Name: 碳水化合物转运基质结合蛋白 SP0092 的生化和结构表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 学习肺炎链球菌碳水化合物底物结合蛋白SP0092的生化与结构表征方法，通过荧光稳定性分析和SEC-MALS技术优化结晶条件，提高蛋白质晶体质量与结构解析成功率。

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我们感谢OPPF-UK在克隆方面提供的帮助，Gemma Harris在SEC-MALLS方面的支持，以及Diamond Light Source同步辐射光源I03和I04线站的科研人员。

注意：删除信号肽的编码序列通过标准的In-Fusion克隆方法插入pOPINF载体中；该天然蛋白在Escherichia coli BL21 Rosetta细胞中以His标签融合蛋白形式表达28,29。硒代甲硫氨酸标记的突变体根据生产商提供的标准方法进行表达30。重组SBP的纯化步骤如前所述31,32。
1. 生物化学表征
<ol>
	<li>热漂移实验
	<ol>
		<li>配制48种缓冲溶液，pH范围为4.0至9.5，NaCl浓度范围为0至0.5 M，并按照表133所述方法将每种缓冲液各40 µL分装至96孔板中。</li>
		<li>向每个孔中加入5 µL浓度为1–2 mg/mL的SBP溶液。</li>
		<li>向每个孔中加入5 µL 20倍稀释的&#160;蛋白质荧光染料（见材料表）。</li>
		<li>使用移液器混匀各孔溶液，用透明粘性封膜密封板子，并在室温下以112 × g离心2分钟。</li>
		<li>在实时定量PCR仪上运行实验：设置温度梯度程序，从4 °C升至99 °C，升温速率为3 °C/min，每0.5 °C采集一次荧光信号，每次停留10秒；激发波长为483 nm，发射波长为568 nm。</li>
		<li>分析每种缓冲条件下的荧光发射曲线，通过求导数的最小值确定熔解温度（Tm）。 
		注：该步骤可有效指示最有利于提高蛋白质稳定性的缓冲体系。根据具有最高Tm值的缓冲条件选择适宜的pH范围和盐浓度，并添加2.5%（v/v）甘油和0.5 mM三(2-羧乙基)膦（TCEP），以此确定后续步骤所用的缓冲液（SEC缓冲液）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>多角度激光散射（MALS）与分析型尺寸排阻色谱（SEC）
	<ol>
		<li>使用脱气并过滤的去离子水对预装胶过滤柱进行两倍柱体积的清洗（采用分子量宽范围的24 mL柱）。</li>
		<li>将色谱柱连接至光散射检测器，并用热漂移实验确定的SEC缓冲液平衡色谱柱。</li>
		<li>将100 µL浓度为5 mg/mL的纯化SBP样品注入已平衡的SEC色谱柱，并用一倍柱体积的SEC缓冲液进行洗脱。</li>
		<li>检查洗脱色谱图是否存在单峰或多峰，并利用分析软件查看散射数据，获得各组分的摩尔质量及多分散性指数。 
		注：对于每一个对应寡聚体物种的峰，建议检查其多分散性指数，该指数定义为按质量加权的摩尔质量与按分子数加权的摩尔质量之比（Mw/Mn）。当多分散性指数接近1时，表明该峰为单分散峰。 
		注：在明确所有寡聚体物种后，研究其对蛋白质浓度的依赖性十分有益，因为较高浓度可能促进更大寡聚体的形成。</li>
		<li>进行多次分析型SEC实验：将100 µL纯化的SBP样品以递增浓度（0.1–10 mg/mL）分别注入已平衡的凝胶过滤柱（采用分子量宽范围的5 mL柱），每次均用一倍柱体积的SEC缓冲液洗脱。</li>
		<li>检查洗脱色谱图中的峰数（单峰或多峰），并分析对应不同起始蛋白浓度曲线在280 nm处的吸光度强度。若不同峰的相对强度保持恒定，则表明寡聚体物种之间无相互转化；若在不同浓度下相对强度发生变化，则提示存在依赖于蛋白质浓度的不同寡聚体物种之间的相互转化。 
		注：此表征步骤对于确定最适合结晶的物种至关重要。实际上，在特定浓度下处于稳定寡聚状态且为单分散的物种更易于结晶。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 蛋白质制备与结晶
<ol>
	<li>制备型尺寸排阻色谱（SEC）
	<ol>
		<li>先用脱气过滤水冲洗一个柱体积，然后使用SEC缓冲液平衡制备型预装凝胶过滤柱（一种分子量范围较宽的120 mL柱）。</li>
		<li>将1–5 mL浓度为5–50 mg/mL的纯化SBP注入已平衡的凝胶过滤柱中，并以SEC缓冲液流过一个柱体积。</li>
		<li>以每管1 mL收集柱流出液。</li>
		<li>合并对应单一单分散峰的组分；将样品置于15 mL离心过滤管中，在1,500 g下离心浓缩，并测定浓度，直至达到目标浓度（SP0092通常为50–100 mg/mL）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>结晶
