流感病毒聚合酶PB2亚基基因至结构解析的多靶点并行处理方法

以下实验的总体目标是采用多靶点策略，通过X射线晶体学对目标蛋白进行结构解析，而起始材料仅为本例中的一条单一基因或遗传序列。该目标蛋白为甲型流感病毒的PB2聚合酶亚基，是病毒复制过程中的关键组分。多靶点策略的实现首先基于单一目标序列以及对该蛋白已知的其他信息，平行设计并克隆一系列基因构建体。

第二步是检测每种构建体的表达水平，并从中筛选出最适合在细胞培养中进行大规模蛋白表达的构建体。下一步需要裂解细胞，从表达产物中分离目标蛋白，并将每种蛋白纯化至极高纯度。随后对每种蛋白进行一系列结晶试验，以获得适合X射线研究的晶体形态。

随后对一个或多个晶体收集高分辨率X射线衍射数据，并用于求解和精修电子密度图，以描绘出每个靶标蛋白的结构。这些结果使得能够基于电子密度图呈现靶标蛋白的三维结构。多靶标处理通过在结构解析路径中的每一个潜在瓶颈处提供可行的替代方案，显著提高了结构确定成功的可能性。

同时对多个靶点进行操作也具有很高的效率，可降低每一步骤中每个蛋白质所需的时间和成本。提高药物可靶向蛋白结构解析完成的速度，将每年带来更多治疗方案开发的机会。尽管该方法可为结构生物学研究提供宝贵的见解，但通过这些方法获得的高质量蛋白质还可支持任何基于蛋白质的科学研究。

该过程的每个阶段都有其自身的科学依据，并需要相应的专业知识，但一旦整合所有环节，对人员、仪器和专业技术的投入将会获得丰厚的回报。在选定目标基因及其基因产物进行研究后，第一步需要设计多种遗传变异体或构建体。利用基因设计软件，在蛋白质水平上设计这些构建体，同时生成相应的编码序列，用于工程化合成基因序列。

利用比对查看器模块和构建设计模块，比较蛋白质序列比对结果，并定义蛋白质构建体设计中用于插入片段PCR和载体PCR的末端引物或引物对。接着，使用 Gene Composer 的蛋白质到DNA算法，将每条氨基酸序列反向翻译为编码的工程化核酸序列。根据相应的密码子使用表优化序列，以实现在特定细胞系中的高效表达。

在此例中为大肠杆菌。一旦目标基因序列准备就绪，即可进行虚拟克隆，并将该基因插入适合细菌表达的载体质粒中。此处所用载体为改良的 PET 28 载体。

该载体包含表达和蛋白质纯化所需的某些组分。目标基因经过修饰，可在蛋白的N端或C端插入组胺标签序列，以及一段可被切割的序列，以便在纯化过程中去除标签。该载体还带有抗生素抗性基因，用于表达检测和发酵。

随后，通过标准的基因合成方法构建每种目标蛋白的遗传序列，以准备进行引物介导的不完全延伸克隆（pipe cloning）。pipe cloning 是一种基于 PCR 的克隆策略，其中使用与预定载体互补的引物扩增目标基因。该方法利用了 PCR 后期阶段扩增不完全的特性，使 PCR 产物带有可变的单链末端。我通过在每个反应中加入五微升的正向引物和五微升的反向引物来制备插入片段 PCR（IPCR）。

根据96孔板的板图，将每种全长合成基因各2微升加入对应的孔中。随后，向每个孔中加入25微升PFU主混合液，按照以下PCR条件循环反应25次：在95摄氏度下变性30秒。

在50摄氏度下变性45秒，并在68摄氏度下延伸三分钟。通过IPCR产物的AGROS凝胶分析确认片段扩增，成功的IPCR产物表现为清晰浓重的条带。

较不理想的结果通常表现为单独反应中出现微弱或弥散的条带。通过载体PCR（VPCR）扩增表达质粒，并对VPCR产物进行AROS凝胶分析以确认片段扩增。在IPCR和VPCR产物扩增完成后，将其加入合并板中，并放入热循环仪中进行合并反应。

将成功克隆的构建体转化至化学感受态的大肠杆菌细胞中，并储存在甘油菌种中，以开始表达检测划线。从每种克隆构建体的甘油保存菌种中取少量样品，分别接种到独立的琼脂平板上。平板中加入细菌营养肉汤及载体中编码的抗生素标记物卡那霉素，在37摄氏度下培养过夜，次日进行后续操作。

从新培养的琼脂平板上挑取单个菌落，为每个样品起始一个预培养。用该菌落接种1.2毫升添加了氯霉素和葡萄糖的TB培养基，以进行平行处理。每个预培养在96孔圆底板中进行。

