流感聚合酶PB2亚基基因结构测定多目标并行处理方法

以下实验的总体目标是使用多靶点方法通过 X 射线晶体学对靶蛋白进行结构化测定，在此处介绍的案例中仅从单个基因或基因序列开始。靶蛋白是来自甲型流感的 PB 2 聚合酶亚基，是病毒复制的关键组分。多靶点方法是通过首先根据单个靶序列和有关蛋白质的其他信息并行设计和克隆一系列遗传构建体来实现的。

第二步是测试每种构建体的表达水平，并选择最适合细胞培养中大规模蛋白表达的构建体。下一步需要打开细胞，从表达材料中去除靶蛋白，并将其每个蛋白精炼至非常高的纯度。然后对每种蛋白质进行一系列结晶试验，以获得适合 X 射线研究的晶型。

然后将高分辨率 X 射线衍射数据收集到一个或多个晶体上，用于求解和细化电子密度图，概述每个目标蛋白质的结构。这些结果允许基于电子密度图渲染目标蛋白质的三维结构。多靶标处理通过在途径中的每个潜在障碍中提供可行的替代方案，大大增加了结构化测定成功的可能性。

并行处理多个靶标也非常高效，减少了每个步骤中每种蛋白质的时间和成本。提高可成药靶点结构化确定完成速率的潜力将每年提供更多的疗法开发机会。尽管这种方法可以为结构生物学提供有价值的见解，但通过这些方法获得的高质量蛋白质可以支持任何基于蛋白质的研究。

该过程的每个阶段都有自己的科学，需要自己的专业知识，但是一旦所有部分都组装好，对人员、仪器和专业知识的投资就可以得到丰厚的回报。一旦选择靶基因和基因产物进行研究，第一步需要设计多个遗传变异或构建体。Gene Composer 软件用于在蛋白质水平上设计这些构建体以及工程合成基因序列上的相关代码。

使用比对查看器模块和构建体设计模块，比较蛋白质序列比对并定义蛋白质构建体设计、插入 PCR 和载体 PCR 末端引物或扩增子。接下来，使用 gene composer 的蛋白质到 DNA 算法将每个氨基酸序列反向翻译成工程核酸序列上的代码。使用正确的 code on usage 表来优化特定细胞系中的表达序列。

在这种情况下，是大肠杆菌。一旦靶基因序列准备好，即可虚拟克隆基因并将其插入合适的载体质粒中以进行细菌表达。在本例中为修饰的 PET 28 载体。

该载体包含表达和蛋白质纯化所需的某些组分。对靶基因进行修饰，以在蛋白质的 N 或 C 末端掺入组胺标签序列和切割序列，以便在纯化过程中去除标签。该载体还具有用于表达检测和发酵的抗生素抗性基因。

然后通过标准基因合成方法创建每个靶蛋白基因序列，以准备管道克隆聚合酶不完全一元延伸克隆，或者管道克隆是一种基于 PCR 的克隆策略，其中靶基因用与预期载体互补的引物扩增。该方法利用了晚期 PCR 的不完全性，这使得 PCR 产物具有可变的单链末端。我通过向每个反应中各添加 5 μL 正向和反向引物来制备插入片段 PCR 或 IPCR。

根据板图，在 96 孔板中，根据板图，将每个全长合成基因的 2 微升添加到其适当的孔中。向每个中加入 25 μL PFU 预混液后，使用以下 PCR 条件将反应充分循环 25 次。在 95 摄氏度下变性 30 秒。

Anil 在 50 摄氏度下持续 45 秒，在 68 摄氏度下延长 3 分钟。通过 IPCR 产物的 AGROS 凝胶分析证实片段扩增。成功的 IPCR 产品以稳健的频带为代表。

不太理想的结果通常被视为单独反应中的微弱或拖尾条带。表达质粒通过载体 PCR 扩增或通过 VPCR 产物的 AROS 凝胶分析确认 VPCR 片段扩增。一旦 IPCR 和 VPCR 产物被扩增，它们就会被添加到合并板中，并放入热循环仪中进行合并反应。

然后将成功克隆的构建体转化到化学感受态大肠杆菌细胞中，并储存在甘油茎中，以开始表达检测条纹。从克隆构建体的甘油原液中取少量每个样品到单独的琼脂平板上。该板由细菌营养肉汤制成，载体中编码的抗生素标记物卡那霉素于第二天在 37 摄氏度下孵育过夜。

通过从新鲜生长的琼脂平板中挑选单个菌落，开始为每个样品进行预培养。使用此菌落接种 1.2 毫升补充有罐装霉素和葡萄糖的 TB 肉汤，以进行平行处理。每种预培养物都在 96 孔圆底块中生长。

在 37 摄氏度下生长过夜，以每分钟 220 转的速度摇动。一夜之间生长。通过使用 40 μL 的预培养物进行接种，为每个样品开始小规模诱导培养。

1.2 毫升 TB 肉汤。补充每毫升 50 毫克的罐头 mycin 和 novagen 隔夜快递系统。一，将诱导培养物在 20 摄氏度下培养 48 小时，以 220 RPM 振荡，以 4， 000 GForce 单位离心 15 分钟，收获细胞。

