医疗器械</td><td>N/A</td><td>辅助解剖操作、快速分离胰腺组织及提取胰腺组织</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>配制培养基以防止污染</td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基</td><td>凯基生物</td><td>KGL1501-500</td><td>终止胶原酶P消化反应并用于胰岛培养</td></tr><tr><td>大豆（Glycine max）胰蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma</td><td>T6522</td><td>配制胶原酶P溶液</td></tr><tr><td>手术剪（10 cm，直尖头）</td><td>清易医疗器械</td><td>N/A</td><td>辅助解剖操作并将胰腺组织剪成小块</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>OAICLAB</td><td>OW-HF</td><td>维持消化温度</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-淀粉酶和&amp;beta;-淀粉酶活性检测试剂盒</td><td>Elabscience</td><td>E-BC-K006-M</td><td>检测不同条件下腺泡细胞分泌的淀粉酶水平</td></tr></tbody></table>

一种从小鼠中同时分离原代胰岛和原代胰腺腺泡细胞的简便快速方法

A Simple and Rapid Method for Simultaneous Isolation of Primary Islets and Primary Pancreatic Acinar Cells from Mice

在急性胰腺炎后糖尿病（PPDM-A）发病机制的研究中，胰腺腺泡细胞（PACs）与胰岛细胞之间的异常双向通讯是研究重点。然而，永生化细胞系无法模拟病理生理条件，因此高质量原代细胞的分离至关重要。目前从小鼠中分离原代胰岛的方法主要依赖于 体内 通过胆管插管进行胰腺灌注，技术门槛较高，不利于无经验的研究人员操作。
本研究对方法进行了改进，消除了对复杂、 体内 灌注。将6-8周龄SPF级C57BL/6J小鼠麻醉后处死，随后分离胰腺。胰腺经消化处理 体外 用胶原酶P消化；通过Ficoll密度梯度离心分离原代胰岛，通过细胞筛过滤和离心获取腺泡细胞。采用钙黄绿素/碘化丙啶（Calcein/PI）染色、葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验及淀粉酶活性检测评估细胞活力与功能。
结果表明，该改良方法易于操作：每只小鼠可获得（120 ± 5）个原代胰岛和1.6-1.95 × 10⁷个腺泡细胞；胰岛和腺泡细胞的存活率分别为（97.52 ± 0.16）%和（96.55 ± 0.95）%。此外，胰岛表现出正常的胰岛素分泌能力，腺泡细胞对胆囊收缩素类似物（cerulein）刺激具有敏感性。该方法简便可靠，为研究胰腺外分泌-内分泌相互作用及PPDM-A提供了可行的技术框架。然而，该方法在大鼠中的应用尚未得到验证，存在一定局限性。

