分析小肠结肠炎耶尔森菌效应易位到宿主细胞中使用β-内酰胺酶效应融合体

以下实验的总体目标是测量通过鼠尾草 3 型分泌系统将效应蛋白转位到宿主细胞中。这是通过将 heela 细胞与表达效应 TEM one β 内酰胺酶融合的耶尔森突变体一起孵育来实现的，以允许效应融合转移到 HELOC 细胞中。作为第二步，受感染的 HELOC 细胞加载细胞通透性 FRET 报告化合物，该化合物由细胞雌激素加工为荧光 CCF 4 中带电的化合物，从而被困在细胞内。

接下来，反式定位的 β-内酰胺酶切割 CCF 4 导致 fre 的破坏，激光扫描显微镜记录下来，以分析供体和受体的荧光强度。结果显示，基于供体荧光上升的不同动力学，不同数量的反式定位效应器 TEM one β 内酰胺酶融合。与现有方法相比，该技术的主要优势之一是 CCF 四种化合物的细胞间加工为测量易位提供了高度特异性和灵敏的工具。

该方法可以帮助回答细菌发病机制领域的关键问题，例如在细菌和宿主细胞相互作用期间如何微调易位 感染前 一天.接种三个单独的小瓶，其中含有 3 毫升 LB 培养基和所需的抗生素，并接种来自每种转化的小肠结肠炎耶尔菌株的一个菌落，如随附文本方案中所述。此外，在感染前一天准备含有 heela 细胞的板，将 15， 000 个细胞接种在 200 微升培养基中，放入 96 孔板的 9 个孔中，在感染当天在 5% CO 2 培养箱中于 37 摄氏度孵育细胞。

将 2 mL 过夜培养物接种到 40 mL不含抗生素的新鲜 lb 培养基中。将细菌在 37 摄氏度下以 180 RPM 的转速在摇床中孵育 90 分钟。这将在 90 分钟后诱导 3 型分泌系统的表达，将培养物转移到新管中，并将培养物保持在冰上。

从这时起。将培养物在 5， 000 G 和 4 摄氏度下离心 10 分钟，以沉淀细菌。接下来，将沉淀重新悬浮在 2 至 3 毫升冰冷的 PBS 中，将细菌悬浮液稀释至每毫升 8 亿个菌落形成单位的浓度，然后将培养物置于冰上。

然后确定每种培养物的相应光密度。将来自每个菌株的 3.5 微升细菌悬浮液添加到制备 96 的不同孔中。通过轻轻移液两次培养基进行孔板和混合，让细菌在每个细胞约 100 个细菌的感染点上沉淀到细胞上。

每隔 30 分钟开始感染，并将细胞保存在 37 摄氏度的 5% CO2 室中，以执行一个时间进程。每次感染后，即第一次感染后 90 分钟，小心吸出培养基，不要去除任何 hela 细胞。然后加入 50 微升 PBS，每毫升含 20 微克氯霉素和 2.5 毫摩尔普尼克。

这将停止效应器的表达并减少 CCF 4 的导出。为了准备显微镜检查，请使用 1 毫升注射器将浸没介质涂抹到孔底部，以确保连续浸入。避免在浸没介质中捕获任何气泡。

然后将 96 孔板转移到显微镜载物台上，并在每个载物台上找到合适的点以供以后分析。好吧，请在 10 分钟内完成此步骤。然后向每个中加入 70 微升 CF 4：00 AM 加载溶液。

将板在室温下孵育 5 分钟。接下来，吸出上样溶液并加入 100 微升 PBS，其中含有 20 微克/毫升氯霉素和 2.5 毫摩尔的氟酸碱。然后迅速开始显微镜检查。

将 20 倍放大倍率高数值孔径浸没物镜放置到位，将探测器针孔打开 2.5 通风单位，然后将 96 孔板转移到共聚焦激光扫描台中。接下来，选择同时具有活性供体和受体通道的高灵敏度砷化镓磷酸盐检测器。8 位深度的三倍帧平均和激发，用 405 纳米二极管激光器的 10% 进行激发。

为确保正确定量，请将两个通道的检测器增益设置为相同的值，并避免任何饱和像素。接下来，激活透射光并重新检查每个代表性视野，使用校准的自动载物台根据需要调整和重新保存位置。最后，将延时设置为 2 分钟，将持续时间设置为 2 小时，然后开始采集图像。

图像采集后，将数据集导入允许像素矩阵算术计算的软件中。首先单击菜单，使用相同的偏移量减去两个通道中的背景，然后转到图像处理并选择基线减去。然后选择每个通道并输入基准值。

校正施体通道的渗出，通道 1 进入具有预定校正因子的受体通道通道 2，为此创建一个新的通道通道 2 prime。单击菜单，然后选择 Image processing，然后选择通道 Arithmetics 并输入通道 2 的绝对值减去点 33 次。之后，通道 1 删除通道 2 并确保通过更正的 Accepter 通道的 bleed 保持为新的通道 2。

然后使用此处显示的作创建一个新通道，以确定相对品格系数。接下来，返回通道算术菜单并输入通道 2 除以通道 1 加通道 2，以便正确可视化品格通道。在 8 位图像中，创建第四个通道通道 4，它等于通道 3 的 255 倍。

转到图像属性菜单，选择通道 4，然后选择 Map color，然后选择 color table file，然后选择 jet，以更改通道颜色。接下来，将 3 x 3 中值滤波器应用于通道 3 和 4。这将通过进入图像处理菜单并选择平滑来减少图像中的噪点。

后跟中值滤波器，选择两个通道，并应用一个滤波器大小 3 x 3 x 1 来量化蜂窝信号。通过选择 surpass view 并单击 图标来检测通道 4 中的单元格。添加新曲面。

在表面窗口中定义检测算法参数并激活两个复选框。仅分割感兴趣的区域并处理整个图像。最后，接下来，通过编辑其尺寸来定义感兴趣区域。

选择声道 4 作为源声道，然后通过转到阈值菜单并选择 on background subtraction 来设置阈值。将直径设置为 10 微米，手动将最小强度阈值设置为零，将最大阈值设置为最大强度。按面积过滤结构，并将最小值设置为 187 平方微米。

然后完成表面检测。最后，提取通道 1 中供体荧光强度的平均值和通道 3 中的相对 fret 系数，以及它们在细胞实体中的标准差。为了显示该方法定量分析效应子转位到靶细胞的能力，使用供体荧光和相对 fret 系数研究了两种具有不同易位动力学的耶尔森菌菌株。

野生型感染细胞的荧光强度随时间推移而增加。正如预期的那样，荧光强度的最大斜率与感染时间呈正相关，表明可以根据以前的研究区分不同浓度的翻译 β 内酰胺酶。与野生型菌株相比，用耶尔森菌 YOPE 缺失突变体感染的细胞表现出更快速的荧光强度增加。

有趣的是，与感染 60 分钟相比，将感染扩大到 90 分钟并没有进一步加速供体荧光的上升 在尝试此过程时，重要的是要记住，CCR 四种化合物的加工在添加后立即开始。因此，及时开始图像采集非常重要。