	<ol>
		<li>根据生产商提供的说明，使用预结晶测试（Pre-Crystallization Test）确定结晶实验的最佳浓度范围：
		<ol>
			<li>在24孔坐滴结晶板的不同储液池中，分别加入0.5–1.0 mL的四种结晶测试溶液。</li>
			<li>通过将1 µL蛋白溶液与1 µL储液混合制备结晶液滴，密封结晶板，并在室温下孵育不少于1小时（过夜孵育可获得更可靠的结果）。</li>
			<li>使用10x&#160;放大倍数的显微镜检查各浓度下的液滴质量。 
			注意：至少测试三种不同的蛋白浓度：（I）大多数液滴保持澄清，表明蛋白浓度过低，不利于结晶；（II）多数液滴中出现大量沉淀，表明浓度过高；（III）澄清液滴与沉淀（尤其是轻微沉淀）同时适度出现，表明所测试的浓度有利于结晶。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>准备96孔坐滴结晶板；在每个储液孔中加入100 µL不同的商用结晶溶液34,35,36,37。</li>
		<li>使用结晶机器人系统，在所有结晶液滴孔中加入100 nL先前确定浓度的蛋白样品（步骤1.1.6）。</li>
		<li>向相应的结晶液滴孔中加入100 nL不同的储液，与步骤2.2.3中加入的蛋白混合。密封结晶板以防止蒸发，并使结晶液滴与储液之间达到平衡。</li>
		<li>定期（初期每1–2天，后期每周）使用10x&#160;（至少）放大倍数的显微镜检查液滴，评估晶体的形成与生长情况。 
		注意：可使用自动化成像系统进行蛋白结晶液滴的观察与图像采集。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 晶体表征与X射线数据收集
<ol>
	<li>晶体挂载
	<ol>
		<li>通过向结晶条件溶液中加入25%（v/v）的甘油（终浓度），制备冷冻保护剂溶液（从而替换初始混合物中25%的水）38。</li>
		<li>将泡沫杜瓦瓶装满液氮，并将uni-puck的样品仓部分放入杜瓦瓶中，使其冷却至液氮温度。</li>
		<li>剪开并移除结晶板上晶体生长液滴区域的密封膜。</li>
		<li>在靠近目标液滴的盖玻片上放置1 µL冷冻保护剂溶液液滴。</li>
		<li>使用安装在磁性操作棒上的SPINE标准底座尼龙冷冻环，将选定的晶体从原始液滴转移至冷冻保护剂溶液液滴中39,40。</li>
		<li>迅速将晶体从冷冻保护剂液滴转移至液氮中，将冷冻环放入uni-puck样品架的第一个空位。</li>
		<li>重复上述操作（从剪开密封膜开始），直至所有目标晶体均被收集并储存于uni-puck样品架中。</li>
		<li>使用puck操作棒将uni-puck底座安装到uni-puck上，并在液氮条件下将puck运送至光束线。 
		警告：极低温度！</li>
		<li>使用冷冻钳和puck杜瓦装载工具，将uni-puck(s)装入光束线样品更换机器人杜瓦中。uni-puck样品架将从底座盖上脱离，使样品环架直立于样品机器人杜瓦内，暴露于液氮中，便于样品更换机器人取用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>晶体表征 
	注：收获的晶体可使用实验室X射线源或同步辐射（SR）X射线源进行衍射质量筛选。大分子晶体学（MX）光束线提供可调能量光源，可用于利用反常衍射进行结构解析。以下部分提出了一系列与Diamond Light Source MX光束线实验能力相匹配的操作指南，但这些指南也可适用于全球其他同步辐射装置的MX光束线。
	<ol>
		<li>第一步，建议确认或鉴定晶体中的反常散射原子。可通过测量晶体的X射线荧光光谱便捷实现。首先确保光束线的X射线能量设置足够高，以激发大分子晶体中通常存在的所有元素（14 keV或更高）。</li>
		<li>使用光束线控制软件选择由样品更换机器人挂载的样品；样品环&#160;将自动居中于X射线束中，用户可使用光束线控制软件手动确认&#160;晶体居中。</li>
		<li>使用光束线控制软件记录X射线荧光光谱：用户选择曝光时间并启动测量（荧光/荧光光谱设置 → 运行，图2A）。光束线控制软件将自动定位X射线荧光探测器，并确定在荧光探测器上获得可读信号所需的最小入射X射线通量。采集的光谱随后通过自动化方式分析，发射峰拟合至天然存在的生物元素。这些分析程序集成于我们公司及欧洲各地同步辐射装置所使用的光束线控制软件图形用户界面（GUI）——GDA（www.opengda.org）中41,42。</li>
		<li>若鉴定出可用于反常衍射实验的合适元素，则进行X射线吸收边能量扫描，以确定从晶体收集反常衍射数据的最佳波长：在光束线控制软件中选择相应元素并启动扫描（荧光/荧光扫描设置 → 元素名称 → 运行，图2B）。 
