分析 小肠结肠炎耶尔森菌 利用β-内酰胺酶效应子融合蛋白将效应子转运至宿主细胞

以下实验的总体目标是通过耶尔森菌III型分泌系统（vernier type three secretion system）来检测效应蛋白向宿主细胞内的转位。该目标通过将HeLa细胞与表达效应蛋白TEM-1 β-内酰胺酶融合蛋白的耶尔森菌突变株共同孵育来实现，从而允许效应蛋白融合物转位进入HEp-2细胞。第二步，将感染后的HEp-2细胞加载一种细胞通透性FRET报告化合物，该化合物被细胞内的酯酶加工转化为带电荷且具有荧光的CCF4，从而被滞留在细胞内。

随后，由转位的β-内酰胺酶对CCF四进行切割，导致fre结构破坏，该过程通过激光扫描显微镜记录，以分析供体与受体的荧光强度。结果显示，根据供体荧光上升动力学的不同，转位的效应蛋白TEM-1与β-内酰胺酶融合蛋白的量也存在差异。该技术相较于现有方法的一个主要优势在于，CCF四化合物在细胞间的加工过程为转位的测量提供了一种高特异性和高灵敏度的工具。

该方法有助于回答细菌致病性研究领域中的关键问题，例如在细菌与宿主细胞相互作用过程中，易位过程是如何被精细调控的。在感染前一天，分别接种三个含有三毫升 LB 培养基及所需抗生素的小瓶，每个小瓶接种一株经转化的耶尔森肠炎杆菌（Yersinia enterocolitica）单菌落，菌落制备方法参见随附文本方案。同时，在感染前一天准备含 HeLa 细胞的培养板：将 15,000 个细胞接种于 200 微升培养基中，加入 96 孔板的 9 个孔内，于感染当天在 37 摄氏度、5% CO2 培养箱中孵育细胞。

将2毫升过夜培养物接种到40毫升不含抗生素的新鲜LB培养基中。在37摄氏度、180 RPM的摇床中培养细菌90分钟。90分钟后将诱导三型分泌系统的表达，随后将培养物转移至新的离心管中，并置于冰上保存。

从此步骤开始，将菌液在 5,000 G 和 4 °C 条件下离心 10 分钟，使细菌沉淀。接着，将沉淀重悬于 2 至 3 毫升预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中，调整细菌悬液浓度至每毫升含 8 亿个菌落形成单位，并将菌液置于冰上保存。

然后测定每种培养物对应的光密度。将每种菌株的细菌悬液各3.5微升加入已准备好的96孔板的不同孔中，轻轻吹吸混匀两次，使菌液与培养基充分混合，让细菌以每细胞约100个细菌的感染复数沉降到细胞上。

以30分钟为间隔开始感染，在37摄氏度、5% CO2培养箱中继续培养细胞。每次感染后，在首次感染90分钟时，小心吸除培养基，注意不要移除任何HeLa细胞。随后加入50微升含20微克/毫升氯霉素和2.5毫摩尔普尼酸的PBS溶液。

这将停止效应因子的表达并减少CCF4的外排。进行显微镜观察前，使用1毫升注射器将浸油介质铺展至孔板底部，确保全程浸没，避免浸油介质中残留气泡。

然后将96孔板转移至显微镜载物台上，定位每个孔中适合后续分析的区域。此步骤需在10分钟内完成。随后向每个孔中加入70 µL CF 4:00 AM上样溶液。

将培养板在室温下孵育5分钟。接着，吸去上样溶液，加入含有20微克/毫升氯霉素和2.5毫摩尔普尼酸的100微升PBS。然后迅速开始显微镜观察。

安装一个20倍放大倍数的高数值孔径浸油物镜，将检测器针孔打开至2.5艾里单位，并将96孔板转移至共聚焦激光扫描显微镜载物台上。接下来，选择高灵敏度的砷化镓磷酸盐检测器，并同时激活供体和受体通道。采用8位深度、三重帧平均，并使用405纳米半导体激光器的10%功率进行激发。

为确保准确的定量分析，将两个通道的探测器增益设置为相同值，并避免出现任何饱和像素。接下来，打开透射光，使用经过校准的自动载物台重新检查每个孔的代表性视野，并根据需要调整并重新保存位置。最后，将时间间隔设为两分钟，持续时间设为两小时，开始采集图像。

完成图像采集后，将数据集导入支持像素矩阵算术运算的软件中。首先点击菜单，然后进入图像处理，选择基线扣除，使用相同的偏移量对两个通道进行背景扣除。随后分别选择每个通道并输入基线值。

使用预先确定的校正系数，校正供体通道（通道一）对受体通道（通道二）的串色，为此创建一个新的通道即通道二′。点击菜单，然后依次选择图像处理、通道算术运算，输入通道二的绝对值减去0.33倍通道一的数值。随后删除通道二，确保经过串色校正后的受体通道作为新的通道二保留下来。

然后创建一个新通道，使用此处所示的操作来确定相对FRET系数。接下来，返回通道算术菜单，输入“通道二除以通道一加通道二”，以正确显示FRET通道。在8位图像中，创建第四个通道（通道四），其值等于255乘以通道三。

通过进入图像属性菜单更改通道颜色，选择第四通道，然后选择映射颜色，接着选择颜色表文件，并选择 jet。接下来，对第三和第四通道应用 3×3 中值滤波器。这将通过进入图像处理菜单并选择平滑来降低图像中的噪声。

随后进行中值滤波，选择两个通道并应用大小为三乘三乘一的滤波器，以定量分析细胞信号。在第四通道中，通过选择“surpass view”并点击图标来检测细胞。添加新的表面。

在表面窗口中定义检测算法参数，并勾选两个复选框。仅对感兴趣区域进行分割，并处理整幅图像。最后，通过编辑其尺寸来定义感兴趣区域。

选择第四通道作为源通道，并通过进入阈值菜单并选择背景减除来设置阈值。将直径设置为10微米，最低强度阈值手动设为0，最高阈值设为最大强度。按面积过滤结构，并将最小值设置为187平方微米。

然后完成表面检测。最后，提取通道一中供体荧光强度和通道三中相对FRET系数在细胞实体内的平均值及其标准偏差。为了展示该方法对效应分子向靶细胞转位进行定量分析的能力，利用供体荧光和相对FRET系数对两种具有不同转位动力学的耶尔森菌株进行了研究。

野生型感染细胞的荧光强度随时间逐渐增加。正如预期，荧光强度的最大斜率与感染时间呈正相关，表明可根据以往研究区分不同浓度的翻译产物β-内酰胺酶。与野生型菌株相比，感染鼠疫耶尔森菌YOPE缺失突变体的细胞表现出更快的荧光强度增加速度。

有趣的是，与感染60分钟相比，将感染时间延长至90分钟并未进一步加快供体荧光的上升。在进行该操作时，需要注意CCR four化合物的处理在其加入后立即开始，因此必须及时启动图像采集。