在37摄氏度、220转/分钟振荡条件下过夜培养。过夜培养后，取40微升预培养液接种，为每个样品启动小规模诱导培养。

1.2 毫升 TB 培养基，添加 50 毫克/毫升卡那霉素和 Novagen Overnight Express 系统。1. 在 20 摄氏度下培养诱导培养物 48 小时，以 220 RPM 摇动，然后在 4,000 G 力下离心 15 分钟收集细胞。

弃去上清液，将沉淀物在纯化后于负20摄氏度保存至少一小时，然后再进行后续处理。根据制造商的说明书，使用Caliper Lab CHIP 90系统通过毛细管电泳分析经或未经切割反应的蛋白质。以甲型流感病毒PB2蛋白亚基为例，在34个构建体中，有14个产生了可溶性目标蛋白，并进入下一步大规模发酵阶段。

开始大规模发酵时，从甘油菌种中接种含有50毫克/毫升卡霉素的100毫升细菌培养液，并在37摄氏度下振荡培养过夜。次日，在220转/分钟的振荡条件下，用10毫升该预培养液接种扩大培养。

在2升带挡板的烧瓶中加入含有自动诱导培养基和50毫克/毫升卡那霉素的1升培养液。在37摄氏度下振荡培养扩增的菌液，大约每30分钟摇动一次。通过测量600纳米波长下的紫外吸光度来检测菌液的光密度。

当光密度达到0.6时，在达到所需生长时间后，将摇床培养箱的温度调整为20摄氏度。从每种构建体中取出10毫升具有代表性的样品用于表达检测。在5,000 ×g离心力下离心15分钟收集细胞。

倒掉上清液，并将细胞沉淀在负80摄氏度下冷冻。开始此操作时，将细胞糊在裂解缓冲液中按1:5的总体积比解冻并重悬。在4摄氏度下剧烈搅拌30分钟。

使用洁净的刮刀从烧杯壁上刮下结块。在冰上使用超声破碎仪对细胞进行机械裂解。将粗裂解液在4°C条件下以18,000 ×g离心30分钟，以澄清裂解液。

收集上清液，并在进行大规模纯化之前保留少量等分试样用于分析。通过SDS-PAGE凝胶分析确认每种培养物的大规模蛋白表达。此代表性SDS-PAGE结果显示出强烈的蛋白表达，溶解度约为50%，切割率约为50%。

在此情况下，组氨酸标签与一个在原始构建体中引入的蛋白溶解度标签一同被切除。使用镍树脂将带有独特组胺标签的目标蛋白与包括天然细菌蛋白在内的所有其他细胞物质分离。通过用四倍柱体积的UE水洗涤以去除保存缓冲液，随后用一倍柱体积的缓冲液B和五倍柱体积的缓冲液，准备镍柱。

使用蛋白纯化仪进行A缓冲液的平衡并行化操作，该仪器可同时运行多个层析柱。将含有可溶性组氨酸标签蛋白的每份澄清裂解液分别上样至独立的层析柱中，上样速率为每分钟2毫升，随后用缓冲液A进行数倍柱体积的洗涤，收集穿流液并保存用于后续分析。使用缓冲液A与缓冲液B以95:5、60:40、最后至100%缓冲液B的逐步梯度洗脱结合的蛋白。缓冲液B中的组分可与组氨酸竞争镍树脂上的结合位点，从而在特定比例下将目标蛋白从层析柱上洗脱下来。

分别收集每一份洗脱组分。此处展示的是在镍柱上进行一次层析的代表性层析图结果。通过SDS-PAGE分析镍柱洗脱组分、粗裂解液、澄清裂解液以及镍柱穿流组分，并与层析纯化过程中采集的280纳米波长下的紫外吸收值进行比较。

此步骤用于确定纯化是否成功。选择并合并含有目标蛋白的组分，用于后续处理。根据蛋白的理论消光系数，通过测量280纳米处的紫外吸光度，并结合合并组分的总体积，计算此阶段蛋白的总量。

保存少量样品用于分析。目标蛋白的基因编码了一个特定序列，该序列可被ULP一识别为切割位点，因此加入ULP一后可在组氨酸标签与目标蛋白之间发生切割。开始此操作时，每5毫克纯化合并组分中的蛋白加入1微升泛素样蛋白酶一。

此时，将切割后的蛋白质通过透析袋从缓冲液B转移至缓冲液A中以进行后续处理，在4°C条件下于2升缓冲液A中透析4小时，并持续搅拌。透析后，对PB2使用10千道尔顿的分子量截断值。在存在和不存在ULP1的情况下，对目标蛋白再次进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。

这将确定ULP1切割是否成功，并允许选择最佳组分用于后续处理。此处显示的是聚合酶pb三种构建体的代表性SDS-PAGE结果。第一泳道中为两种亚基分子量标记物。

第2、6、10泳道为镍柱一纯化后汇集的蛋白质；第3、7、11泳道含有镍柱二中在缓冲液A中洗脱的切割后蛋白；第4、8、12泳道显示在缓冲液B中从镍柱二去除组氨酸标签的结果。