		注：对于单波长反常衍射实验，使用吸收边峰值以最大化反常散射效应。多波长反常衍射实验的操作考虑已有详细描述43。</li>
		<li>为确定晶体的晶胞参数、对称性和衍射极限，采用摆动法测量三个间隔45°的X射线衍射图样（数据采集/筛选 → 当前运行，图2C）。光束线控制软件允许用户选择摆动角度和曝光时间，并设置X射线束的透射百分比。标准晶体筛选推荐使用0.5°摆动角、0.5 s曝光时间和5% X射线束透射率。所测衍射图像由EDNA流程自动分析，并返回一套完整的数据采集策略22。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>X射线数据采集 
	注：用户可选择标准摆动模式或反向光束模式进行数据采集。反向光束模式可使Friedel对在相近的时间和X射线剂量下记录，且吸收行为大致相同，从而更准确地测量反常差异。当预期反常差异较小和/或样品在反常衍射实验中对辐射敏感时，该模式尤为有用。关于最佳数据采集策略的综合评述已有广泛报道22,23,44,45,46,47。
	<ol>
		<li>使用光束线控制软件，导入策略程序建议的数据采集参数，包括： 
		i. ω旋转轴的起始位置 
		ii. 每张衍射图像的ω轴摆动宽度 
		iii. 每张衍射图像的曝光时间 
		iv. 完整数据集所需的图像数量（间接定义整个数据采集过程的总ω轴旋转角度） 
		v. X射线束的衰减百分比，以避免过度曝光和辐射损伤 
		注：在本机构，用于数据采集的自动化数据处理软件流程已成熟建立：（i）衍射数据通过xia2流程进行约化（指标化、积分和标度），生成供用户进行相位确定及结构解析/精修的反射mtz文件48。（ii）当数据分析中检测到显著的反常信号时，首个快速自动化结构解析流程（fast_ep）将使用SHELX尝试通过实验相位法解析重原子子结构，在可行情况下提供带相位的电子密度图。第二个更全面的结构解析流程将自动使用独立软件套件尝试解析并构建结构49,50,51,52；若成功，用户将获得初始模型和电子密度图。这为用户使用选定的晶体学软件套件完成模型精修和验证提供了基础。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文描述并验证了一种用于碳水化合物结合蛋白（SBP）生化与结构表征的整合方案，特别侧重于S. pneumoniae来源的蛋白质。然而，该方案也可作为分析来自其他生物体的SBP乃至其他无关可溶性蛋白质的标准流程。
本实验方案的第一部分旨在提供有关蛋白质稳定性和四级结构的生化信息，这些信息可用于结晶用蛋白质样品的制备。在热漂移检测部分，我们仅描述了pH值和NaCl浓度的变化，以保持该方法的通用性。尽管如此，其他多种缓冲条件也可采用类似方式测试，例如加入用作稳定添加剂的任何化学化合物：特别是与特定SBP结合的实际配体，通常可显著提高Tm值数摄氏度31。在某些情况下，由于信号较低或荧光背景较高，导致变性曲线不够清晰，这通常由蛋白质聚集或部分去折叠引起。为避免此问题，可进行蛋白质与染料的滴定实验，以优化不清晰的变性曲线。若仍未见改善，建议筛选多种可能增强蛋白质稳定性的添加剂，已有文献报道过相应的合适筛选方法54。
通常情况下，大多数SBP在其天然环境中以单体形式存在，但如本文所示，在结晶实验所用的较高浓度下可能发生多聚化，因此MALS和SEC提供的寡聚行为表征对于评估最适合结晶的稳定单分散寡聚状态至关重要。然而，很难预测结晶条件中所含不同化学物质对蛋白质寡聚行为的影响。如果SEC和MALS检测显示蛋白质样品存在严重聚集，我们建议采取以下措施以降低此类情况的发生概率：使用新鲜的蛋白质样品（未经冻融），并扩展热迁移实验中的稳定性分析，必要时可测试潜在的添加剂和温和型去垢剂，以尽量减少聚集。本文介绍了利用高通量稀疏矩阵商业化结晶筛选方法进行结晶的基本指南，以保持本实验方案的通用性。然而，获得高分辨率X射线衍射蛋白质晶体可能需要进行多轮迭代优化，针对沉淀剂浓度、pH值、化学添加剂的添加、不同温度以及其他影响晶体液滴与储液之间平衡动力学的因素，精细调整结晶条件16,17。
本实验方案的第二部分描述了对蛋白质晶体的表征，以确定X射线衍射数据收集的最佳策略，特别关注用于SAD相位解析的反常散射数据的获取。尽管底物结合蛋白（SBPs）具有相似的整体结构（已有大量已解析的三维结构可作为初始模型使用），但由于其二级结构元件的差异以及蛋白质本身固有的柔性，采用分子置换法进行相位解析并不总是可行。因此，我们推荐使用SAD方法，并强调这些蛋白质可能已天然结合了金属离子，或在结晶缓冲液条件下非特异性地结合了金属离子，从而在我们的通用实验流程中可常规利用这些金属作为反常散射元素。
综上所述，本方案定义了一套标准化的引导式操作流程，可用于详细描述底物结合蛋白（SBPs）的生物化学与结构特征，从而提高结构解析的成功率，并普遍加快SBPs的结构表征进程。