倒出上清液，将沉淀物在零下 20 摄氏度下储存至少 1 小时，然后纯化后再进一步处理。根据制造商的方案，使用卡尺实验室 CHIP 90 系统通过毛细管电泳分析有和没有切割反应的蛋白质。在流感的情况下，PB 2 个蛋白亚基 34 个构建体中的 14 个导致可溶性靶蛋白，并进入下一步大规模发酵。

为了开始大规模发酵，接种 100 毫升细菌细胞培养液，每毫升含 50 毫克。甘油中的霉素可以在 37 摄氏度下储存并生长过夜吗？第二天以 220 RPM 振荡，使用 10 毫升接种扩增预培养物。

一升含有自动诱导培养基和每毫升 50 毫克的肉汤，可以在 2 升带挡板的烧瓶中加入霉素。大约每 30 分钟在 37 摄氏度下摇动扩增的培养物。通过测量 600 纳米波长的紫外吸光度来检查培养物的光密度。

当光密度达到 0.6 时，在所需的生长时间后将振荡培养箱的温度更改为 20 摄氏度。从每个构建体中取出一个具有代表性的 10 毫升 Ali 四边形用于表达测试。通过在 5， 000 GForce 单位下离心 15 分钟来收获细胞。

倒出上清液，将细胞沉淀在零下 80 摄氏度下冷冻。要开始此过程，请以 1 比 5 的主体积比解冻并重悬于裂解缓冲液中。在 4 摄氏度下剧烈搅拌 30 分钟。

用干净的抹刀从烧杯侧面掰开大块。用共济会超声膏在冰上机械裂解细胞。通过在 4 摄氏度下以 18， 000 GForce 单位离心 30 分钟来澄清粗裂解物。

收集上清液并保存少量等分试样用于分析，然后再进行大规模纯化。通过 SDS 页面凝胶分析确认每种培养物的大规模蛋白质表达。该代表性 SDS 页面结果显示稳定的蛋白质表达，溶解度约为 50%，切割度约为 50%。

在这种情况下，组氨酸标签与添加的蛋白质溶解度标签一起被去除，该标签是在原始构建体中设计的。镍树脂用于将具有独特组胺标签的靶蛋白与所有其他细胞材料（包括天然细菌蛋白）分离。制备镍单柱，方法是用 4 倍柱体积的 UE 水洗涤以去除储存缓冲液，然后用 1 倍柱体积的缓冲液 B 和 5 倍柱体积的缓冲液洗涤。

E 的 A 级平衡平行化是通过 Protein Maker（能够同时运行多个色谱柱）完成的。以每分钟 2 mL 的速率将每种含有溶解蛋白（带有组胺标签的溶解蛋白）的澄清裂解物加载到单独的色谱柱中，然后用缓冲液 A 进行几次柱体积洗涤，收集流过缓冲液并保存以供分析。缓冲液 A 和 B 以 95 比 5、60 比 40 的比例洗脱结合的蛋白质，最后以 100% 缓冲液 B 洗脱结合的蛋白质，缓冲液 B 中的组分与组胺竞争镍树脂，从而以给定的比例从色谱柱中去除蛋白质。

分别收集每个洗脱馏分。此处显示了在 Nickel One 色谱柱上运行的典型色谱图结果。通过 SDS 页面分析镍 1 逃脱馏分、粗裂解物、澄清裂解物和镍 1 流过，并与色谱柱纯化过程中收集的 280 纳米处的紫外吸光度进行比较。

此步骤确定纯化是否成功。选择并合并含有目标蛋白的馏分，以用于进一步处理。用蛋白质的理论消光系数计算此阶段的蛋白质总量，测量 280 纳米处的紫外吸光度并考虑合并级分的总体积。

保存少量样品进行分析。靶蛋白的基因用特定序列编码，该序列被 ULP one 识别为切割位点，因此添加 ULP one 会导致组氨酸标签和目标蛋白质之间的切割。要开始此程序，请添加 1 微升泛素样蛋白酶，混合组分中存在的每 5 毫克蛋白质添加 1 微升。

此时，将裂解的蛋白质从缓冲液 B 转移到缓冲液 A 中，使用透析管进行进一步处理，在 4 摄氏度下用 2 升缓冲液 A 透析蛋白质 4 小时，同时搅拌。透析后 PB 2 使用 10 道尔顿的截留分子量。运行目标蛋白的另一块 SDS 页面凝胶，其中存在和不存在 ULP。

这将确定 ULP one 切割是否成功，并允许选择最佳馏分进行进一步处理。此处显示了聚合酶 pb 的三种构建体的代表性 SDS 页面结果。两个亚基分子量标记物位于泳道 1 中。

