切向流超滤：一种用于胶体银纳米颗粒尺寸筛选与浓缩的“绿色”方法

本实验的总体目标是验证切向流超滤法在处理较大体积胶体纳米颗粒及较小体积Tate样品时的可行性。首先合成四升胶体银纳米颗粒。通过紫外-可见吸收光谱法测定表面等离子体共振，以验证胶体的质量。

接下来，使用切向流超滤法将该胶体浓缩并筛选，最终将其浓缩至 4 毫升水中。然后采用电感耦合等离子体光学发射光谱法，定量测定原始胶体及超滤过程中代表性样品中的银含量。最后结合图像处理技术进行透射电子显微镜分析。

使用 Image J 软件展示原始胶体和最终超滤液中银纳米颗粒的尺寸分布。对于初次使用 ICP-OES 进行纳米材料定量的研究人员，需要掌握玻璃器皿的清洗步骤，这是确保玻璃器皿无任何痕量金属污染的关键。此外，正确消解胶体样品以及制备 ICP-OES 校准标准品所需的时间也同样重要。

与其他方法（如基于溶解度、尺寸排阻色谱、分级结晶和凝胶电泳）相比，本方法避免了聚集、合成毒性、试剂毒性、不期望的包覆、高成本或效率降低等问题。本视频将展示科罗拉多·苏恩纳米颗粒的合成过程，并通过可见-紫外光谱分析和ICP-OES对其进行表征。演示者为我实验室的研究学生奥斯汀·威廉姆斯（Austin Williams）、约书亚·贝克（Joshua Baker）和凯瑟琳·安德斯（Catherine Anders）。大家好，我是伍利博士（Dr. Woolley），我将进行切向流过滤操作，杰姬·思科（Jackie Cisco）将进行电子显微镜检测。所有玻璃器皿均需仔细清洗，具体描述见 accompanying text。

使用经10摄氏度冷却的高压灭菌水，配制300毫升浓度为2毫摩尔的硼氢化钠溶液和100毫升浓度为1毫摩尔的硝酸银溶液。将300毫升硼氢化钠溶液加入含有搅拌子的500毫升锥形反应瓶中。用铝箔包裹反应瓶以防止银氧化，并在冰浴中搅拌。

用超纯水冲洗25毫升滴定管，使其充满整段水柱，然后用硝酸银溶液同样冲洗整段柱体。随后用铝箔包裹滴定管，并将其充满硝酸银溶液。在暗室中，向钠或氢化物溶液中加入50毫升硝酸银溶液。

用铝箔帐篷覆盖装置的中段，以减少光照暴露。在此期间定期补充冰浴。继续在冰上搅拌胶体溶液额外的 45 至 50 分钟。

银纳米颗粒的形成以颜色由无色变为金黄色为标志，这是银纳米颗粒表面等离子体共振吸收峰的特征。将所得胶体冷藏。用一次性1毫升比色皿，按1:10的体积比加入克林顿胶体和超纯水。为进行空白基线校正，另取一个比色皿加入超纯水。

用无尘纸擦拭两支Q vets的外表面。将分光光度计设置为吸光度模式，Y轴范围从负0.5至1.0。同时，将X轴扫描范围设为200至800纳米，并选择快速扫描速率及基线校正。

将装有水的Q vet插入仪器，运行基线扫描。如有必要，重复此步骤，直至获得非零基线对照。用待测样品的Q vet替换空白Q vet，启动吸光度扫描，以采集胶体样品的紫外-可见吸收光谱。

按照随附文本所述，将17根主柔性进液管连接至蠕动泵，使用DIR按钮选择逆时针泵送方向，并确认模式按钮处于INT状态。将泵速设置为低于300毫升每分钟。接下来，通过在过滤回路中创建真空来对系统进行预冲洗。