S. pneumoniae（肺炎链球菌）是一种革兰氏阳性细菌，通常无症状地定植于人类呼吸道的上呼吸道，但可迁移至原本无菌的部位，引发中耳炎、肺炎、败血症、脓毒血症和脑膜炎1,2。此外，肺炎链球菌感染是社区获得性肺炎的主要病因，给全球带来了显著的临床和经济负担3,4。目前，耐抗生素的 S. pneumoniae 菌株已在全球范围内传播；尽管七价和十三价肺炎链球菌蛋白结合疫苗的使用在一定程度上降低了抗菌药物耐药的发生率，但疫苗使用后出现了非疫苗覆盖的替代菌株，这促使人们更加迫切地需要开展针对肺炎链球菌病新疗法的研究5,6,7,8。
肺炎链球菌依赖于从宿主获取的糖类作为碳源9,10；事实上，它将其30%的转运系统用于运输32种不同的碳水化合物11,12,13。这些转运蛋白至少包括八种ABC转运蛋白13。在ABC转运蛋白中，细胞外的底物结合蛋白（SBP）在决定配体特异性以及将配体递送至整合膜转运蛋白以实现细胞摄取方面起着关键作用。由于SBP是位于细胞表面的蛋白质，并且在细胞生命活动中具有重要功能，因此它们是设计新型疫苗和抗菌药物的有效靶点。
靶蛋白的表征及其结构特征（如配体结合口袋和结构域间柔性）的详细描述，为基于结构的药物设计提供了有力工具14,15。X射线晶体学是实现接近原子分辨率蛋白质结构表征的首选方法，但结晶过程具有不可预测性，耗时且并非总能成功。系统性的方法已提高了结晶成功率，其中样品质量和稳定性是关键因素。蛋白质的化学性质及样品制备方法会影响结晶的成功率，这些因素可通过生化表征进行评估和指导16,17。
基于结构设计的另一个复杂问题是晶体学相位问题，必须加以解决。随着越来越多的蛋白质结构被解析，许多结构可通过分子置换法确定，该方法需要一个同源结构18。由于结合蛋白（SBPs）具有灵活的结构域，分子置换也可能具有挑战性19。如果缺乏与目标蛋白足够相似的结构模型，则可采用多种技术获取实验相位信息20。其中，单波长反常散射（SAD）方法已成为主要技术，并被广泛用于解决相位问题21。随着硬件和软件的进步，以及数据收集策略的优化，SAD方法进一步发展，能够检测并利用微弱的反常信号进行相位确定22,23,24。此外，直接法在解析大分子结构方面的进展也日益显著，过去该方法需要原子分辨率的衍射数据，而现在可通过结合例如程序ARCIMOLDO中实现的立体化学知识，实现更高效的应用25。Taylor对晶体学中解决相位问题的各种方法进行了有益的综述26。
本文介绍了一种系统化的实验方案，用于表征肺炎链球菌（S. pneumoniae）中碳水化合物转运结合蛋白SP0092的性质，该方案整合了生物化学与结构生物学技术（图1）。这一逐步操作的流程为提高结合蛋白（SBP）结构研究成功率提供了一个实用的范例，而SBP广泛存在于所有生命域中。特别地，该方案强调通过一种快速且有效的方法，在溶液中鉴定蛋白质最稳定的寡聚状态，并据此确定最适合用于晶体生长实验的目标蛋白形式。尽管蛋白质数据库（Protein Data Bank）中已报道了超过500个SBP的结构27，但由于SBP通常由两个通过铰链区连接的α/β结构域组成，具有内在的柔性，因此采用分子置换法进行相位确定往往面临挑战19。为此，本方案的第二部分描述了如何利用SBP中常见的结合金属离子，通过单波长反常衍射（SAD）方法进行相位解析，同时还包括硒代甲硫氨酸的掺入以及利用硒（Se）进行SAD相位确定的技术细节。