经Ficoll溶液密度梯度离心后，胰岛可见于透明无色液体层与培养基之间的界面附近，而PACs则作为沉淀存在于试管底部（图1）。
在光学显微镜下，胰岛通常呈圆形或椭圆形，颜色为金棕色，每只小鼠的稳定产量为（120 ± 5）个胰岛（图2A，B）。新鲜分离的胰腺腺泡细胞（PACs）呈球形，主要以簇状分布（每簇3–8个腺泡细胞）。腺泡细胞的顶端颜色较深，可见清晰的酶原颗粒；细胞周围未观察到颗粒或囊泡样结构，溶液背景清晰。每只小鼠腺泡细胞的产量范围为1.6至1.95 × 10⁷个细胞［（1.77 × 107）±（1.75 × 106）］（图2C，D）。
胰岛细胞和腺泡细胞的钙黄素/碘化丙啶（Calcein/PI）染色结果如图3A所示：钙黄素染色的细胞（绿色）占绝大多数，而碘化丙啶染色的细胞（红色）极少。使用ImageJ对活/死细胞染色图像进行定量分析，结果显示分离获得的胰岛细胞和腺泡细胞的存活率分别为(97.52 ± 0.16)%和(96.55 ± 0.95)%（图3B）。
分离的胰腺腺泡细胞的基础淀粉酶活性为 (0.79 ± 0.01) U/mL。在分别用 10 nM、20 nM 和 50 nM 浓度的雨蛙素刺激后，腺泡细胞的淀粉酶活性分别为 (1.45 ± 0.03) U/mL、(1.65 ± 0.05) U/mL 和 (1.39 ± 0.02) U/mL。单因素方差分析结果显示，与对照（Ctrl）组相比，所有雨蛙素刺激组的淀粉酶活性均存在显著差异（均 P &lt; 0.001）。此外，20 nM 与 10 nM 雨蛙素组之间的淀粉酶活性也存在显著差异（P &lt; 0.001）（图 4A）。
当用5.6 mM葡萄糖溶液刺激时，分离的胰岛胰岛素分泌量为(0.27 ± 0.04) ng/mL/胰岛/h。当用22 mM葡萄糖溶液刺激时，分离的胰岛胰岛素分泌量为(0.94 ± 0.04) ng/mL/胰岛/h，葡萄糖刺激指数（GSI）为3.44。结果表明，分离的胰岛在不同浓度葡萄糖溶液刺激下表现出典型且有效的胰岛素分泌反应（图4B）。
我们研究团队观察到，分离所得胰岛和腺泡细胞的数量与质量与消化时间密切相关，因此在操作过程中必须严格控制消化时间，以减少不同操作者之间的差异影响。同时，细胞产量和活性的波动也与胰腺的完全解剖以及胰腺组织的机械分离密切相关，这些步骤在操作过程中需要特别注意。
<img alt="胰岛分离过程，离心管中的分层，细胞分离，实验室实验装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68960/68960fig1.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图1"> 
图1：Ficoll 溶液密度梯度离心结果。 胰岛层位于无色透明液体层与培养基之间的界面处。离心管底部的沉淀物为胰腺腺泡细胞（PACs）。缩写：PACs：胰腺腺泡细胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68960/68960fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="胰岛和PACs的细胞形态显微图像及细胞计数柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68960/68960fig2.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="Figure 2"> 
图2：胰岛和PACs的形态学与定量特征。（A）从小鼠胰腺组织中分离的胰岛形态。比例尺 = 100 µm。（B）从小鼠胰腺组织中分离的胰岛数量的定量分析（n = 3）。（C）从小鼠胰腺组织中分离的PACs形态。比例尺 = 100 µm。（D）从小鼠胰腺组织中分离的PACs数量的定量分析（n = 3）。所有数据均表示为均值 ± 标准差（SD）。缩写：PACs：pancreatic acinar cells（胰腺腺泡细胞）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68960/68960fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="胰岛和PACs的活死细胞分析；钙黄绿素和PI染色显微图像，柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68960/68960fig3.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="Figure 3"> 
图3：胰岛和PACs的活力评估。（A）采用钙黄绿素/碘化丙啶荧光染色法评估小鼠胰岛和PACs的活力。绿色：活细胞；红色：死细胞。比例尺 = 100 µm。（B）胰岛和PACs活力的定量分析（n = 3）。所有数据均表示为均值 ± 标准差。缩写：PACs：胰腺腺泡细胞；PI = 碘化丙啶。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68960/68960fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="淀粉酶活性与蓝肽浓度；胰岛素分泌与葡萄糖；实验图示。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68960/68960fig4.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 4"> 
图 4：PACs 淀粉酶活性及胰岛细胞胰岛素分泌能力的评估。（A）在不同浓度蓝肽刺激下 PACs 的淀粉酶活性（Ctrl：对照组；C10、C20 和 C50：蓝肽浓度分别为 10 nM、20 nM 和 50 nM（n = 3））。（B）葡萄糖刺激的胰岛素分泌浓度的定量分析（n = 3）。所有数据均表示为均值 ± 标准差。***P &lt; 0.001。缩写：GSI = 葡萄糖刺激胰岛素指数；PACs：胰腺腺泡细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68960/68960fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本研究建立了一种简化方法，可高效提取小鼠胰腺中的功能性原代胰岛细胞和腺泡细胞，为研究急性胰腺炎诱导糖尿病发病机制中的细胞间通讯提供了有价值的工具。

在急性胰腺炎后糖尿病（PPDM-A）发病机制的研究中，胰腺腺泡细胞与...之间异常的双向通讯...