当液体在系统中自由流动后，关闭泵，关闭管路连接处的端口并移除夹具。再次启动泵，并监测管路系统是否存在泄漏。随后根据管路尺寸逐步增加泵的流速。

继续过滤，直至储液瓶中的液体几乎耗尽，然后关闭泵，降低泵速，并从过滤回路中收集截留物。该截留物包含大于50纳米的纳米颗粒。接下来，收集滤液，滤液包含小于50纳米的纳米颗粒。

样品经滤膜后可安全用于进一步分析，滤液用于下一步实验。接下来选择直径小于20纳米的纳米颗粒。用2%硝酸的超纯水溶液冲洗管路。

使用100千道尔顿的CROs滤器重复过滤过程。收集过滤回路中的截留液。样品可进一步使用更小的100 KD微滤器和更小尺寸的14号管路，以及更低的泵速（引液步骤为30 mil，过滤步骤为90 mil）进行浓缩。

该方法旨在通过银纳米颗粒制备过程中的纯化步骤来定量银含量。使用低密度聚丙烯容器，以防止样品中银的浸出。首先用浓硝酸对样品进行化学消解。

同时使用八个标准品制备银的标准曲线。接下来，设置 I-C-P-O-E-S 仪器的参数，包括银的波长、射频功率、等离子体流量、辅助气体流量和雾化器压力。同时将仪器设置为每个样品测量三次，每次重复测量时间为 10 秒。

在测量稳定时间15秒和样品吸取延迟30秒之间使用该方法。此外，务必在每个样品之间引入方法空白，以减少潜在的交叉污染。现在加载样品，并用超纯水稀释100千道尔顿的标准样品。

现在将20微升原始胶体和稀释后的100千道尔顿溶液滴加到300目碳膜镀金载网上。将载网置于空气中自然干燥。将透射电子显微镜（TEM）的加速电压设为70千伏，使用高分辨率相机拍摄银纳米颗粒的电子显微图像，并以TIFF格式保存。

在此制备四升蛋清和胶体银纳米颗粒的过程中，最终胶体呈现特征性的金黄色。该胶体的紫外-可见吸收光谱在394纳米处显示出典型的尖锐且对称的表面等离子体共振峰。原始蛋清胶体和最终的100千道尔顿复合物的拉曼光谱仅显示出三个振动模式。

水的弯曲振动模式位于1,640 cm⁻¹处，以及其对称与不对称伸缩振动模式。通过三步切向流超滤过程，对银纳米颗粒进行尺寸筛选与浓缩，最终获得100千道尔顿截留分子量、体积为4毫升的样品。大部分合成副产物及过量试剂通过水溶剂被去除。

然后使用ICP-OES校准曲线测定银的含量。此处，实际产率非常接近15.4 ppm的典型理论产率。在该反应中，银纳米颗粒的极高浓度表现为颜色发生显著变化，即从原始胶体的金黄色变为最终100 kDa产物的深棕色。ICP-OES测量结果证实了肉眼观察现象，并揭示了最终100 kDa产物中银的浓度。

这些原始甲状腺球蛋白胶体和最终的100千道尔顿截留分子量样品的透射电子显微镜（TEM）图像表明，在未聚集状态下，银纳米颗粒在较浅灰色背景上呈现为黑色圆形区域。这些TEM粒径分布直方图是通过分析约800个原始甲状腺球蛋白银纳米颗粒和最终100千道尔顿截留分子量样品中的银纳米颗粒得到的。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用切向流过滤对银纳米颗粒进行浓缩及粒径筛选。

可对不同体积的样品进行浓缩，同时最大限度减少聚集。您还应充分掌握如何表征纳米颗粒。一旦熟练掌握，该技术可在六小时或更短时间内完成。

在进行该操作时，需要注意的是，即使在冷藏条件下，高浓度的胶体悬浮液也具有有限的保存期限。这一限制可通过仔细的研究、规划和准备工作加以管理。请务必牢记，在进行ICP-MS分析的化学消解过程中，操作热硝酸试剂可能存在危险，因此必须采取适当的安全防护措施，例如在化学通风橱中操作或穿戴合适的个人防护装备。