<table><tbody><tr><td>硒代甲硫氨酸完全培养基</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD12-500</td><td>基于添加了葡萄糖、维生素和氨基酸（除L-甲硫氨酸外）的合成M9最小培养基。其他公司也提供类似的等效产品。</td></tr><tr><td>MicroAmp 光学96孔板</td><td>Applied Biosystems</td><td>4306737</td><td>Applied Biosystems MicroAmp 光学96孔反应板带条形码，专为实现无与伦比的温度准确性和均匀性而优化，适用于快速高效的PCR扩增。该板由单一刚性聚丙烯材料制成，采用96孔格式，适用于 Applied Biosystems&amp;reg; 96孔实时PCR系统和热循环仪。</td></tr><tr><td>SYPRO Orange</td><td>Molecular Probes</td><td>S6651</td><td>SYPRO Orange 蛋白凝胶染料是一种高灵敏度、即用型荧光染料，用于一维凝胶中的蛋白质染色。这是一种广泛适用且已被广泛验证的蛋白质染料，可特异性结合疏水区域。</td></tr><tr><td>MicroAmp 光学粘性封膜</td><td>Applied Biosystems</td><td>4311971</td><td>Applied Biosystems MicroAmp 光学粘性封膜在覆盖微孔板时可减少孔间污染和样品蒸发。由于背景信号低，特别适用于光学检测。</td></tr><tr><td>7500 Fast 实时PCR系统</td><td>Applied Biosystems</td><td>4362143</td><td>Applied Biosystems 7500 Fast 实时PCR系统支持标准96孔板格式的高速热循环，显著缩短定量实时PCR应用的运行时间，约30分钟即可获得结果。可通过现场服务安装升级套件，将标准7500实时PCR系统升级为快速配置。也可使用其他RT-PCR仪器。但旧版数据分析软件的数据导出较为困难。</td></tr><tr><td>Superdex 200 increase 10/300 GL色谱柱</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td>Superdex 200 Increase 10/300 GL是一种通用型预装柱，适用于小规模（毫克级）制备纯化以及分子量在10,000至600,000之间的蛋白质（如抗体）的表征与分析。其分离效果优异，非常适合高分辨率生物物理技术。</td></tr><tr><td>DAWN HELEOS II</td><td>Wyatt</td><td></td><td>DAWN HELEOS II是用于溶液中大分子和纳米颗粒摩尔质量与尺寸绝对表征的顶级多角度静态光散射（MALS）检测器。DAWN具有最高灵敏度、最宽的分子量、尺寸和浓度检测范围，以及最丰富的配置和可选模块组合，以增强其功能。除Wyatt以外其他公司的MALS检测系统尚未测试，因此无法提供额外反馈。</td></tr><tr><td>Superdex 200 5/150 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>28906561</td><td>Superdex 200为预装尺寸排阻色谱柱，适用于生物分子的高分辨率小规模制备和分析分离。Superdex 200的分离范围适用于分子量在10,000至600,000之间的分子。其峰分离效果不如&quot;increase&quot;版本理想，但此型号适用于日常常规使用。</td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td>HiLoad 16/600 Superdex 200制备级为预装XK柱，专为高分辨率制备型凝胶过滤色谱设计。</td></tr><tr><td>24孔&quot;大孔&quot;坐滴结晶板</td><td>MiTeGen</td><td>XQ-P-24S-A</td><td>24孔&quot;大孔&quot;结晶板主要用于通过坐滴气相扩散法进行蛋白质结晶筛选及结晶条件优化。其储液池和样品容器体积较大，有利于手动操作和大尺寸蛋白质晶体的生长。此外，其平坦表面易于用透明胶带或盖玻片密封。</td></tr><tr><td>PCT 前结晶测试</td><td>Hampton</td><td>HR2-140</td><td>PCT 前结晶测试用于确定适合结晶筛选的蛋白质浓度。</td></tr><tr><td>96孔CrystalQuick板</td><td>Greiner bio-one</td><td>6098xx</td><td>方形孔板每储液池含三个结晶孔，每块板可测试288个样品。通常仅用于初步筛选，因其方形边缘使晶体捞取较为困难。</td></tr><tr><td>Uni-Puck</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD7-601</td><td>通用V1-Puck（Uni-puck）是一种样品针存储和运输容器，适用于全球大多数自动化样品装载系统，包括ACTOR、SAM和CATS系统等（Diamond、Soleil、SPring-8、Photon Factory、CLSI及美国各地同步辐射设施）。</td></tr><tr><td>标准泡沫杜瓦瓶</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD7-35</td><td>直径5.7&quot;，深度2.8&quot;，容量800 mL。</td></tr><tr><td>已安装的CryoLoop - 20微米</td><td>Hampton</td><td>HR4-955</td><td>带有20微米直径尼龙环的已安装CryoLoop。这些尼龙环固定在中空不锈钢MicroTubes&amp;trade;上，用于在低温晶体学操作和X射线数据收集过程中安装、冷冻并固定晶体。存在不同尺寸，长度可调节，是用途广泛的工具。</td></tr><tr><td>CryoWand</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD7-411</td><td></td></tr><tr><td>样品托盘杜瓦瓶装载工具</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD7-607</td><td>该工具用于分离uni-puck，以便将其装入机器人杜瓦瓶。由两部分组成：聚四氟乙烯管部分和金属杆部分。</td></tr></tbody></table>