本研究建立了一种简化方法，可高效提取小鼠胰腺中的功能性原代胰岛及腺泡细胞，为研究急性胰腺炎诱导糖尿病（PPDMA）发病机制中的细胞内通讯提供了有力工具。目前从小鼠分离原代胰岛的主要方法依赖于胆管插管技术。该技术需要精确定位并插管胆管，随后进行胰腺实质的体内灌注胶原酶P溶液。若无专业培训，很难完成有效的胰腺灌注，实现高效灌注具有挑战性。本视频介绍了一种简单快速的原代胰岛分离方法，适用于无灌注经验的研究人员。该方法还可同时获取原代胰腺腺泡细胞，能够获得足量且高质量的胰岛和腺泡细胞。该方法使研究人员能够在相同的病理和生理背景下进行实验，从而促进对胰岛细胞与腺泡细胞之间相互作用机制的深入分析。胰岛细胞和胰腺腺泡细胞（PACs）的分离。向12孔板中加入Hank's平衡盐溶液和胶原酶P溶液，并向50毫升离心管中加入3毫升胶原酶P溶液，用于后续消化。手术前用1.25%三溴乙醇麻醉小鼠，随后实施安乐死。作V形腹部切口以打开小鼠腹腔。位于左季肋区的暗红色淋巴器官为脾脏，附着于脾脏的白色器官为胰腺。沿胃下缘及胰十二指肠交界处仔细进行钝性分离胰腺。用Hank's平衡盐溶液清洗分离的胰腺组织，去除残留的肠系膜附着物、脾脏及胰周脂肪组织。将预处理后的胰腺转移至已预先加入2 mL胶原酶P溶液的12孔板中。用左手持镊子固定胰腺，右手持1 mL注射器将胶原酶P溶液注入胰腺实质，直至胰腺组织呈现半透明和水肿状。用手术剪迅速将胰腺切成1至2 mm³的组织块。剪去1 mL移液器吸头末端1至1.5 cm，以扩大开口，用此改造后的吸头将胰腺组织块连同2 mL胶原酶P溶液一起转移至预先加入3 mL胶原酶P溶液的50 mL离心管中。将离心管置于37摄氏度水浴中孵育12分钟，期间每5至6分钟轻轻振荡试管一次。加入10毫升RPMI 1640完全培养基，以终止胶原酶P溶液的消化作用。用5毫升巴斯德移液管反复吹打沉淀物，上下吹打15至20次，直至无明显的大块组织残留。加入10毫升RPMI 1640完全培养基。然后在4摄氏度下以180 × g离心2分钟，弃去上清液，用20毫升RPMI 1640完全培养基重悬沉淀。将悬液通过40目筛网过滤，然后在4°C条件下以180 × g离心2分钟，小心弃去上清液。加入20毫升Ficoll溶液以重悬沉淀。然后缓慢加入15毫升RPMI 1640完全培养基。此时可观察到清晰的液体界面。在25°C下以640 × g轻轻离心20分钟。小心取出离心管，使用5 mL巴斯德吸管吸除上层红色培养基。然后，小心吸取液体层界面处含有胰岛的液体，并转移至新的50 mL离心管中。加入20毫升RPMI 1640完全培养基。在4°C下以180 × g离心2分钟，弃去上清液。用20毫升RPMI 1640完全培养基重悬沉淀。在4°C条件下，以180 × g离心2分钟，弃去上清液。用10 mL RPMI 1640完全培养基重悬沉淀，并转移至60 mm细胞培养皿中。在倒置生物显微镜下以100倍放大倍数，使用20微升移液器手动挑选胰岛。将选好的胰岛转移至已预先加入500微升RPMI 1640完全培养基的24孔细胞培养板中。弃去Ficoll溶液层。用10毫升完全DMEM培养基重悬沉淀。通过100微米细胞滤网过滤。在4摄氏度下以180 × g离心2分钟。弃去上清液。用10毫升完全DMEM培养基重悬沉淀。在4°C下以180 × g离心2分钟，并弃去上清液。然后，用5 mL DMEM完全培养基重悬沉淀，用于后续实验。经过Ficoll溶液密度梯度离心后，胰岛可见于透明无色液体层与管底含有沉淀物的培养基之间的界面附近。胰岛通常呈圆形或椭圆形，金棕色，每只小鼠的稳定产量为120 ± 5个，见图A和图B。 freshly isolated PACs呈球形并成簇聚集。腺泡细胞的顶端较深，可见明显的酶原颗粒，每只小鼠的细胞产量为 1.6 至 1.95 × 10⁷ 个细胞，见图 C 和图 D。胰岛和腺泡细胞的钙黄绿素-PI 染色显示，大多数细胞呈绿色钙黄绿素荧光（活细胞），仅有少量呈红色 PI 荧光（死细胞），见图 A。基于 Image J 的定量分析显示，分离得到的胰岛和腺泡细胞的存活率分别为 97.52 ± 0.16% 和 96.55 ± 0.95%，见图 B。分离的胰腺腺泡细胞的基础淀粉酶活性为 0.79 ± 0.01 单位/毫升。在分别用 10 纳摩尔、20 纳摩尔和 50 纳摩尔雨蛙素刺激后，其淀粉酶活性分别为 1.45 ± 0.03 单位/毫升、1.65 ± 0.05 单位/毫升和 1.39 ± 0.02 单位/毫升。单因素方差分析显示，所有雨蛙素处理组与对照组相比，淀粉酶活性均有显著差异，所有 P 值均小于 0.001。此外，20 纳摩尔组与 10 纳摩尔组之间差异显著，P 值小于 0.001，图 A。分离的胰岛在 5.6 毫摩尔葡萄糖刺激下胰岛素分泌量为 0.27 ± 0.04 纳克/毫升/胰岛/小时，在 22 毫摩尔葡萄糖刺激下为 0.94 ± 0.04 纳克/毫升/胰岛/小时，GSI 等于 3.44，图 B。本研究建立了一种无需复杂体内灌注的原代小鼠胰岛和胰腺腺泡细胞同步分离方法。尽管该技术存在较长的技术壁垒，但操作简便，每只小鼠可获得 120 ± 5 个胰岛和 1.6 至 1.95 × 10⁷ 个腺泡细胞，两类细胞的存活率均超过 96%。分离得到的胰岛表现出正常的葡萄糖刺激胰岛素分泌功能，腺泡细胞对蛙皮素（caerulein）刺激具有敏感性。这证实了通过该方法获得的细胞功能完整，适用于胰腺外分泌与内分泌相互作用的研究。尽管该方法受限于需要具备基本的小鼠解剖学知识、需调整试剂剂量、同时处理的小鼠数量有限，以及存在未经验证的应用风险，但对于缺乏灌注经验的研究人员而言，它仍提供了一种可靠的细胞分离方案。

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