一种简单快速的方法，同时分离小鼠的原级胰岛和原级胰腺细胞

本研究开发了一种简化方法，高效提取小鼠胰腺功能性原发胰岛和腺腺细胞，为研究急性胰腺炎诱发糖尿病PPDMA发病机制中的细胞内通讯提供了宝贵工具。目前从小鼠中分离原发胰岛的方法主要依赖胆管插管。该技术需要精准定位并插管胆管，随后进行胰腺实质胶原酶P溶液的体内灌注。

没有专业培训，实现有效且高效的胰腺灌注非常具有挑战性。本视频阻止了一种简单快速的方法来分离适合无灌注经验研究者的初级安装岛。该方法还能同时获得原发胰腺腺细胞，产生足够数量的高质量胰岛和腺动脉瘤细胞。

它使研究人员能够在同一病理和生理背景下进行实验，从而促进对胰岛与细胞相互作用机制的深入分析。胰岛和胰腺腺细胞PAC的分离。将汉克的平衡盐溶液和胶原蛋白酶P溶液加入12孔板，并将3毫升胶原蛋白酶P溶液加入50毫升离心管进行后续消化。

手术前用1.25%三溴乙醇麻醉小鼠，随后进行安乐死。在腹部做一个V形切口，打开小鼠的腹腔。左侧疑病区的深红色淋巴器官是脾脏，附着于脾脏的白色器官是胰腺。

仔细地在胃下缘和胰十二指肠交界处进行钝性切除。用Hank的平衡盐溶液清洗分离的胰腺组织，去除残留的肠系膜附着物、脾脏和胰腺周围脂肪组织。将预处理的胰腺移至12孔板，预先加入2毫升胶原酶P溶液。

用左手用镊子固定胰腺，右手用一毫升注射器将胶原蛋白酶P溶液注入胰腺实质，直到胰组织呈现半透明且带水肿。用外科剪刀快速将胰腺切成一到两毫米的立方体组织。将远端一至1.5厘米的一毫升移液器尖端切下以扩大开口，并用该改良的尖端将胰腺组织片段与两毫升胶原酶P溶液一起转移到预装三毫升胶原酶P溶液的50毫升离心管中。

将离心管浸泡在37摄氏度的水浴中孵育12分钟，期间每5到6分钟轻轻摇晃一次。加入10毫升RPMI 1640全培养基，终止胶原酶P溶液的消化作用。用5毫升巴斯德移液器反复吸液，上下各15到20次，直到无明显的大组织团块残留。

加入10毫升RPMI 1640全媒介。然后以180乘G离心机，离心两分钟，温度为四摄氏度。并丢弃上清液，用20毫升RPMI 1640全培养基重新悬浮沉淀液。

用40网筛过滤悬挂液。然后以180乘G离心机，离心两分钟，温度为四摄氏度。轻轻丢弃上清液。

加入20毫升Ficoll溶液以重新使沉淀物悬浮。然后慢慢加入15毫升RPMI 1640全媒介。此时可以观察到一个透明的液体界面。

以640乘G轻轻离心，25摄氏度，离心20分钟。小心取出离心管，并用五毫升巴斯德移液器抽取上层红色介质层。然后，在液体层界面处小心吸取含液岛，并将其转移到新的50毫升离心管中。

加入20毫升RPMI 1640全媒介。以180加G离心，四摄氏度离心两分钟，然后丢弃上清液。用20毫升RPMI 1640全培养基重新悬浮颗粒。

以180加G离心，四摄氏度离心两分钟，然后丢弃上清液。用10毫升RPMI 1640全培养基重新悬浮沉淀。然后转移到60毫米的细胞培养皿中。

在倒置生物显微镜下，放大倍率为100倍，使用20微升移液器手动挑选胰岛。将选定的胰岛转移到预装500微升RPMI 1640全培养基的24孔培养基上。丢弃Ficoll解层。

用10毫升DMEM全培养基重新悬浮沉淀。通过100微米的过滤网过滤。离心机在180乘G速度下，四摄氏度，离心两分钟。

然后丢弃上清液。用10毫升DMEM全培养基重新悬浮沉淀。在180度离心，加G，四摄氏度，离心两分钟，然后丢弃上清液。

然后用5毫升DMEM全培养基重新悬浮沉淀，用于后续实验。在Ficoll溶液密度梯度离心后，观察到透明无色液体层与介质界面附近出现岛屿，管底有沉积物。小岛通常为圆形、金棕色，每只小鼠的稳定产量为120个，每只小鼠的产量为120个，或减5个，见图A和图B。新分离的PAC为球形且聚集。

针孔细胞顶端颜色较深，带有可见的酶原颗粒，产量为每只小鼠1.6至1.95乘以10的七次方细胞，图C和图D。岛屿和腺嘌醇细胞clacein PI染色显示大多数细胞染色为绿色钙蛋白，活细胞，少数红色PI染色，死细胞，图A。基于图像J的定量分析显示，分离的胰岛和细胞存活率为97.52%正负0.16%，96.55%以上。分别为-0.95%，图B。分离出的胰腺细胞，基础淀粉酶活性为0.79±0.01单位/毫升。在用10纳摩尔、20纳摩尔和50纳摩尔的蓝蛋白刺激后，它们的淀粉酶活性分别为1.45±0.03单位/毫升、1.65±0.05单位/毫升和1.39±0.02单位/毫升。单因子方差分析显示，所有蓝蛋白组的淀粉酶活性与对照组显著不同，所有P值均低于0.001。

此外，20纳摩尔组与10纳摩尔组有显著差异，P值小于0.001，图A。在5.6毫莫尔葡萄糖刺激下，分离的胰岛每胰岛每毫升每小时0.27纳克，22毫莫尔葡萄糖刺激时，胰岛每毫升每毫升分泌0.94纳克，血糖为22毫莫尔。 GSI等于3.44，见图B。本研究建立了一种无需复杂体内灌注即可同时分离原级小鼠胰岛和胰腺腺细胞的方法。由于技术障碍较长，该方法作简便，每只小鼠可获得120个正负5个胰岛和1.6至1.95乘以10的七次方腺窝细胞，两种细胞类型均显示出超过96%的存活率。分离的胰岛表现出正常的葡萄糖刺激胰岛素分泌，且腺窝细胞对蓝蛋白刺激敏感。这证实通过该方法获得的细胞功能完整，适合胰腺外分泌和内分泌相互作用的研究。

尽管该方法受限于对小鼠基本解剖知识的需求、试剂剂量调整需求、同时处理小鼠数量限制以及未验证的应用风险。它仍然为缺乏灌注经验的研究人员提供了可靠的细胞分离方案。