sp0092 碳水化合物转运底物结合蛋白的生化与结构表征

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

为了遏制多重耐药菌株的迅速增加，开发针对Streptococcus pneumoniae（肺炎链球菌）的新抗菌药物和疫苗十分必要。由于碳水化合物底物结合蛋白（SBPs）位于胞外，且碳水化合物的摄入在肺炎链球菌代谢中具有核心作用，因此这类蛋白是开发基于蛋白质的疫苗和新型抗菌药物的可行靶点。本文描述了一套系统整合的实验方案，用于对SP0092蛋白进行全面表征，该方案也可推广至肺炎链球菌及其他细菌中的其他碳水化合物SBPs研究，有助于基于结构设计针对此类蛋白的抑制剂。本论文第一部分介绍了通过热漂移实验、多角度光散射（MALS）和尺寸排阻色谱（SEC）进行生化分析的实验流程，以优化用于晶体筛选样品的稳定性和均一性，从而提高结晶成功的概率。第二部分则描述了利用可调波长的同步辐射反常衍射光束线对SBP晶体进行表征，以及收集可用于解析结晶蛋白结构的数据的实验方法。

迄今为止，该整合方案已成功应用于肺炎链球菌中六个碳水化合物结合蛋白靶标中的四个（其中两个结构已发表，两个未发表）的分析32,53。在本节中，我们以SP0092的生化与结构表征作为代表性结果，为一般性SBP的结构研究提供指导。
在按照先前所述方法表达并纯化SBP SP0092后32，通过热迁移实验分析了纯化蛋白的缓冲液稳定性：SP0092在pH 6.5以及0–0.2 M NaCl浓度范围内表现出更高的Tm值（图3A）。基于此结果，后续实验所用缓冲液确定为：0.02 M MES pH 6.5、0.2 M NaCl、2.5% (v/v) 甘油、0.5 mM TCEP。通过MALS联用SEC测定了SP0092不同寡聚状态的绝对摩尔质量，测得分子量分别为187.2、140.8、97.0和49.4 kDa，分别对应四聚体、三聚体、二聚体和单体形式（图3B）。在不同蛋白浓度下对SEC洗脱曲线的分析表明，寡聚化过程受蛋白浓度升高所驱动，提示较大寡聚体在高于常规结晶所用浓度时更为稳定。事实上，将纯化的较大寡聚体形式用于结晶筛选，成功获得了蛋白晶体，而单体形式则未能形成晶体。
通过X射线衍射对从SP0092的天然形式及硒代甲硫氨酸标记形式中获得的优化晶体进行了表征。对这些晶体进行X射线荧光测量，结果显示两种晶体中均存在与蛋白质结合的锌（Zn）发射峰，而硒（Se）信号仅在硒代甲硫氨酸标记的晶体中被检测到，符合预期。随后，在硒和锌的吸收边处进行了X射线吸收扫描，从而提供了直接的实验数据，用于调节入射X射线波长至晶体中锌或硒各自的X射线吸收边，以最大化从所得数据中获取的反常散射信号（图4A-B）。
在低透射条件下测量了三个衍射图样后，采用EDNA建议的数据采集策略获得了一套完整的反常散射数据集（图4C）。存在的反常散射信号会触发线站上的自动化相位解析流程，以确定亚结构，并基于由此获得的初始实验相位生成初始电子密度图和模型，随后可对这些结果进行精修和验证（图4D）。
总之，该技术的潜在风险主要集中在晶体的可获得性与质量。优化缓冲条件以提高蛋白质稳定性，以及在溶液中存在多种寡聚体形式时选择最合适的寡聚态，可降低结晶阶段失败的风险。利用早期阶段发现的结合金属离子，可加快结构解析速度，并在分子置换法失败时避免不必要的硒代甲硫氨酸标记蛋白质的制备。