泳道 2、6 和 10 是来自镍 1 色谱柱的混合蛋白质。泳道 3、7 和 11 包含缓冲液 A 中来自镍 2 以及泳道 4、8 和 12 的裂解蛋白流出。显示缓冲液 B 中从镍 2 中去除组胺标签。

去除组胺后，浓缩来自镍二的混合馏分。要开始 SEC，必须根据目标的分子量再次选择合适的填料在这种情况下，使用 acere S 110 超过 30 GL 色谱柱，并使用 5 mL 注射器以每分钟 0.5 mL的流速用 200 mL SEC 缓冲液平衡，将样品加载到 10 mL 样品定量环中，然后开始 SEC 色谱柱运行。监测 280 纳米处的 UV 吸收色谱图，同时收集小体积馏分。

通过 SDS 页面运行所有相关的 SEC 馏分。蛋白质结晶试验的标准方法是通过涉及蒸汽扩散的坐滴法进行。在一开始就为每个靶蛋白设置两个或多个稀疏基质筛选的情况并不少见。

要开始此过程，请在 96 孔紧凑初级结晶板的每个储液槽中预填充 80 μL，在选定的结晶筛网中，将 0.4 μL 蛋白质在 SEC 缓冲液中分配到 96 个孔中的每个孔中。然后加入 0.4 μL 结晶筛，确保每个结晶筛中的液滴完全混合。井用晶莹剔透的天花板胶带覆盖整个陈词滥调，确保每个孔完全密封，将板存放在 16 摄氏度的不受干扰的位置，不受环境振动的影响。

在接下来的几周内，在解剖显微镜下定期检查蛋白质结晶。如果没有出现蛋白质晶体，请在不同的条件下设置新板，并在最后一滴中改变蛋白质浓度，以增加收获前成功的可能性。在装满液氮的投掷器中冷却 A LS 型圆盘，盖上盖子开始收获。

将覆盖有目标蛋白质晶体的孔的透明胶带剪成附近的空。加入 1.6 微升相应的结晶条件，并将其与 0.4 微升乙二醇混合。在结晶条件下使用 20% 乙二醇溶液保护蛋白质晶体。

在冷冻过程中，在显微镜下分析晶体并选择合适的冷冻定量环进行收获，使定量环的内径与晶体的最大宽度相匹配。将冷冻回路连接到磁性晶体棒上，直接从孔溶液中环晶体。立即将含有收获晶体的冷冻定量环浸入冷冻保护剂中，然后浸入 LS 型圆盘中。

要闪烁，请冻结所需数量的晶体的晶体重复序列。收获完成后，使用圆盘棒在圆盘上放置一个磁性盖，其中装有带有弯曲舌头的闪蒸冷冻晶体。将冰球倒置以进行下一步。

将圆盘推杆拧到冰球上，然后将圆球转移到 KU 演员 doer 并用它打掉盖子。圆盘中的晶体在液氮浴中保持冻结，直到准备好使用 J Director 图像采集软件进行 X 射线衍射研究。为晶体筛选光束设置 0.5 度狭缝、50 毫米的探测器距离、70 度的图像步长和 30 秒的曝光长度的以下参数。

这是图像采集软件的示例屏幕截图，当晶体被筛选时，中央面板显示了从代表性晶体观察到的 X 射线衍射以高分辨率收集足够的图像，以获得三维结构测定所需的完整数据集。本视频中演示的克隆和蛋白质纯化策略产生了 14 个纯化的 PB、2 个样品，其中 9 个样品产生了适合衍射研究的晶体。内部 X 射线衍射数据集是使用理学超亮 FRE 加旋转阳极 X 射线发生器收集的，具有 QK α 辐射，配备有 ossec variax hf、HF 光学器件和 Saturn 944 plus CCD 探测器。

此处显示了聚合酶 PB 两个亚基的 X 射线衍射图像。对每个数据集进行了处理，并确定了 PB 两个亚基的总共四个结构。每个结构都经过同行评审并上传到蛋白质数据库供公众访问。

该图显示了晶体学不对称单元中分子的带状图。在四个 PB two 结构中，二级结构以彩虹图案着色，并带有相应的 PDB 代码。本表所示为本视频文章中描述的方法对流感 PB 两个靶标的结局分析。

用于基因到结构测定的多靶点平行处理流程分为五个步骤：克隆、溶解度、纯化、结晶和结构测定。我们的结构生物学产品线的产出不仅为基于结构的研究提供了基础，而且还为其他研究提供了信息，例如用于确认蛋白质功能的功能测定或通过 MAR 或 SPR 对新化合物进行生物物理筛选，以确定药物开发的新起点。这项技术以及随之发明的工具为结构生物学家检测多种基于发现的研究铺平了道路，包括基于结构的药物设计，这对人类健康和疾病产生了巨大影响。

看完这个视频，您应该对多靶标并行处理如何大大提高结构化测定的成功率有了很好的了解。不要忘记，在结构生物学实验室工作可能非常危险，在从事实验室活动时应始终采取适当的预防措施，例如使用 PPE。