去除组胺后，合并镍柱第二次洗脱的组分并进行浓缩。开始凝胶过滤层析（SEC）时，需根据目标蛋白的分子量再次选择合适的层析树脂。本实验采用Superose 110 10/300 GL柱，使用5毫升注射器以每分钟0.5毫升的流速，用200毫升SEC缓冲液平衡层析柱。将样品加载至10毫升样品环中，开始进行SEC层析。在收集小体积组分的同时，于280纳米处监测紫外吸收色谱图。

通过SDS-PAGE电泳分析所有相关的SEC组分。蛋白质结晶试验的标准方法采用悬滴法，通过蒸汽扩散进行。在每种靶蛋白的初始阶段，通常会同时设置两个或更多的稀疏矩阵筛选实验。

开始该流程时，先在选定的结晶筛选条件下，向96孔紧凑型初级结晶板的每个储液池中预先加入80微升溶液；然后向96个孔中的每一个孔加入0.4微升SEC缓冲液中的蛋白质溶液。接着加入0.4微升的结晶筛选试剂，确保每个液滴充分混合。用透明封板膜完全密封整块板，确保每个孔都完全密封。将板置于16摄氏度、无干扰且无环境振动的位置保存。

在接下来的几周内，定期在解剖显微镜下检查蛋白质结晶情况。如果未出现蛋白质晶体，应设置新的实验板，改变条件，并调整最终液滴中的蛋白质浓度，以提高收获前的成功几率。将一个ALS样式的样品托在装有液氮的杜瓦瓶中冷却，并盖上盖子，以开始收获。

将覆盖目标蛋白质晶体所在孔的透明胶带切至附近一个空孔，加入1.6微升相应的结晶条件溶液，并与0.4微升乙二醇混合。在结晶条件下含有20%乙二醇的溶液可保护蛋白质晶体。

在冷冻过程中，通过显微镜观察晶体，并选择合适的冷冻环进行 harvesting，使冷冻环的内径与晶体的最大宽度相匹配。将冷冻环固定在磁性晶体镊子上，直接从孔板溶液中捞取晶体。立即将带有收获晶体的冷冻环浸入冷冻保护剂中，然后放入 LS 型样品托中。

进行闪冻，将晶体重复冷冻，直至获得所需数量的晶体。完成收集后，使用载具棒将带有弯曲舌片的磁性盖子放置在装有闪冻晶体的载具上。将载具翻转至倒置状态，以进行下一步操作。

将样品托推杆拧到样品托上，然后将样品托转移至KU actor doer装置，并用其顶开盖子。样品托中的晶体将保持在液氮浴中冷冻状态，直至使用J Director图像采集软件进行X射线衍射研究。设置以下晶体筛选参数：光束狭缝为0.5度，探测器距离为50毫米，图像步进为70度，曝光时长为30秒。

这是在晶体筛选过程中图像采集软件的示例截图，中间面板显示了一个代表性晶体观测到的X射线衍射图像，需在高分辨率下采集足够数量的图像，以获得用于三维结构解析的完整数据集。本视频中展示的克隆与蛋白质纯化策略共获得14个纯化的PB2样品，其中9个样品获得了适用于衍射研究的晶体。在九个构建体中的五个上，使用Rigaku Super Bright FRE Plus旋转阳极X射线发生器配合QKα辐射，在自备实验室收集了X射线衍射数据集，该系统配备Ossec VariMax HF光学组件和Saturn 944 Plus CCD探测器。

此处显示的是聚合酶 PB2 亚基的 X 射线衍射图像。每套数据均经过处理，共确定了 PB2 亚基的四个结构。每个结构均经过同行评审，并已上传至蛋白质数据银行（Protein Data Bank），供公众访问。

该图展示了晶体学不对称单元中分子的带状结构图。四种 PB2 结构的二级结构按照彩虹色谱着色，并标注了相应的 PDB 编号。本表展示了通过本视频文章所述方法对流感 PB2 靶标进行的结果分析。

基因到结构测定的多靶标并行处理流程包括五个步骤：克隆、可溶性检测、纯化、结晶和结构测定。我们的结构生物学流程产出的结果不仅为基于结构的研究提供了基础，还可支持其他研究，例如通过功能检测验证蛋白质功能，或在MAR或SPR中对新型化合物进行生物物理筛选，以发现药物开发的新起点。该技术及其配套工具的发明，为结构生物学家开展多种发现型研究铺平了道路，包括基于结构的药物设计，这对人类健康与疾病防治产生了重大影响。

观看本视频后，您应该能够充分理解多靶标并行处理如何显著提高结构测定的成功率。请务必注意，在结构生物学实验室工作可能存在极高风险，进行实验操作时必须始终采取适当的安全防护措施，例如正确使用个人防护装备（PPE）。