<img alt="生化与结构表征示意图；热迁移实验、SEC-MALS、X射线分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 碳水化合物结合蛋白生化与结构表征的工作流程示意图。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="荧光光谱仪装置示意图，显示光谱扫描和数据采集的控制界面。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. GDA中的晶体表征。（A）GDA光束线控制软件中X射线荧光控制选项卡的截图。（B）GDA中X射线能量边扫描控制选项卡的截图。（C）GDA中数据采集晶体筛选选项卡的截图。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="热荧光稳定性三维图与SEC色谱图；蛋白质-配体结合分析，pH效应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. SP009239-491的生化表征。（A）三维曲面图，显示SP009239-491的熔解温度随缓冲液pH值和NaCl浓度变化的关系。（B）SP009239-491的尺寸排阻色谱（SEC）与多角度激光散射（MALS）结果。280 nm处的吸光度以蓝色表示。不同寡聚状态的摩尔质量以红色表示。图（B）经修改自32。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="SP0092蛋白结构的X射线荧光光谱与晶体学数据，含Zn、Se原子标记。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4. SP009239-491的结构表征。（A）和（B）SP009239-491晶体在Zn和Se吸收边的X射线吸收能量扫描。含Zn和Se晶体测得的荧光信号分别以蓝色和青色显示，计算得到的反常散射分量f'和f"分别以绿色和红色表示。（C）SP009239-491晶体收集到的X射线衍射图样示例。（D）SP009239-491二聚体结构的卡通模型。一个原体以白色表示，另一个原体中残基39–366为品红色、残基367–491为紫色；反常散射原子Zn和Se分别以蓝色和青色球体表示。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0.1 M 柠檬酸 pH 4.0</td>
			<td>0.1 M 柠檬酸 pH 4.5</td>
			<td>0.1 M 磷酸盐 pH 5.0</td>
			<td>0.1 M 柠檬酸盐 pH 5.5</td>
			<td>0.1 M Bis-tris pH 6</td>
			<td>0.1 M ADA pH 6.5</td>
			<td>0.1 M MOPS pH 7</td>
			<td>0.1 M HEPES pH 7.5</td>
			<td>0.1 M 咪唑 pH 8.0</td>
			<td>0.1 M Tris pH 8.5</td>
			<td>0.1 M CHES pH 9</td>
			<td>0.1 M CHES pH 9.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0 M</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.1 M</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.2 M</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.5 M</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 热 shift 测定缓冲液组成。

本文介绍了一种简化方案，用于对来自肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的碳水化合物底物结合蛋白进行系统的生化与结构表征。

SP0092 碳水化合物转运底物结合蛋白的生化与结构表征

开发针对肺炎链球菌（肺炎球菌）的新抗菌药物和疫苗，对于遏制多重耐药性的迅速上升至关重要……

本实验的总体目标是对来自肺炎链球菌的一种碳水化合物底物结合蛋白进行生化与结构表征。该方法有助于为底物结合蛋白的教学研究提供关键数据，例如缓冲液稳定性谱、寡聚状态以及原子分辨率结构的确定。本方法的优势在于能够以可靠且直接的方式提供数据，从而提高底物结合蛋白结晶及其结构解析的成功率。首先，配制48种缓冲溶液，pH范围为4.0至9.5，氯化钠浓度范围为0至0.5摩尔。将每种溶液各40微升加入96孔板中。获取所选底物结合蛋白的纯化溶液。向每个孔中加入5 µL SBP溶液，使其浓度达到1至2毫克/毫升。然后向每个孔中加入5 µL 20倍浓缩的荧光染料。通过反复吹打混匀溶液。用透明粘性封板膜密封反应板。在室温下以112 ×g离心2分钟。设置实时PCR仪以每分钟3 °C的速率从4 °C升至99 °C，每步停留10秒。将系统设置为每0.5°C采集一次荧光读数。设置荧光滤光片参数，并指定样品。进行实验并确定具有最高熔解温度的缓冲条件。接下来，配制含有2.5%（体积分数）甘油和0.5毫摩尔浓度TCEP、且pH值与氯化钠浓度已选定的缓冲液。使用分析型尺寸排阻色谱结合多角度光散射对纯化的SBP进行表征。确定最适合结晶的最稳定组分，并利用制备型尺寸排阻色谱（SEC）获得这些组分的纯化馏分。进行结晶前测试，以确定用于结晶的最佳蛋白质浓度。使用结晶机器人系统将所需的商业化结晶溶液分配至光学96孔坐滴板的溶液储液池中。然后使用该系统将100纳升蛋白溶液分别加入每个结晶滴孔中。从储液池孔中转移100纳升每种结晶溶液至对应的滴孔中。用光学粘性密封膜密封板。使用显微镜或自动成像系统，在两周内每隔一至两天评估一次晶体的形成与生长情况，之后每周评估一次。当形成足够大且形状良好的晶体后，配制一批含有额外25%（体积比）甘油的结晶溶液，作为冷冻保护剂。接着，用液氮填充泡沫杜瓦瓶。将一个Unipuck样品容器浸入液氮中，使其冷却。然后在含有目标晶体的液滴上方切开薄膜。将0.5 µL的冷冻保护剂滴加到盖玻片上靠近液滴的位置，或在条件相同时，滴入同一条件下的空液滴腔中。将安装在SPINE标准底座上的载晶环连接到磁性金属棒上。使用载晶环将目标晶体转移至冷冻保护剂液滴中。随后，使用载晶环将晶体从冷冻保护剂转移至浸没式单管样品盒的第一个空位中。重复此过程以收集更多晶体。当所有目标晶体均已被装入样品腔后，使用样品托盘棒将单托盘底板放置在样品腔上。将单托盘置于液氮中运输至衍射线站。使用冷冻镊子和样品托盘装载工具将Unipuck载入光束线样品交换杜瓦瓶，并拆卸样品封装。随后在光束线软件中选择样品，以加载并自动将样品置于x射线束中心。采集x射线荧光谱，鉴定可用于反常衍射实验的元素。通过进行X射线吸收边能量扫描，确定收集反常衍射数据的最佳波长。随后，在标准振荡模式下以45度间隔采集三张X射线衍射图谱，以自动确定晶体的晶胞参数、对称性及衍射极限。将推荐的数据采集参数导入光束线软件，并根据需要运行单波长或多波长反常衍射实验。通过评估底物结合蛋白SP0092在不同盐缓冲液中的稳定性，以确定最佳缓冲溶液。结果显示，在pH为6.5、氯化钠浓度介于0至0.2摩尔之间的缓冲液中，蛋白的熔解温度最高。因此，选择pH为6.5、氯化钠浓度为0.2摩尔的缓冲液用于后续实验。通过SEC-MALS鉴定并分离了SP0092的不同寡聚化状态。在不同蛋白质浓度下对SEC谱图的分析表明，蛋白质浓度升高会触发寡聚化，提示在高浓度下较大的寡聚体更为稳定。与此一致的是，在结晶实验中，大寡聚体能够形成晶体，而单体则不能。对天然型及硒代甲硫氨酸标记的SP0092晶体进行X射线荧光分析，结果表明两种形式的蛋白质均结合了锌。通过将入射X射线波长调节至锌或硒的X射线吸收边，使反常散射信号达到最大化。随后获得了完整的反常散射数据集，在反常信号存在的条件下，自动分析程序生成了蛋白质结构的初始电子密度图。随后，对这些初始图谱中构建的模型进行优化和验证，以获得最终模型。观看本视频后，您应能够充分理解如何完成对底物结合蛋白或任何潜在蛋白质靶标的全面结构表征。该技术的应用前景涵盖分枝杆菌病新疗法的开发，因为它为此类蛋白质的基于结构的抑制剂设计提供了基础性见解。这些方法也可应用于来自其他生物体的底物结合蛋白，并且可能适用于任何类型的蛋白质。

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自动化模块化高通量胞外多糖筛选平台结合高灵敏度碳水化合物指纹图谱分析

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利用分裂荧光素酶互补实验展示高尔基体驻留型III型膜蛋白形成的异源复合物

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